激光扫描共聚焦显微镜技术-0429

激光扫描共聚焦显微镜技术激光扫描共聚焦显微镜技术Laser Scanning Confocal Microscope——基础篇李治国细胞的内在⽣活显微镜的发展史没有显微镜就不可能有细胞学诞⽣。

1590年，荷兰眼镜制造商J和Z.Janssen⽗⼦制作了第⼀台复式显微镜。

1665年，英国⼈Robert Hook⾸次描述了植物细胞(⽊栓)，命名为cella。

1680年，荷兰⼈A.van Leeuwenhoek成为皇家学会会员，他⼀⽣中制作了200多台显微镜和400多个镜头，⽤设计较好的显微镜观察了许多动植物的活细胞与原⽣动物。

Made by A.van Leeuwenhoek (1632-1723).Magnification ranges at 50-275x.显微镜的最重要参数——分辨⼒显微镜物象是否清楚不仅决定于放⼤倍数，还与显微镜的分辨⼒（resolution）有关。

分辨率是指区分开两个质点间的最⼩距离各种显微镜的分辨能⼒光学显微镜（light microscopy）0.2µm电⼦显微镜 (Electro microscopy) 0.2nm扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope ) 0.2nm以下1932年，德国⼈M.Knoll和E.A.F.Ruska发明电镜，1940年，美、德制造出分辨⼒为0.2nm的商品电镜。

1981年，瑞⼠⼈G.Binnig和H.RoherI在IBM苏黎世实验中⼼（Zurich Research Center）发明了扫描隧道显微镜⽽与电镜发明者Ruska同获1986年度的诺贝尔物理学奖。

常⽤的光学显微镜（light microscopy)普通光学显微镜暗视野显微镜相差显微镜偏光显微镜微分⼲涉显微镜荧光显微镜激光共焦扫描显微镜普通光学显微镜原理普通光学显微镜原理图1. 构成：①照明系统②光学放⼤系统③机械装置2. 原理：经物镜形成倒⽴实像，经⽬镜放⼤成虚像。

激光扫描共聚焦显微镜原理及应用激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope）是一种高分辨率的显微镜技术。

它结合了光学和计算机技术，通过使用激光扫描技术将样品的逐点扫描成像，可以获取到非常清晰的三维图像。

激光扫描共聚焦显微镜的原理是基于共焦聚焦技术。

它使用一束激光光束照射在样品表面上，并收集激光光束的反射或荧光信号。

激光光束通过一个探测镜来聚焦在样品表面上的一个非常小的点上，该点称为焦点。

通过扫描样品，系统可以获取到完整的样品图像。

1.高分辨率：激光扫描共聚焦显微镜可以获得非常高的分辨率。

由于只有焦点附近的信息被收集，所以可以消除反射和散射带来的干扰，提高图像的清晰度和分辨率。

2.三维成像：激光扫描共聚焦显微镜可以进行多个焦面的扫描，从而获取到三维样品图像。

这使得可以观察样品的内部结构和深层次的信息。

3.高灵敏度：激光扫描共聚焦显微镜可以检测到样品的荧光信号。

这在生物医学领域中非常有用，可以用于观察细胞和组织中的荧光标记物。

4.实时观察：由于激光扫描共聚焦显微镜具有快速扫描和成像的能力，因此可以进行实时观察。

这对于研究动态过程和实时观察样品的变化非常有用。

在生物医学研究中，激光扫描共聚焦显微镜被广泛应用于观察和研究活细胞及组织的结构和功能。

它可以用于观察和研究细胞器的位置和运动、细胞的分裂过程、病理细胞的形态学变化等。

在材料科学研究中，激光扫描共聚焦显微镜可以用于观察和研究材料的结构和性质。

它可以帮助研究人员观察各种材料的微观结构、表面形貌以及材料中的缺陷和分子分布等。

在纳米技术研究中，激光扫描共聚焦显微镜可以用于观察和研究纳米材料的形态和结构。

它可以帮助研究人员观察纳米粒子的形状、大小和分布，研究纳米材料的组装过程和性质等。

总之，激光扫描共聚焦显微镜是一种非常强大并且在科学研究中得到广泛应用的显微镜技术。

它通过激光聚焦和扫描技术，可以获得高分辨率、三维成像和实时观察的样品图像，并且在生物医学研究、材料科学和纳米技术等领域有着重要的应用价值。

.b ž激光扫描共聚焦显微镜( LSCM) 是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。

它是在荧光ž显微镜成像基础上加装了激光扫描装置, 利用计算机进行图像处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像, 成为形态学﹑分子细胞生物学﹑神经科学﹑药理学﹑遗传学等领域新一代强有力的研究工具。

同时,激光扫描共聚焦显微镜也是活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具。

不仅可对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的“光学切片”; 进行单标记或双标记细胞及组织标本的荧光定性定量分析; 还可用于活细胞生理信号, 离子含量的实时动态分析监测, 粘附细胞的分选, 细胞激光显微外科和光陷阱技术等。

可以无损伤的观察和分析细胞的三维空间结构。

- www 生物秀-专心做生物w ww .b b i o o .c o mIntroductionžLSCM 是一种高科技显微镜ž荧光显微镜成像为基础，加装了激光扫描装置, 计算机进行图像处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。

ž无损伤的“光学切片”ž细胞三维立体机构ž实时动态分析监测激光扫描共聚焦显微镜( LSCM) 是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。

生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mž光学显微镜部分ž激光发射器ž扫描装置ž光检测器ž计算机系统( 包括数据采集, 处理, 转换, 应用软件)ž图像输出设备LSCM 的基本组成生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mLSCM 的原理激光光源：激光扫描束经照明针孔形成点光源, 普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源, 标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。

而LSCM 以激光为光源, 激光具有单色性强﹑方向性好﹑高亮度﹑相干性好等优点, 可以避免普通显微镜的缺点。

激光扫描共聚焦显微镜技术第一节激光扫描共聚焦显微镜技术原理2009-06-02 13:47光学显微镜作为细胞生物学的研究工具，可以分辨出小于其照明光源波长一半的细胞结构。

随着光学、视频、计算机等技术飞速发展而诞生的激光扫描共聚焦显微镜 (Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)，则使现代显微镜有能力研究和分析细胞在变化过程中的结构。

特别是对活细胞离子含量变化的定量检测、完整细胞的三维立体结构图像重建等方面，是传统的光学和电子显微镜所望尘莫及的。

Marvin Minsky于1957年提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，并获得了美国的专利。

Egger和Petran1967年成功的应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面。

1970年，牛津和阿姆斯特丹同时向科学界推荐了一种新型的扫描共聚焦显微镜。

1977年作为牛津集团成员的Sheppard和Wilson首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学。

1984年Bio-Rad公司推出了世界第一台共聚焦显微镜商品，型号为SOM-100，扫描方式为台阶式扫描。

1986年的MRC-500即改进为光束扫描，用作生物荧光显微镜的共聚焦系统，即后又推出了MRC-600、MRC-600uv、MRC-1000、MRC-1000uv。

1987年，White和Amos在英国《自然》杂志发表了“共聚焦显微镜时代的到来”一文，标志着LSCM已成为进行科学研究的重要工具。

随后Zeiss、Leica、Meridian 等多家公司相继开发出不同型号的共聚焦显微镜。

随着技术的不断发展和完善，产品的性能也不断改进和更新，应用的范围也越来越广泛。

一、基本原理传统的光学显微镜使用的实际上是场光源，由于光散射，在所观察的视野内，样品上的每一点都同时被照射并成像，入射光照射到整个细胞的一定厚度，位于焦平面外的反射光也可通过物镜而成像，使图像的信噪比降低，影响了图像的清晰度和分辨率。

激光共聚焦显微镜技术激光共聚焦显微镜的光源系统一般采用可调谐激光器，能够提供多种波长的激光，满足不同的样品标记物的激发要求。

扫描单元则通过透镜组和扫描镜将激光打成一个小点，并在样品上进行逐点扫描。

扫描镜的移动由电子信号控制，可实现高速、准确的扫描。

光学系统是激光共聚焦显微镜的核心部分，包括物镜、荧光标记物的激发和发射光路。

物镜是显微镜的一个重要组成部分，其数值孔径决定了显微镜的分辨率。

常用的物镜有油浸、水浸和干物镜等，不同物镜适用于不同的样品和实验需求。

探测系统是激光共聚焦显微镜的另一个关键部分。

它包括光束分束器和探测器。

光束分束器分离激发和发射光路，并通过滤光片选择特定波长的荧光信号进入探测器。

探测器可以是光电二极管（photodiode）、光电倍增管（photomultiplier tube）等，用于检测传回的荧光信号并转化为电信号。

图像处理系统用于将探测器输出的电信号转化为图像。

图像处理软件能够实现图像的获取、显示、处理和分析等功能。

通过图像处理，可以实现信号增强、去噪、三维重建和数据分析等操作，提高对样品结构和荧光信号的分析能力。

在实际应用中，激光共聚焦显微镜常用于观察活细胞、分析蛋白质、研究细胞活动以及荧光染料标记的细胞成像。

其高空间分辨率和荧光染料的特异性使其成为了研究细胞结构和功能的重要工具。

例如，通过将细胞核染色剂与蛋白质标记物共同应用于活细胞，可以实时观察细胞核在不同生理过程中的变化，并通过图像处理进行定量分析。

此外，激光共聚焦显微镜还能够进行三维成像，使研究人员能够观察细胞和组织的内部结构。

激光共聚焦显微镜技术的革新和进步不断推动着生物医学研究的突破。

随着技术的不断改进，激光共聚焦显微镜具有更高的空间分辨率、更宽的波长覆盖和更快的成像速度。

随着成像技术的发展，激光共聚焦显微镜在生命科学研究中的应用将会越来越广泛。

激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Con- focal Microscope，LSCM）是20世纪80年代发展起来的一种新型高精度显微镜。

它在普通荧光显微镜的基础上加装激光扫描装置，使用可激发的荧光探针，采用敏感的光电倍增管作为检测器，利用计算机控制扫描反射镜并进行图像采集、处理和分析[1]。

激光扫描共聚焦显微技术不仅可用于观察各种固定的细胞和组织，还可对活细胞的形态、结构和离子的变化进行实时动态观察和测定[2]。

目前，这种技术已用于细胞形态定位、三维结构重建、细胞内离子动态变化过程等研究，并与定量荧光测定、定量图像分析等实用研究手段和技术相结合，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域得到广泛应用[3]。

激光扫描共聚焦显微镜(confocal laser scanning mi-croscopy,CLSM)是一种新型高精度的激光源加共聚焦显微镜,是利用激光作为光源,在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置,并利用计算机对所观察分析对象进行数字图像处理的一套观察和分析系统其最大特点是对标本进行无损伤性的实时观察分析, 得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像,以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号以及细胞形态的变化,对生物标本进行定性、定量、定时和定位研究,具有极大的优越性[1]。

主要构件一个完整的CLSM系统由几个主要的硬件和一些成像分析软件组成。

硬件包括表面荧光显微镜、激光光源及冷却系统、定位扫描装置、分辨系统、计算机控制系统、显示器和图像输出打印设备,软件由三维图像分析系统和三维图像文件管理系统构成[2]3主要功能3·1定性定量定位荧光分析CLSM可对单、双或三色标记的细胞及组织标本的荧光进行定性定量定位分析,还可测定膜电位和配体结合等生化反应程度。

此外,还适用于高灵敏度的快速免疫荧光测定,可以准确检测抗原表达、荧光原位杂交斑点及细胞结合和杀伤的形态学特性并作定量分析,以揭示诸如肿瘤相关抗原表达的准确定位及定量信息[6]。