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总蛋白提取试剂盒说明书

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总蛋白提取试剂盒 (Total Protein Extraction Kit)

P1250: 蛋白抽提试剂盒-I (实体组织和细胞蛋白抽提, 100 extractions)

描述: 从组织细胞中提取总蛋白是Western Blot关键步骤。实体软组织如脑脊髓富含磷脂, 神经血管含大量结缔组织, 而脂肪则有大量油脂, 常规方法难以有效从这些组织提取蛋白。本试剂盒为组织或培养细胞总蛋白提取提供完整处理方案。用裂解-结合缓冲液匀浆裂解实体组织, 或直接用裂解-结合缓冲液重悬培养细胞, 然后加入抽提试剂去除非蛋白成份, 离心、 干燥后即可得到总蛋白。蛋白沉淀溶解后用常规方法进行蛋白定量。提取过程可在30-60分钟内完成, 可在1.5ml离心管微量提取也可大规模制备, 极为简便高效。通常一次提取10-100mg组织所取得总蛋白可进行几十到上百次分析如蛋白质电泳、 Western Blot、 免疫共沉淀。

组成 1. 裂解-结合缓冲液 100 ml 2. 抽提试剂 100 ml

每毫升裂解缓冲液和抽提试剂可提取10-100mg组织或1  107细胞。试剂盒裂解缓冲液是过量。

适用 多种实体软组织(> 1 mg), 如脑、 脊髓、 神经结或纤维、 脂肪、 肝脏、 消化道组织、 肾脏、

心脏、 肌肉、 血管、 结缔组织等, 以及多种原代细胞和永生化细胞系。

保留: 室温或4ºC保留2年

固体组织蛋白提取

1. 每10-100mg固体组织剪碎后加入0.5-1 ml裂解液, 放入玻璃匀浆器内上下手动匀浆15次; 或用高速机械匀浆器12,000 rpm 破碎组织。注意: 初始组织量应在10-100mg范围。肝肾组织蛋白含量高, 提取时应加较少许组织, 不然形成蛋白膜厚、 致密且难溶。少许小未破碎组织不影响后续抽提。

2. 仅取0.5ml组织匀浆液转移到1.5ml离心管, 弃去剩下组织匀浆液。每0.5ml组织匀浆液加入2倍体积(1 ml)抽提试剂充足混匀。室温或4ºC静置10分钟, 偶然晃动。注意: (1)如组织量<10mg, 在下一步离心时形成蛋白膜易碎, 静置30min有助蛋白膜形成。(2)提取脂肪组织时应4ºC静置40min以上以充足去除油脂。(3) 0.5ml组织匀浆液取得蛋白足以进行几十次Western Blot。确保每0.5ml组织匀浆液加入2倍体积(1 ml)抽提试剂是成功关键。

3. 10,000g 4ºC离心10分钟, 溶液分为上下两相, 两相中间为蛋白膜。吸除上层液体; 随即用吸头或针头轻轻拨开蛋白膜, 吸除下层液体。蛋白膜将附着于离心管壁。注意: (1)离心速度过高将使蛋白膜过于坚固, 难以溶解。(2)假如不能分相, 可再加入50l蒸馏水混匀离心。 (3)假如初始组织量较少(<10mg), 离心后难以得到完整蛋白膜, 此时可吸去上下层液体, 加入1ml纯乙醇混匀, 10,000g 4ºC离心3分钟。弃全部液体, 蛋白沉淀在管底。

4. 敞开管口, 室温10分钟空气干燥沉淀。

5. 每100mg组织所得到蛋白加 200-1000l用户自备缓冲液, 95ºC煮10分钟。室温放置20~60分钟溶解沉淀。参见后面说明。

培养细胞蛋白提取

参见固体组织蛋白提取程序中斜体字注解

1. 消化洗涤并800 g离心搜集细胞。每5-10 x 106细胞加入0.5 ml裂解液, 振荡重悬, 4ºC净置2分钟。

2. 按百分比每0.5 ml裂解液加入1 ml抽提试剂, 振荡混匀。4ºC静置10min。

3. 10,000g 4ºC离心10分钟, 溶液分为两相, 两相中间为蛋白膜。小心吸除上层相和大部分下层相, 保留两相中间蛋白絮状物。假如不能分相, 可再加入50l蒸馏水混匀离心。

4. 加入1 ml纯乙醇洗涤沉淀。10,000g 4ºC离心3分钟, 蛋白沉淀在管底。

5. 去除管中全部液体, 敞开管口, 室温空气干燥沉淀。

6. 每1 x 106细胞可加入 50-200 l (或适量)蛋白溶解缓冲液, 95ºC煮5-10分钟, 室温放置20-60 分钟溶解沉淀。离心除去不溶物。

说明

1. 未溶解蛋白沉淀不含盐、 去垢剂、 和还原剂成份。干燥蛋白沉淀可4ºC或－20ºC长久保留。

2. 蛋白沉淀溶解步骤: (1)溶解于去离子水或用户自备缓冲液, 95ºC煮10分钟。室温放置30~60分钟或4ºC溶解5小时以上至过夜。1rpm离心5 min去除任何不溶性沉淀。没有去垢剂时沉淀溶解缓慢且一些膜/疏水蛋白不能完全溶解。(2)有效溶解推荐用此法, 用2~5% SDS水溶液、 或含5%SDS自备缓冲液, 或含2%SDS标准SDS-PAGE凝胶上样缓冲液, 95ºC 10分钟。沉淀量少会很快溶解。如沉淀很多或过分干燥, 煮沸后4ºC溶解5小时以上或过夜, 可溶性蛋白应该溶解并释放到溶液中。4ºC溶解过夜不溶物关键是不溶性成份, 通常不含对试验有用可检测蛋白。1rpm离心5 min去除任何不溶性沉淀。但对于绝大多数Western Blot目, 根据上述溶解过程可不加蛋白酶抑制剂, 而蛋白不会有显著降解。但用户仍然能够加入蛋白酶抑制剂。注意染色体DNA可与蛋白质一起被抽提出来, 溶解时形成粘稠物。含有大量粘稠DNA样品在进行电泳时易造成条带变形。95ºC热变性、 振荡、 注射针头反复抽吸有利于根本打断DNA。

3. 蛋白沉淀溶解体积。根据每mg组织2~5l百分比决定最终溶解体积, 但需要依据组织类型和试验目改变。过小溶解体积将使沉淀难以快速有效溶解。样品中蛋白浓度也可用每单位体积(ml)内正确组织初始重量(mg)或细胞数量来表示, 通常这种表示方法与蛋白定量结果有很好平行性。

4. 蛋白定量。依据上述溶解方法溶解, 不含染料, 稀释后定量。注意使SDS浓度稀释到不影响蛋白定量水平, 或选择不受SDS影响测定方法。BCA法<5% SDS浓度, Bradford法<0.125% SDS浓度。 5. 蛋白样品与2-5标准SDS-PAGE Loading Buffer 混合即可直接上样电泳。

6. 按百分比可进行大规模组织(～1g)蛋白提取。

7. 提取试剂有刺激性, 一旦接触立刻用水清洗。

8. 试剂盒提供裂解-结合缓冲液是过量。

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细胞总蛋白提取实验报告

细胞总蛋白提取实验报告

一、实验目的

1. 掌握细胞总蛋白提取的基本原理和方法；

2. 熟悉实验操作流程，提高实验技能；

3. 为后续的蛋白质分析、鉴定等实验提供优质蛋白样品。

二、实验原理

细胞总蛋白提取是指从细胞中提取出全部蛋白质的过程。实验中，通过细胞裂解、离心、沉淀等步骤，将细胞内的蛋白质分离出来。蛋白质提取过程中，常用的裂解液有RIPA、SDS-PAGE样品缓冲液等。本实验采用RIPA裂解液进行细胞总蛋白提取。

三、实验材料

1. 细胞：实验所用的细胞种类及数量；

2. 裂解液：RIPA裂解液；

3. PBS缓冲液；

4. 离心机；

5. 离心管；

6. 移液器；

7. 冰箱；

8. 细胞培养皿；

9. 细胞刮刀；

10. 蛋白质浓度测定试剂盒；

11. 蛋白质定量标准品。

四、实验步骤

1. 准备工作：将细胞培养皿置于培养箱中，待细胞生长至适宜密度后，取出细胞培养皿。

2. 细胞裂解： （1）弃去上层清液，用PBS缓冲液清洗细胞培养皿两遍；

（2）将多余的PBS缓冲液吸干净，加入RIPA裂解液；

（3）将细胞培养皿平放在碎冰上，静置5min；

（4）用细胞刮刀来回刮培养皿底部，直至培养皿底部干净；

（5）吸取培养皿内的液体，转移到EP离心管内；

（6）在碎冰上静置15min。

3. 离心分离：

（1）将EP离心管放入低温超高速离心机内；

（2）离心速度和时间根据细胞裂解程度和蛋白质特性确定；

（3）取出离心管，将上清液转移到新的EP管中。

4. 蛋白质定量：

（1）按照蛋白质浓度测定试剂盒说明书，进行蛋白质定量实验；

（2）将样品与标准品进行对比，计算样品蛋白质浓度。

五、实验结果与分析

1. 通过细胞裂解、离心等步骤，成功提取出细胞总蛋白；

2. 蛋白质定量结果显示，样品蛋白质浓度为X mg/mL。

六、实验总结

1. 本实验成功提取了细胞总蛋白，为后续蛋白质分析、鉴定等实验提供了优质蛋白样品；

2. 在实验过程中，注意操作规范，确保实验结果的准确性；

考马斯亮蓝法测蛋白含量测定试剂盒说明书--微量法 100T 96S

考马斯亮蓝法测蛋白含量测定试剂盒说明书--微量法 100T 96S

考马斯亮蓝法测蛋白含量测定试剂盒说明书

微量法 100T/96S

注 意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

样品可溶性蛋白质含量常常用于酶活性计算。此外，可溶性蛋白质含量也用于食品等质量分析。

测定原理：

在酸性溶液中，考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合形成蓝色复合物；该复合物在620nm处有最大吸收峰，

其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。该方法灵敏度高，适合微量蛋白质分析。

自备仪器和用品：

离心机、酶标仪、96孔板、移液器和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体11 mL×1瓶，4℃保存。

样品中可溶性蛋白质提取：

1. 液体样品：澄清液体样品可以直接测定。

2. 组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：20的比例（建议称取约0.05 g组织，加入1mL

提取液（自备，根据需要选用酶提取缓冲液或者蒸馏水或者生理盐水））

冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即待测液。（动物样品常常需要稀释）

3. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞

加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后

8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

测定操作：

1. 酶标仪预热30 min。 2. 在96孔板中加入：

试剂（μL） 测定管 空白管

样本 100

蒸馏水 100

试剂一 100 100

混匀后，测定波长620 nm吸光值，△A=A测定-A空白。

注意：空白管只需要测定一次。

计算公式：

标准曲线：y = 7.1265x - 0.0007 R2 = 0.9997 x: 蛋白标准品浓度(mg/mL)

y: 吸光值差值

1.按液体样本体积计算：

Cpr（mg/mL）=(△A+0.0007)÷7.1265

=0.1403×(△A+0.0007)

细菌外膜蛋白提取方法

细菌外膜蛋白提取方法

- 1 -细菌外膜蛋白提取试剂盒

产品组成：

产品组成 BB-31512-1 BB-31512-2 组份编号

规格 50T 100T

试剂A：细菌外膜蛋白提取液A 25ml 50ml 31512A

试剂B：细菌外膜蛋白提取液B 250ul 500ul 31512B

试剂C：膜蛋白溶解液 10ml 20ml 31512C

试剂D：蛋白酶抑制剂混合物 100 ul 200 ul 31512D

产品简介：

贝博细菌外膜蛋白提取试剂盒可以从各种革兰氏阴性菌菌体中提取外膜蛋白。提取过程

简单方便。该试剂盒含有蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高质量

的蛋白提供了保证。该试剂盒提取的蛋白具有天然活性，可用于各种下游实验。

使用方法：

1、 每500ul提取液A中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物，充分混匀后置冰上备用。

2、 将菌液在低温下10000g离心5分钟，收集菌体，用PBS洗菌体2次。

3、 按每20-50mg湿重菌体样本加入500ul提取液A（大约菌体和提取液体积比1:2-1:3，

完全淹没菌体即可），吹打混匀，2-8℃振荡1小时（或者冰上放置1-2小时，中间每隔

10分钟涡旋振荡混匀）。

4、 将菌液在2-8℃下12000g力离心5分钟，取上清。

5、 在上清中加入5ul提取液B，充分混匀。

6、 在37℃水浴10分钟。

7、 在37℃ 1000g力离心2分钟。

8、 此时液体分为2层，小心移除上层溶液，留管底部下层大约50ul液体。

9、 用膜蛋白溶解液溶解该溶液，即得细菌外膜蛋白样品。该样品可以用Bradford或

BCA方法进行定量，调整相应的浓度用于下游实验。

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英文特生物技术（北京）有限公司-植物质膜蛋白提取试剂盒说明书

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Invent Biotechnologies, Inc.

1

MinuteTM 植物质膜蛋白提取试剂盒

目录号：SM-005-P

描述：

植物膜蛋白占植物细胞总蛋白的很小一部分，但是在植物生理学中起着非常重要的作用。传统的植物膜组分分

离纯化方法是蔗糖密度梯度离心法和双液相法。这些方法虽然比较有效，但是需要超高速离心和大量的起始原

材料，操作过十分繁琐和费时。为了克服植物膜组分提取中的缺点，我们特别开发了此款植物膜组分提取试剂

盒。植物组织首先通过缓冲液A中致敏，匀浆，然后通过一个特殊的离心管柱，在此过程中匀浆的组织通过柱

子特有的Z字形通路后细胞膜被切割成大小相等的碎片，后续无需超高速离心，通过差速离心法和密度梯度离

心法将天然的质膜组分从未破裂的细胞，细胞核，细胞浆和细胞器的混合物中分离出来。在每次实验中仅需使

用相同量的起始材料，离心力和离心时间，即可高度富集膜组分，并保证一致性良好。整个操作过程大约1小

时可以完成。

应用：

试剂盒用于快速从植物组织中分离天然膜组分，可应用于SDS-PAGE，immunoblottings，ELISA，IP，膜蛋白质

结构分析，2-D，酶活性测定及其他应用。

试剂盒组份（50次）：

1. 25ml Buffer A

2. 10ml Buffer B

3. 50个离心管柱

4. 50个收集管

5. 2根塑料研磨棒

6. 组织分离粉

储存：

Buffer A和Buffer B 需在-20℃储存

所需附加材料

1XPBS

涡旋震荡仪

台式离心机

Invent Biotechnologies, Inc.

2 ************

重要产品信息

1. 仔细阅读整个操作说明。将缓冲液A和缓冲液B完全解冻后摇匀，放置于冰上。将离心管柱和接收管套管

放置于冰上预冷。

2. 离心机请调整成RCF/Xg模式，按照离心力设置离心机，所有离心步骤都需要在4℃室温下或者低温离心机

中进行。