稻瘟病菌T-DNA插入方法优化及其突变体分析

水稻WRKY转录因子家族研究进展刘梦佳;李海峰【摘要】综述了水稻WRKY转录因子响应逆境胁迫、调控发育和代谢等方面的生物学功能，介绍了水稻WRKY基因表达模式和作用机制研究的新进展，并在功能解析方面做了展望。

%In this paper, we reviewed the functions of rice WRKY transcription factors on response to stress,regulation in developmental and metabolic process. Furthermore, progresses in expression pattern and molecular mechanism were introduced,and a short prospect in function analysis was made.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2016(045)003【总页数】8页(P1-8)【关键词】水稻;WRKY转录因子;生物胁迫;非生物胁迫;胁迫应答【作者】刘梦佳;李海峰【作者单位】西北农林科技大学农学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌712100;西北农林科技大学农学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌712100; 新疆农业职业技术学院，新疆昌吉831100【正文语种】中文【中图分类】S685水稻(Oryza sativa)WRKY转录因子作为植物转录因子家族的一个重要成员，通过保守的WRKY结构域特异性结合到启动子区域的W-box，直接或间接调控抗病、干旱、冷热、高盐、氧化损伤、衰老等相关基因的表达，参与水稻的生物、非生物胁迫反应、激素信号转导途经、发育和代谢过程。

近年来，水稻WRKY基因功能研究特别是在抵抗逆境方面的研究取得了很大进展。

基于此，综述了水稻WRKY转录因子响应逆境胁迫、调控发育和代谢等方面的生物学功能，介绍了水稻WRKY基因表达模式和作用机制研究的进展，并在功能解析方面做了展望。

T-DNA插入突变体的鉴定时明辉同组者：薛敏学号：201000220069摘要 Ti质粒是上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。

所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。

将感兴趣的基因改造插入到T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化，得到含有突变的植株。

通过本实验，我们将学习如何用PCR的方法检测所得植株是否为T-DNA的插入突变体。

1.引言T-DNA作为一种实验常用的遗传转化方法，在插入突变过程中，插入到植物染色体上的位置是随机的。

如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。

所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。

农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA 插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。

在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。

本次实验中，采用液CTAB（或者TSP法）提取拟南芥植株的DNA，然后PCR将所获DNA扩增，在之后采用琼脂糖凝胶电泳技术，分离处长度不一的DNA带，以确定样品是否为T-DNA插入突变纯和体。

PCR（Polymerase ChainReaction），即聚合酶链式反应是体外核算扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。

（PCR基本原理如右图）DNA含有PO43-基团，在pH8.0 Buffer（本实验中为TAE）中带负电, 在电场中向正极移动。

自由电泳时，由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，各核酸分子难以分开；选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的；同样条件对Marker电泳；起到鉴定的作用。

拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定09生工吴超 200900140129一、实验原理T-DNA插入法是反向遗传学研究的重要手段。

T-DNA是农杆菌的一个大质粒，长度在25kb左右。

野生型农杆菌的T-DNA上带有激素合成基因，感染植物后会导致植物细胞快速增殖形成愈伤组织，失去分化能力。

所以一般实验使用改造后的农杆菌——T-DNA中导入了卡那霉素抗性基因和抗除草剂基因。

因此在农杆菌感染植物后可用除草剂来筛选转化子。

在转化子培养到F2代出现分离后，就需要对其基因型进行鉴定。

T-DNA插入突变体鉴定方法主要有两种：三引物法和双引物法。

在本实验中使用三引物法。

三引物法的原理如图1所示，即采用三引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。

野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25kb，过长的模板会阻止目的基因特异性扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为400-700bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到两种产物。

上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。

此法优点是可同时鉴定出纯和突变体并确证T-DNA的插入情况。

图1 T-DNA插入示意图CATB，即十六烷基三甲基溴化铵，是一种离子型表面活性剂。

能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。

并且CATB可在高离子强度的溶液里与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物进而形成沉淀，但不沉淀核酸。

本实验使用CATB抽提DNA。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外核酸扩增技术。

它具有特异性高、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至几万倍，使肉眼能直接观察和判断。

稻瘟菌基因的功能互补试验随着几种模式生物，尤其是人的全基因组序列的完成，生命科学的研究进入了一个功能基因组学的时代。

人们已经不仅仅关心一个基因组中包含有多少基因，更重要的是包含有多少有功能的基因，各个基因的功能分别是什么。

稻瘟病以其在农业生产中所处的地位以及稻瘟菌的生物学特性，已作为研究植物与病原真菌相互作用的模式系统(Valent, 1990)。

同时稻瘟菌具有易于人工培养，已有高效率的人工转化体系，在实验室可进行有性杂交，菌丝体为单倍体等特点，是分子遗传研究的良好材料。

稻瘟菌的基因组一共包括七条染色体，全基因组的大小为38Mb，包括大约10000个基因，平均3-4kb就有一个基因。

由于稻瘟菌的菌丝体为单倍体，每一个基因的突变都能引起其相应生理生化功能的变化，因此当在此基因组中引入相应基因的野生型基因时，就能从功能上互补此基因的突变，恢复野生型的功能，即稻瘟菌基因的功能互补试验。

基因的功能互补试验一般包括以下几个步骤：首先，将基因的全长克隆至细菌载体上；然后，在此载体中连入一个真核生物的选择标记，一般为潮霉素抗性基因和新霉素抗性基因等，或基因的全长重新克隆至连有真核生物的选择标记细菌载体上；第三，选用合适的限制性内切酶将质粒切为线形；第四，利用REMI转化体系转化突变体；第五，挑取抗性转化子进行功能互补鉴定；最后，PCR鉴定或基因组Southern杂交鉴定。

以上所用的实验步骤是基于REMI转化的，目前稻瘟菌的转化还有农杆菌介导转化等方法，利用这种方法也能进行基因的功能互补试验，其鉴定的方法与上面一致，只是在载体构建时是将基因全长和真核生物选择标记连入农杆菌的T-DNA中。

基于REMI转化和农杆菌介导转化的方法都是比较好的用于基因功能互补试验的方法，但是这两种方法都有一个共同的弱点，就是在这两种方法中，所引入的DNA都是以随机插入的方式整合入稻瘟菌的基因组中，这样，就有可能导致另一个功能基因的失活，从而产生新的性状或者不能完全互补原来的基因突变。

T-DNA插入突变具有受体材料范围广、操作简便、转化效率高、插入拷贝数少,转化子稳定等优点，是目前标记和获得植物病原真菌功能基因组的最有效的途径之一。

T-DNA插入突变也叫T-DNA标签(tagging)、(Agrobacterium tumefaciens 一mediated transformation，ATMT)，是根癌农杆菌介导的利用T-DNA作为插入突变原或分子标记，来分离或克隆因为插入而失活的基因并研究其基因功能的方法。

所谓的根癌农杆菌是指侵染植物根部的能诱发植物产生肿瘤的革兰氏阴性细菌，它们在自然状态下趋化性感染大多数双子叶植物的受伤部位，继而侵入根部细胞，最后在其中裂解，释放出Ti质粒，其上的T-DNA片段便会与植物细胞的核基因组整合，合成正常植株所没有的冠瘿碱(opines)，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转为癌细胞并诱导其产生冠瘿瘤。

1974年，比利时根特大学遗传学实验室的Zaenen观察到了农杆菌中的巨型质粒，并首次命名为Ti质粒。

后来发现这个约200kb的环状Ti质粒，主要包括毒性区(Vir区)、转移DNA 区(T-DNA区)、接合转移区和复制起始区这四个区域。

它能从致病植株转移到无病的植株中，使正常植株致病，T-DNA转移要穿越植物和细菌的细胞壁，再经过其原生质膜，最后穿透核膜。

主要包括4个过程：1)农杆菌首先识别植物敏感细胞再进行吸附和对信号的感受；2)Ti质粒上vir基因的激活；3) T-DNA切割以及T-DNA复合物的形成；4)新形成的T-DNA复合物从农杆菌转移到植物细胞中；5)整合T-DNA到植物的核基因并开始表达。

整个过程中，T-DNA自身并不编码任何与转移及整合有关的酶。

ATMT技术正是利用这一特性来携带外来基因进入植物细胞。

由于T-DNA两端各有一段25 bp的相对保守的同向重复序列，即T-DNA 边界序列。

将要转入植物细胞核的外源目的基因就是通过质粒构建的方法连接于这两段DNA区域之间。

专题7 孟德尔遗传定律2018高考真题（填空题30）（17分）水稻是我国最重要的粮食作物。

稻瘟病是由稻瘟病菌（Mp）侵染水稻引起的病害，严重危害我国粮食生产安全。

与使用农药相比，抗稻瘟病基因的利用是控制稻瘟病更加有效、安全和经济的措施。

（1）水稻对Mp表现出的抗病与感病为一对相对__________。

为判断某抗病水稻是否为纯合子，可通过观察自交子代____________来确定。

（2）现有甲（R1R1r2r2r3r3）、乙（r1r1R2R2r3r3）、丙（r1r1r2r2R3R3）三个水稻抗病品种，抗病（R）对感病（r）为显性，三对抗病基因位于不同染色体上。

根据基因的DNA序列设计特异性引物，用PCR方法可将样本中的R1、r1、R2、r2、R3、r3区分开。

这种方法可用于抗病品种选育中基因型的鉴定。

①甲品种与感病品种杂交后，对F2不同植株的R1、r1进行PCR扩增。

已知R1比r1片段短。

从扩增结果（下图）推测可抗病的植株有____________。

Array②为了在较短时间内将甲、乙、丙三个品种中的抗病基因整合，选育新的纯合抗病植株，下列育种步骤的正确排序是________。

a．甲×乙，得到F1b．用PCR方法选出R1R1R2R2R3R3植株c．R1r1R2r2r3r3植株×丙，得到不同基因型的子代d．用PCR方法选出R1r1R2r2R3r3植株，然后自交得到不同基因型的子代（3）研究发现，水稻的抗病表现不仅需要自身抗病基因（R1、R2、R3等）编码的蛋白，也需要Mp基因（A1、A2、A3等）编码的蛋白。

只有R蛋白与相应的A蛋白结合，抗病反应才能被激活。

若基因型为R1R1r2r2R3R3和r1r1R2R2R3R3的水稻，被基因型为a1a1A2A2a3a3的Mp侵染，推测这两种水稻的抗病性表现依次为___________。

（4）研究人员每年用Mp（A1A1a2a2a3a3）人工接种水稻品种甲（R1R1r2r2r3r3），几年后甲品种丧失了抗病性，检测水稻的基因未发现变异。

2022北京高三一模生物汇编基因突变及其他变异一、单选题1．（2022·北京延庆·一模）家族性高胆固醇血症是一种单基因遗传病（由A、a控制），该病在人群中的发病率没有明显的性别差异。

如图为某家族部分系谱图，其中已故男女的基因型及表现型无法获知，Ⅱ6不携带该病的致病基因。

下列分析错误．．的是（）A．该病属于常染色体上的显性遗传病B．Ⅱ5个体的基因型为AA或AaC．Ⅲ8和Ⅲ9再生的孩子一定患病D．Ⅱ4和Ⅲ10个体一定为杂合子2．（2022·北京延庆·一模）皱粒豌豆形成的分子机理如下图所示，相关分析正确的是（）A．皱粒豌豆的形成是因为DNA中插入了一段外来DNA序列引发了染色体变异B．r基因转录的mRNA可能提前出现终止密码子，形成无活性的SBEI蛋白C．RR的植株与rr的植株杂交，F1表现为圆粒是由于r基因无法表达D．该图可以说明基因通过控制蛋白质的结构直接控制生物的性状3．（2022·北京延庆·一模）将相关内容依次填入下图各框中，其中包含关系错误．．的选项是（）A．A B．B C．C D．D4．（2022·北京海淀·一模）栽培品种香蕉染色体组成为AAA（字母代表染色体组），易患黄叶病。

野生蕉染色体组成为BB，含有纯合的抗黄叶病基因。

经过杂交、筛选，获得染色体组成为AAB的抗黄叶病香蕉新品种。

下列有关叙述，不正确．．．的是（）A．栽培品种高度不育B．新品种含有三个染色体组C．新品种细胞中无同源染色体D．栽培品种减数分裂时联会紊乱5．（2022·北京丰台·一模）人类Y染色体末端的SRY基因能激活睾酮合成相关基因的表达睾酮在5α-还原酶的作用下转化为二氢睾酮，促使未分化的性腺发育成睾丸。

下列叙述不正确的是（）A．SRY基因所在染色体片段缺失，后代可能出现XY的女性B．SRY基因所在染色体片段移接，后代可能出现XX的男性C．5α-还原酶基因缺陷的XY个体，雄性生殖器官发育不良D．XYY男性染色体异常是母亲减数分裂产生异常卵细胞所致6．（2022·北京丰台·一模）研究发现肿瘤细胞中谷氨酰胺合成酶（GS）高表达，GS通过推动有丝分裂中期到后期的转化促进细胞增殖。

浙江大学硕士学位论文农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的稻瘟病菌转化及致病突变体的筛选姓名：刘朋娟申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：王政逸20050501本研究受国家自然科学基金项目３０２７０８６１资助单位代码：——究生学号：——硕士学位论文农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）介导的稻瘟病菌转化及致病突变体的筛选论文评阅人：．郄鏖压潘废垡蒸友基答辩委员会主席：．郑康乐答辩委员会成员：奎蕉夔筮回盐国昌三遮逸论文答辩日期：摘要稻瘟病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｓｅａ）可以引起水稻上的重要病害一稻瘟病。

了解彪ｇｒｉｓｅａ的致病分子机理不仅对防治稻瘟病具有重要的意义，而且它作为一个理想的研究体系对了解其他植物病原真菌与寄主的相互作用也有重要的意义。

分离和鉴定稻瘟病菌的致病相关基因，是达到这一目标的关键所在。

ＢＮＡ插入突变是标记、分离功能基因的有效途径之一，ＡＴＭＴ是丝状真菌遗传转化的一个的新的技术，具有转化效率离、成本低，操作方便和重复性好多重优点。

我们在构建了二个含有潮霉素Ｂ磷酸转移酶基因双元载体的基础上，成功地实现了农杆菌介导的稻瘟病菌转化，转化效率达每１０６个分生孢子＞３００个转化子，并得到了４０００多个转化子。

通过继代培养和ＰＣＲ检测，证明插入到稻瘟病菌基因组中的潮霉素抗性基因可稳定遗传。

Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析表明，大约有２／３转化子的Ｔ－ＤＮＡ插入是单拷贝的。

用大麦叶片离体接种的方法快速测定部分稻瘟病菌转化子的致病性，发现一个致病缺陷突变体：Ａ１－４１２。

该突变体不能侵入水稻叶片及擦伤的大麦或水稻叶片，说明Ａ１．４１２突变体在寄主组织中扩展进程被阻断。

进一步的表型分析，发现Ａ１，４１２突变体的产孢量显著下降，仅为野生菌株的７％，在疏水表面不能形成附着胞，部分分生孢子萌发的速度也略有延迟。

Ｓｏｕｔｈｃｍ杂交显示Ａ１－４１２基因组中Ｔ－ＤＮＡ插入是单拷贝的。

t-dna插入失活技术原理t-dna插入失活技术是基因工程技术中的一种重要方法，它是利用外源DNA片段t-DNA 插入到目标基因中导致目标基因的失活从而研究基因功能的技术。

本文将分别从t-DNA插入原理、插入失活原理和t-DNA插入失活技术操作方法等方面进行详细介绍。

一、t-DNA插入原理t-DNA插入原理是指将来自农杆菌的具有植物感染活性的农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）或农杆菌样细菌（Agrobacterium rhizogenes）分泌出来的Ti质粒或Ri质粒中的t-DNA随机插入到植物基因中，从而导致基因的失活或突变。

t-DNA（转移DNA）是一种由病原细菌通过T型四边形转移机制将其质粒中的特定DNA片段转移至植物细胞中的DNA。

t-DNA的大小和形状有很大的差异，但一般都包含左右边界（LB和RB）和一定的非编码序列。

通过LB和RB，t-DNA片段可以在植物基因组内随机插入到目标基因的某个位点中，从而会导致基因的失活或突变。

二、插入失活原理通常来说，t-DNA插入至基因区之下或之上才可能导致基因的失活或突变。

一旦t-DNA 片段成功插入至植物基因组的不适当位置上，将会导致基因的失活或突变。

在植物细胞中，t-DNA的LB和RB片段会被发现和被绑定到某些植物基因组中的端粒Repeat（telomeric repeat）上。

然后，t-DNA将和相邻的组织特异启动子、转录子或其他基因序列合并在一起，形成插入位点。

一旦t-DNA插入到目标基因中，其对目标基因的影响主要包括以下两种方式：第一是t-DNA插入至基因区之下，从而导致基因沉默或失活。

第二种是t-DNA插入至基因区之上，从而产生空穴（null alleles）或欠表达的突变形式。

三、t-DNA插入失活技术操作方法t-DNA插入失活技术是一种通过肆意插入t-DNA片段的方式探究植物基因功能的方法。

t-DNA的插入通常是随机发生的，因此需要通过重复筛选最终获得所需的突变体。

RMD水稻突变体信息及基因型鉴定1.背景介绍：突变体对于遗传学研究有着重要作用，随着拟南芥和水稻等物种全基因组测序的开展，人类积累了前所未有的基因序列信息，为了弄清这些基因序列的生物学信息，寻找该基因区段序列发生变异的突变体是阐释基因功能最直接最有效的方法。

植物在自然的环境条件下也会产生突变性状，早期普通正向遗传学研究往往通过寻找与某种生物学特性相关的突变体来发掘或定位某个特定基因。

为配合植物功能基因组研究高通量的策略，构建水稻等物种的大型突变体库已成为必然，借助水稻全基因组测序信息、通过反向遗传学的手段大规模地筛选突变体库，理论上可以获得基因组中任一基因的突变体，最终实现阐释基因功能的目的。

2.原理：2.1农杆菌介导的T-DNA 插入农杆菌是寄主范围非常广泛的土壤杆菌，它能通过伤口侵染植物导致冠瘿瘤和毛状根的发生。

1974从根癌农杆菌中分离出一种与肿瘤诱导相关的质粒，称为致瘤质粒（Tumor-inducing plasmid），简称Ti 质粒。

Ti 质粒上存在一段DNA，能够转移并整合到植物基因组中，称为Transferred DNA，简称T-DNA。

研究发现，T-DNA 两端存在非常保守的同向重复的25bp 序列，分别称为左边界（LB）和右边界（RB）。

T-DNA 的转移只与边界序列相关，尤其是RB，而与T-DNA区段的其它基因或序列无关。

我们将T-DNA 区段上的致瘤基因和其它无关序列去掉，利用其转移的特性，实现农杆菌介导的T-DNA 转入水稻愈伤，从而构建水稻突变体库。

大量研究表明，农杆菌T-DNA 整合到植物基因组中的位置是随机的，并且整合到植物基因组中的T-DNA 能稳定遗传。

由于插入到植物基因组中的T-DNA 区段序列已知，这样随机插入到植物基因组中的T-DNA类似于给植物基因“贴”了一个序列标签。

我们利用这个标签，通过各类PCR技术最终可以获取其插入的位点。

2.2 水稻Tos17 反转录转座子创造水稻突变体的另一种方法是利用植物的反转录转座子，它们是以DNA→RNA→DNA 的方式进行转座，在水稻上已发现大约40 种长未端重复的反转录转座子，它们是Tos1-Tos32，RIRE1-RIRE8，其中5 类被证明是有转座活性的，分别是Tos10、Tos17、Tos19、Tos25 和Tos27。

T-DNA插入突变体的鉴定时明辉同组者：薛敏学号：201000220069摘要 Ti质粒是上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。

所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。

将感兴趣的基因改造插入到T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化，得到含有突变的植株。

通过本实验，我们将学习如何用PCR的方法检测所得植株是否为T-DNA的插入突变体。

1.引言T-DNA作为一种实验常用的遗传转化方法，在插入突变过程中，插入到植物染色体上的位置是随机的。

如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。

所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。

农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。

在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。

本次实验中，采用液CTAB（或者TSP法）提取拟南芥植株的DNA，然后PCR将所获DNA 扩增，在之后采用琼脂糖凝胶电泳技术，分离处长度不一的DNA带，以确定样品是否为T-DNA 插入突变纯和体。

PCR（Polymerase Chain Reaction），即聚合酶链式反应是体外核算扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。

（PCR基本原理如右图）3-基团，在pH8.0 BufferDNA含有PO4（本实验中为TAE）中带负电, 在电场中向正极移动。

自由电泳时，由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，各核酸分子难以分开；选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的；同样条件对Marker电泳；起到鉴定的作用。