蓝莓组织培养中污染褐变玻璃化的防止措施

褐化原因及防止措施褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡的现象。

在组织培养中，褐变是普遍存在的，这种现象与菌类污染和玻璃化并称为植物组织培养的三大难题。

而控制褐变比控制污染和玻璃化更加困难。

因此，能否有效地控制褐变是某些植物能否组培成功的关键。

(一)褐变的原因影响褐变的因素极其复杂，随着植物种类、基因型、外植体的部位及生理状况等的不同，褐变的程度也有所不同。

1.与基因型有关不同植物与品种之间褐变现象是不同的，有人把此归结为基因型的不同。

一般来说植物材料中单宁类和多种羟酚类化合物的含量高，易引起外植体材料的严重褐化。

多数木本植物比草本植物易引起褐化，多年生草本植物比一年生草本植物易引起褐化。

2.与取样外植体的年龄有关通常幼龄部位产生褐化较轻，随着组织的老龄化含醌类物质增多而褐化加重。

因此，在外植体接种时常需要剥去鳞片和大叶片，尤其是以切取幼嫩的芽尖或切取顶芽分生组织(或带少量叶原基)接种更为理想。

3.与外植体取材时间有关一般在春夏季，尤其是春季采取生长旺盛的外植体产生褐化较轻，已木栓化或木质化的枝条和处于休眠状态的芽作为外植体时褐化严重。

即分生部位接种后形成醌类物质少，而分化的部位则形成醌类物质较多。

4.与培养基有关过高的无机盐浓度会引起棕榈科植物外植体酚的氧化，低盐培养基，尤其是Mn2+和 Cu2+离子浓度较低时，外植体的褐化程度较轻。

例如油棕用MS无机盐培养容易引起外植体的褐变，而用降低了无机盐浓度的改良MS培养基时则可减轻褐变，而且获得愈伤组织和胚状体。

植物生长调节物质使用不当时，材料也容易褐变，细胞分裂素BA有刺激多酚氧化酶活性提高的作用，这一现象在甘蔗的组织培养中十分明显。

培养基的PH值较低时常有利于减轻外植体的褐化。

植物组织培养中的褐变现象及其防止措施摘要：细胞受损后，由于细胞区隔作用被破坏，毒性酚类或其氧化物醌类物质毒害细胞，导致组织褐变，植物组织培养过程中培养低效或失败。

目前认为组织培养中褐变程度主要受外植体材料的基因型、生理状态、种类、大小、预处理、培养条件、培养基及培养方式的影响。

在目前的研究中控制褐变的有效方法主要有低温培养、暗培养、勤转种、添加抗氧化剂、增效剂或吸附剂于培养基中等。

关键词:植物;组织培养;褐变;防治方法褐变是植物组织培养中一种普遍存在的现象，是由于组织中多酚氧化酶被激活，使细胞酚类物质被氧化而产生棕褐色醌类物质，这种褐变现象又被称为酚污染。

多酚类物质及其氧化物醌类物质会抑制其它酶的活性，从而毒害整个外植体，严重影响外植体的脱分化、再分化和生长。

褐变这种现象与菌类污染和过度含水化(即玻璃化)并称植物组织培养的3 大难题。

目前褐变已成为植物组织培养发展的一大障碍[1]。

1 褐变现象的原因1.1 非酶促褐变非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡，即坏死形成的褐变现象，并不涉及酚类物质的产生。

诸多不利条件都可以造成细胞的程序化死亡，但这种褐变若采取适当措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生。

1.2 酶促褐变多数认为，植物组织培养中的褐化现象主要是由酶促褐变引起的，即由多酚氧化酶( P PO ，Polyphenol Oxidase) 作用于天然底物酚类物质而引起的。

在正常条件下,细胞中的酚和醌之间保持一种动态平衡,醌类物质水平较低;而酚氧化酶及其底物分布在正常组织的不同部位，酚类物质分布在细胞的液泡内，酶则分布在各种质体或细胞质内，这种区域性分布致使底物与酶被质膜分隔开来；但当外植体或培养材料处于机械损伤等逆境，或细胞受伤或衰老时，细胞膜结构或细胞中物质区域化分布的破坏会导致酚氧化酶释放或合成，如果此时在合适的pH 和温度等条件下，酚氧化酶、酚类（底物）和氧发生酶促氧化反应，形成有毒的棕褐色醌类物质,从而使组织发生褐变。

植物组织培养中褐变机理和防治措施摘要：褐变现象是指组织培养诱导脱分化或再分化的过程中，外植体组织从表面向培养基释放褐色物质而使得培养基逐渐变成褐色，外植体随之褐变死亡的现象，褐变现象又称酚污染，在植物组织培养过程中经常出现。

对诱导外植体的脱分化和培再分化过程的影响非常大，甚至是影响某些植物组织培养成功与否的关键。

褐变主要发生在外植体、愈伤组织的继代、悬浮细胞培养、原生质体的分离与培养等。

褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。

本文对褐变的影响因素和对策进行了研究。

关键词：组织培养，褐变，影响因素1. 影响褐变的因素因子是复杂的，随植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等的不同，褐变的程度也有所不同。

1.1褐变类型及基因型物种及其基因型对褐化的影响。

植物组织培养过程中外植体的褐化主要由多酚氧化酶作用于酚类物质而引起的。

不同植物品种、同种植物的不同类型因为外植体材料的基因型不同，在组织培养中褐化发生的频率和程度都存在着较大的差异[4]。

由于酚类的糖苷化合物是木质素、单宁和色素的合成前体，木本植物、单宁含量或色素含量高的植物酚类物质含量也很高，木质素、单宁或色素形成多，其组织培养就容易发生褐变。

因此，组织培养过程中，木本植物一般比草本植物易发生褐变。

目前报道发生褐变的植物中多数是木本植物[5]。

在木本植物中，核桃、板栗由于单宁含量很高，进行组织培养难度很大，不仅在接种后的初代培养期容易发生褐变，而且在形成愈伤组织以后也会因为褐变而引起死亡。

红豆杉愈伤组织的诱导及继代培养过程中，常常发生培养细胞褐变现象，轻者影响细胞生长和繁殖，重者导致细胞死亡。

豆科植物和芸苔属植物原生质体培养中容易褐化也是一个普遍的问题，橡胶的花药培养中，海垦2号花药的褐变较少，因而愈伤组织的诱导容易；而有些品系花药容易褐变，因而愈伤组织的诱导困难。

在组织培养中，有些品种、品系难以成功，而有些则容易成功。

植物组培中玻璃化现象及其预防措施在植物组织培养过程中，叶片和嫩梢呈透明或半透明水浸状的培养物称为玻璃化苗，它是组培苗的一种生理失调症状。

玻璃化大大降低了试管苗有效增殖系数，严重影响了试管苗质量，造成人、财、物的极大浪费，必须对玻璃化加以控制。

1、玻璃化苗的特点与发生原因（1）玻璃化苗的特点在形态解剖与生理上，玻璃化苗有如下特点：①玻璃化苗植株矮小肿胀、失绿、叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎②叶表面缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，仅有海绵组织而无栅栏组织③体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低④吸收营养与光合功能不全，分化能力大大降低，苗生长缓慢、繁殖系数大为降低，甚至死亡⑤生根困难，移栽成活率低（2）发生原因玻璃化苗是在芽分化启动后的生长过程，碳、氮代谢和水分发生生理性异常所引起。

其实质是植物细胞分裂与体积增大的速度超过了干物质生产和积累的速度，植物只好用水分来充涨体积，从而表现玻璃化。

不同作物种类或品种，玻璃化的发生频率各不相同，在情人草中较少见，香石竹中则较普遍。

2、影响玻璃化苗产生的因素（1）生长调节剂细胞分裂素和生长素的浓度及其比例均影响玻璃化苗产生。

高浓度的细胞分裂素有利于促进芽的分化，也会使玻璃化苗的发生比例提高。

不同的植物发生玻璃化的生长调节剂水平不相同，如香石竹的部分品种在BA 0.5mg/L时就有玻璃化发生。

同一植物的不同阶段对细胞分裂素的要求也不同，在某些特定阶段可忍受较高的浓度，而在其他阶段的培养中，却只需要较低的浓度，如非洲菊只有在BA 2-10mg/L时才能诱导幼花托脱分化形成愈伤组织，并在愈伤组织上诱导不定芽;而在丛生芽增殖过程中，BA 1 mg/L即可满足要求。

细胞分裂素与生长素的比例失调，细胞分裂素的含量显著高于两者之间的适宜比例，使试管苗正常生长所需的生长调节剂水平失衡，也会导致玻璃化的发生。

（2）温度随着培养温度的升高，苗的生长速度明显加快，但高温达到一定限度后，会对正常的生长和代谢产生不良影响，促进玻璃化的产生。

植物组织培养中常见问题与对策作者：祁建国来源：《现代园艺》2012年第16期摘要：从植物组织培养中常见的污染、褐化、玻璃化现象等问题入手，分析了其形成的原因，并结合自身工作经验提出针对性的解决策略，对植物的组织快繁和工厂化育苗具有一定的参考意义和借鉴价值。

关键词：组织培养；污染；褐化；黄化1 污染问题及对策1.1 污染原因分析控制污染是组培过程中的首要技术。

造成污染的原因很多，如外植体的种类、取材的季节、时间、预处理方法、消毒药剂的种类、浓度、消毒时间以及消毒方法、培养基和器皿灭菌、操作人员、工作环境的要求、超净工作台的工作质量等都与污染密切相关。

一般来说，组培污染源分为3大类：材料带菌、接种污染、培养过程感染。

1.2 对策选择合理的外植体种类、取材的季节、时间、初代接种选取大小适宜的外植体。

在组培中应选取带菌较少或不带菌体的材料作为外植体。

对母株预处理，改善植株栽培环境，对母株喷布杀菌剂或抗生素。

改变灭菌方法，使用真空减压灭菌、多次消毒灭菌、混合消毒液、灼烧等。

在培养基中加入其它抑菌剂。

切分潜在的带菌材料时，要保证所用的接种工具已经过彻底的消毒；继代培养时确保污染的材料应给予丢弃。

针对接种污染，要做到紫外灯接种室消毒，清洗超净工作台；接种工具、材料不要与酒精灯、超净工作台铁网面、台面接触；接种人员接种时用酒精棉擦手或用浓度为75 %的酒精喷洒双手，接种时应穿上无菌的白大衣，戴上帽子和口罩；无菌室要注重平时除湿和熏蒸消毒工作。

培养过程中要定期对培养室进行消毒处理，及时清除污染材料，污染的材料及仪器必须经过药液消毒后方可使用。

2 褐化问题及控制措施2.1 褐化概念及原因分析褐化是指在植物组织培养过程中，外植体在诱导脱分化或再分化时，自身组织由其表面向培养基释放褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。

褐化一般分为2种：由于细胞受胁迫或其它不利条件影响所造成的细胞死亡而形成的褐化现象；由于酚类物质被多酚氧化酶氧化所引起的褐化。

植物组培过程中培养物的玻璃化及其防治方法
当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状，苗体趋于透明，其茎、叶表面无蜡质，这种现象通常称为玻璃化。

玻璃化为组培苗的生理失调症，它的出现会使组培苗生长缓慢、繁殖系数有所下降，玻璃化的嫩茎不宜诱导生根。

1 导致玻璃化的主要因素：
① 材料差异，在不同的种类、品种间，组培苗的玻璃化程度有所差异。

② 激素水平过高,若细胞分裂素浓度过高或细胞分裂素与生长素相对含量高，易引起玻璃化现象。

③ 培养基水势，培养基中离子种类,比例不适。

④ 环境温度、光照强度和通气性。

温度过低或过高,光照时间强度不足及培养容器中空气湿度过高，透气性较差所造成的通气不良,易造成组培苗含水量高,从而发生玻璃化现象。

⑤ 琼脂浓度降低、有杂质等。

2 常用的防治措施有
① 增加光照强度和光照时数。

② 降低细胞分裂素含量。

在培养基中添加少量聚
乙烯醇、脱落酸等物质，能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生
③ 增大培养基中琼脂的含量，以降低培养基的水势
④ 降低NH4+浓度，减少培养基中含氮化合物的用量
⑤ 增加容器通风，最好进行 CO2施肥，这对减轻组培苗玻璃化的现象有明显的作用；
降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻组培苗玻璃化的现象发生；。

浅析植物组织培养常见问题与预防措施摘要：在植物培养过程中，是比较容易出现玻璃化、褐变、污染等不良情况的，这会增大培养难度，同时还可能难以达到理想的培养目的。

根据笔者多年的研究实践，对三者发生的原因以及预防措施有一定的认识，整理出来与同行共享。

关键词：污染玻璃化褐变植物组织培养是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用适宜的培养基，对植物离体器官、组织、细胞、原生质体进行培养，使其分化、生长发育成完整植株的过程。

从遗传学基础，植物细胞具有全能性与多能性，包含该物种基因组即全部遗传信息，因而具有分化为完整个体或特定类群组织或器官的能力，以及植物体的再生能力，即对受损结构自我修复或替代的能力。

在植物细胞全能性理论的指导下，经历一个世纪的发展，植物组织培养己成为一门重要的科学，它以植物学、植物生理学、植物遗传学为理论基础，研究植物离体条件下的形态建成、营养生理，体细胞遗传等规律。

这一培养方式改变了植物以往的发育过程，将植物放入容器中，实行无菌培养，能够避免其他微生物、病虫等危害，另外还可以采用各类技术方法，对该植物生长所需的光照、温度、营养等进行调节，让植物的生长环境达到最优。

同时，植物组织培养是一项令人振奋的奇妙的生物技术和重要的技术手段，它既是植物细胞工程和基因工程的技术基础，又是植物快速繁殖和脱毒的重要手段，具有培养材料来源广泛，培养条件可人为调控，不受季节限制，周年生产，管理方便，有利于实现育苗工厂化生产和自动化控制。

生长周期短，繁殖速度快，花卉植物通组培繁殖，在短其内可以繁殖出数以万计的苗木，这些苗木的中传特性和表型特片与母株完全相同，完全保存了母株的优良特性等优点。

至今己有100多个科，1000种以上的植物获得成功，在农业、园林业、医药等行业中得到广泛的应用，创造了巨大的经济效益和社会效益。

影响植物组培成功的因素很多，既有植物内部因素，己有外界环境因素，其中污染、褐变，玻璃化并称为植物组织培养的三大难题，能否有效控制是影响组培能否成功的关键。

组培污染率的降低（一）接种方式与生长观察1、一般外植体可将其一半或部分插入培养基中，茎尖接种时应避免插入太多而引起缺氧；2、直生或斜向生长的植物材料离体培养时，应保持自然生长方向接种；有时为了促进侧枝的形成，茎尖接种时也可以水平放置在培养基上；3、要定期对培养物进行观察和统计，根据培养物生长情况及时对培养基和培养条件做出调整；4、培养过程中经常会出现污染现象，要及时加以清除；5、在继代培养时一定要仔细检查，避免将污染的材料进行扩大增殖（二）外植体褐变1、有些植物材料在接种后会从伤口处分泌出褐色或黑色色素。

这是由于外植体切割后，内部细胞与外界空气直接接触，组织中多酚氧化酶激活，多酚类化合物和单宁被氧化后主生醌类物质的缘故。

2、当这些物质扩散到培养基中时，会抑制外植体其他酶的活性，毒害外植体。

3、植物种类或基因型、外植体采集时间、采集部位及生理状态、培养基成分、培养条件、继代培养时间等都影响褐变的发生。

4、避免产生褐变的对策：（1）应尽可能接种较大的外植体，采用锋利的解剖刀并使切面垂直（减少伤口面），避免对外植体切割损伤，或采用幼龄材料及分生部位或幼态部位外植体接种。

（2）尽可能在初代培养中降低培养基中无机盐和植物生长调节物质的浓度；（3）避免过高的温度和过强的光照（如采用散射光）；（4）在培养基中培养时间不宜过长，尽可能及时转接到新鲜培养基上，有时为了防止褐变每隔数小时就转接一次；（5）外植体采集后用流水冲洗30分钟以上，在接种前先将外植体在无菌水中浸泡处理或在无菌水中切割；（6）使用液体培养基；（7）在培养基中加入以下成分：活性炭：加入量为0.2%~3.0%聚乙烯吡咯烷酮：PVP,加入量为5~10 g/L柠檬酸：加入量为0.05%~0.5%芸香苷：加入量为50~100mg/L硫代硫酸钠：20%溶液，加入量为5ml/L维生素CL-半胱氨酸谷氨酸精氨酸天冬酰氨硫脲（三）玻璃化苗现象1、苗芽玻璃化是一种异常生理现象，是植物组织培养中出现的半透明状、畸形的试管苗。

植物组织培养中的常见问题与对策摘要: 探讨了影响植物组织培养的主要因素, 分析了污染、畸形胚、玻璃苗、褐变、黄化等产生的原因, 并提出了解决措施。

认为: 污染主要是由灭菌不彻底和环境不洁造成的, 加强外植体和培养基的灭菌, 对培养环境及用具彻底消毒, 可大大降低污染率。

培养时间和培养基的组成影响畸形胚的发生, 缩短培养时间, 调整培养基中激素含量, 可使畸形胚转化为正常苗。

培养基的种类、温度、通气状况等会影响玻璃苗的发生, 选择适当培养基, 降低温度, 增强光照, 改善通风等可使玻璃化率降低。

植物品种、取材部位及环境条件与褐变的发生密切相关, 选择适宜的外植体, 进行暗处理, 添加抗氧化剂和吸附剂等可有效控制褐变。

培养基中铁含量不足, 激素配比不当等会导致黄化,正确添加培养基的各种成分, 增强光照, 及时转接可减少黄化。

关键词: 组织培养; 污染; 褐化; 畸形胚; 玻璃苗中图分类号: Q945. 4文献标识码: A文章编号: 1673- 2006( 2010) 11- 0054- 04 收稿日期: 2010- 04- 10作者简介: 王桂荣( 1972- ), 女, 安徽宿州人, 实验师, 主要从事植物及植物生理实践教学与实验室管理。

植物组织培养技术广泛应用于植物脱毒快繁、育种、种质保存、获得次生代谢产物、突变诱发、细胞工程和基因工程等方面, 而且在医药、食品工业、能源工业、环境保护各个领域显示出极大的生产潜力,产生了巨大的经济效益和社会效益, 已成为当代生物科学中最有生命力的一门学科。

但在植物初代培养和继代培养过程中经常会遇到一些问题, 如污染、畸形胚、玻璃苗、褐变、黄化等, 影响实验结果, 甚至导致实验失败, 给科研和生产造成损失。

本文根据近年的研究文献及本人的工作实践, 对这几个问题产生的原因及解决措施进行了论述, 以供参考。

1. 1污染产生的原因污染是在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌, 导致培养失败。

精品资料组织培养褐化原因以及防止措施........................................褐化原因及防止措施褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡的现象。

在组织培养中，褐变是普遍存在的，这种现象与菌类污染和玻璃化并称为植物组织培养的三大难题。

而控制褐变比控制污染和玻璃化更加困难。

因此，能否有效地控制褐变是某些植物能否组培成功的关键。

(一)褐变的原因影响褐变的因素极其复杂，随着植物种类、基因型、外植体的部位及生理状况等的不同，褐变的程度也有所不同。

1.与基因型有关不同植物与品种之间褐变现象是不同的，有人把此归结为基因型的不同。

一般来说植物材料中单宁类和多种羟酚类化合物的含量高，易引起外植体材料的严重褐化。

多数木本植物比草本植物易引起褐化，多年生草本植物比一年生草本植物易引起褐化。

2.与取样外植体的年龄有关通常幼龄部位产生褐化较轻，随着组织的老龄化含醌类物质增多而褐化加重。

因此，在外植体接种时常需要剥去鳞片和大叶片，尤其是以切取幼嫩的芽尖或切取顶芽分生组织(或带少量叶原基)接种更为理想。

3.与外植体取材时间有关一般在春夏季，尤其是春季采取生长旺盛的外植体产生褐化较轻，已木栓化或木质化的枝条和处于休眠状态的芽作为外植体时褐化严重。

即分生部位接种后形成醌类物质少，而分化的部位则形成醌类物质较多。

4.与培养基有关过高的无机盐浓度会引起棕榈科植物外植体酚的氧化，低盐培养基，尤其是Mn2+和 Cu2+离子浓度较低时，外植体的褐化程度较轻。

例如油棕用MS无机盐培养容易引起外植体的褐变，而用降低了无机盐浓度的改良MS培养基时则可减轻褐变，而且获得愈伤组织和胚状体。

植物生长调节物质使用不当时，材料也容易褐变，细胞分裂素BA有刺激多酚氧化酶活性提高的作用，这一现象在甘蔗的组织培养中十分明显。

浅析植物组织培养过程中的污染问题及解决办法植物组织培养指通过无菌无菌操作把植物体的外植体接种于人工配制的培养基，在人工控制的环境条件下去进行离体培养的一套技术和方法。

植物组织培养过程中的温度、湿度、营养及培养基的PH等正是微生物生长的最佳条件，因此与褐化、玻璃化相比，污染更易发生，给科研及生产均带来很大危害，分析和防控污染在组织培养中是不容忽视的。

一、污染种类从污染产生的病原来看，主要包括真菌和细菌。

细菌污染的特点为在培养基表面或材料表面出现黏液庄物体、菌落或者是浑浊的水迹状，有时甚至出现泡沫发酵状，一般在接种1-2天即能发现，主要为大肠杆菌、链球菌、芽孢杆菌，主要是由于使用未消毒好的工具及操作者呼吸排出的细菌引起或操作者的手接触材料或器皿边缘所致。

真菌污染的特点是菌斑呈绒毛状、絮状，界限不明显，伴有不同颜色的孢子，一般在接种3-10天后才能发现，主要为霉菌污染，一般是由空气污染和瓶口边缘以及取放封口杨起的灰尘和真菌孢子落入器皿中造成的。

二、污染来源及防控措施一般来说，植物组织培养中污染来源主要有三类：外植体带菌，接种污染，培养过程污染外植体为组织培养的材料，外植体表面和内部常携带一些微生物，是植物组织培养过程的主要污染源，为了减少外植体导致的污染，应选取合适的材料，尽可能选择带菌少以及不携带内生菌的外植体。

○1、选取胚和无病害的茎尖等，减少携带内生菌的几率。

○2、不同季节，外植体带菌情况不同，选择合适季节采集外植体。

○3、将有土栽培改为无土栽培，减少植物携带外生菌的几率。

○4、将室外的植株移到清洁的室内栽培，生长一段时间后，再取外植体。

○5、利用种子在无菌条件下培育成无菌苗，然后再将无菌苗的胚轴、培根、子叶等作为外植体。

○6、采用合适消毒方法，对于大多数外植体只需表面消毒即可，但由于某些外植体有内生菌，为达到较好的灭菌效果，还需进行其他处理。

接种时，由于镊子带菌或接种室及操作人员的未消毒干净也易引起污染。

植物组培过程中玻璃化现象的发生与解决措施植物组培中，玻璃化是植物根系发生破坏性变化，玻璃化现象普遍出现的一种不良情况。

它是指根系细胞因严重脱水而变脆，其内部构造发生破坏，呈现玻璃样的变性的状态。

玻璃化的发生主要有以下几个原因：一是土壤水分含量过低、温度过高，过轻的培养基组分。

通常土壤的水分含量低于25％左右，温度过高，养分的含量也较低，根系就容易干涸，玻璃化的发生概率就较大。

二是植物营养不均衡。

营养元素不均衡，尤其是氮磷钾含量偏低，有利于细菌病害的发生，也难以满足植物生长和发育的需要，从而容易造成玻璃化现象。

三是移栽后适应不良。

植物移栽后，由于环境、温度、水分等条件的变化，植株比较难以适应，容易出现衰亡现象，如果不得到及时的治疗，就会出现玻璃化的状况。

针对玻璃化的发生，种植者可根据具体情况采取以下措施：1、保证良好的土壤水分含量。

水是植物根系发育和活动的重要基础，因此，改善水分质量是防止玻璃化现象的有效措施之一。

2、分解肥料，保持植物良好的营养状态。

根据植物的特点，选择适合的肥料，经过多次分解施入土壤，以保证植物的健康发育。

3、严格移栽植物的保护措施。

移栽植物时，应注意把植株保护好，移栽后的植物的补水及时、恰当，切忌过量浇水，以减少植物衰亡。

4、及时治疗已发生玻璃化现象的种植品。

采用有效的抗病菌、补水调理等措施，尽早挽救受害植物。

综上所述，植物组培中玻璃化的发生主要由土壤水分含量低、植物营养不均衡、适应不良等因素造成，可采取的措施包括保证良好的土壤水分含量、分解肥料、严格移栽保护以及及时治疗受损种植品等。

期望以上解决措施能够有效减少植物组培玻璃化现象的发生，并保证植物的健康发育！。

植物组培中褐变的原因及其预防措施录入时间:2010-10-21 9:07:57 来源：植物组培网褐变是指在组织培养过程中，培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基逐渐变成褐色，培养材料也慢慢变褐而死亡的现象。

1、褐变的原因很多植物尤其是木本植物体内含有较多的酚类化合物。

在完整植物体的细胞中，酚类化合物和多酚氧化酶分隔存在，因此比较稳定。

当外植体切割后，切口附近细胞的分割效应被打破，酚类化合物被多酚氧化酶氧化形成褐色的醌类化合物，醌类化合物又会在酪氨酸酶的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活，导致组织代谢紊乱，生长受阻，最终逐渐死亡。

2、影响褐变的因素（1）植物基因型在不同植物或同种植物不同基因型的组培过程中，褐变发生的频率和严重程度存在很大的差异，这是由于各种植物所含的单宁及其他酚类化合物的数量不同。

一般木本植物的酚类化合物含量比草本植物高，更易发生褐变现象。

核桃的单宁含量很高，不仅在接种初期发生褐变，在形成愈伤组织后还会因为褐变而死亡；苹果进行茎尖培养时，不同品种之间褐变的程度也不一样。

对葡萄的研究也发现类似情况。

（2）外植体的生理状态外植体的生理状态不同，接种后褐变程度不同。

一般外植体的老化程度越高，其木质素的含量也越高，也就越容易褐变，成龄材料一般均比幼龄材料褐变严重。

另外切口越大，酚类物质的被氧化面也越大，褐变程度就会更严重。

因此外植体的受伤程度对褐变的产生具有明显的影响，伤口加剧褐变的发生。

仙客来小叶诱导时，整片叶接种较分成多块褐变要轻。

除机械损伤外，各种消毒剂对外植体的伤害也会引起褐变，对于不易褐变的种类，用升汞消毒后，一般不会引起褐变，若用次氯酸钠进行消毒，则很容易引起褐变的发生。

（3）取材时间和部位在不同的生长季节，植物体内酚类化合物含量和多酚氧化酶的活性不同。

实验表明在苹果和核桃上，冬、春季取材褐变死亡率最低，夏季取材很容易褐变。

在取材部位上幼嫩茎尖比其他部位褐变程度低，木质化程度高的节段在进行药剂消毒处理后褐变现象更为严重。

2003年6月韶关学院学报(自然科学版)Jun.2003第24卷第6期Journal of Shaoguan University(Natural Science)Vol.24No.6组织培养过程中污染和褐化的防治缪耀梅,李开彪,叶添谋(韶关学院英东生物工程学院,广东韶关512005)摘要:分析了植物组织培养过程中造成污染(真菌污染、细菌污染和潜伏性污染)和褐化的主要原因,同时提出了克服污染和褐化的若干具体措施.关键词:组织培养;污染;褐化;外植体中图分类号:Q136文献标识码:A文章编号:1007-5348(2003)06-0101-03污染和褐化是植物组织培养过程中最常见的现象,也是组织培养过程中的两大难题[1].这是因为微生物体积极其微小,生活力强,数量大,繁殖系数高,容易传播等特点,再加上操作者的技术不过关,以及外植体本身生理状态和环境因素的影响所造成的.本文分析了造成污染和褐化的原因,并总结作者在实践过程中的经验,提出防止措施.1污染的原因及其预防111造成污染的原因在组织培养过程中,污染的微生物分为细菌及真菌两大类[1].细菌污染的特点是,菌斑呈粘液状,而且在接种1~2天即可发现.主要是工作人员使用了未经充分消毒的工具(镊子、培养皿等)及呼吸时排出的细菌所引起的.有时也因操作人员用手接触材料或器皿边缘,这也造成了微生物落入材料或器皿的机会.因此,为了减少或去除这种污染,接种前,工作人员必须剪指甲及用肥皂洗手,以后还要用70%酒精擦拭双手,工作进行过程中,还应特别注意避免交叉污染.如,已灭菌的接种工具被消毒不够彻底的超净工作台面污染后又污染消毒过的材料和已灭菌的培养基等.又如,因工作人员呼吸所产生的污染,主要是在接种时说话或咳嗽引起的.11111真菌污染:一般多由接种室(箱)的空气污染造成.形成的原因,一是接种室的空气本身未很好消毒,二是操作时由于打开瓶盖时真菌孢子落入瓶内,或在去掉包头纸及解除捆扎包头纸的橡皮筋时,扬起了真菌孢子,致使接种室空间污染.11112细菌污染:主要是表面消毒不彻底和交叉污染造成的.11113潜伏性污染:有些培养材料内部带菌,比如维管组织带菌,在培养过程中由于本身的防御系统保护,这些微生物潜伏在其中未表现出来,当培养到一定阶段,由于各种环境因素的变化,外植体组织坏死时,就会长霉.112预防污染的措施11211经常对接种室进行空间消毒:用70%的酒精喷雾降尘消毒,用消毒水擦拭地板、墙壁、工作台等,用紫外灯照射消毒,用甲醛(2mL/m3)加少量高锰酸钾熏蒸灭菌.仔细做好实验室清洁卫生[2].11212防止菌类和灰尘进入室内:在超净工作台门口挂两层纱布,这样可有效地防止菌类和灰尘进入.收稿日期:2002-09-11作者简介:缪耀梅(1979-),女,广东阳江人,韶关学院英东生物工程学院农业工程系学生.11213 紫外灯照射:紫外灯接种前先打开超净工作台的紫外灯照射20min,利用UV 光激发空气中的O 2变成O 3进行空气消毒和UV 光的直接表面消毒.11214 防止操作过程中的污染:在每步操作过程中,都要认真按操作程序进行,防止污染的发生,具体应该注意如下几点:(1)经过灭菌的接种工具表面要盖一层无菌的报纸或纱布,以防止高压锅盖打开后落入细菌和灰尘,双手要套上经过灭菌的手套或用其它经过灭菌的物品把工具放进工作台,不能直接用手拿取工具.然后再开一次紫外灯照射20min.(2)接种前双手要用70%或75%的酒精擦洗2~3次,然后套上经过高压灭菌的袖套和手套,这样可保证伸入工作台空间的手和臂是无菌的,不会污染已经灭过菌的工作台.(3)把从室外采回来的接种材料经修剪、清洗,再用洗衣粉水泡2~3min,把装有外植体的烧杯小心地放在工作台左边,工作台要有两个人配合.用一支经灭菌的镊子把外植体取出放进一干净小烧杯里,注意镊子和外植体不能碰到烧杯壁,然后倒入酒精浸泡1~2min,目的是使外植体得到初步灭菌和浸润,减少附着在材料上的脂溶性物质的表面张力,以利于消毒液与外植体充分接触,以达彻底灭菌的目的.然后用镊子小心地夹起外植体放入另一经灭菌的烧杯,同样注意不能碰到烧杯上壁.倒入杀菌剂(升汞或氯酸钠等),注意杀菌液一定要淹过材料,加入1~2滴吐温-80,用玻棒搅拌.若是升汞,5~10min 后倒掉消毒液,再倒入无菌水,搅拌,连续冲洗8次以上.然后把消好毒的外植体分成3份,放入经过灭菌的培养皿,目的是减少交叉污染的机会.(4)接种时要用另一把干净的镊子,先用干净的剪刀把外植体(茎段)的两端剪去少许,以防带菌,用灭过菌的滤纸吸干水即可接种.一人拿培养瓶或试管,先用酒精擦一下容器外盖和盖子,再取下盖子,另一人接入外植体.每接一定数量的材料后要更换镊子.(5)培养时要注意空间的消毒.可用甲醛加高锰酸熏蒸,或用70%酒精消毒.培养室装上紫外灯定期照射.11215 首次接种污染率的估算与对策[3]:对于初学者而言,污染概率较大.因为第一次接种,材料是从田间或温室采来经表面消毒的,要获得有活力的材料,灭菌措施不可能很彻底,以致污染率很高,严重时常达100%.大多数情况下污染率约为40%~80%.那么首次接种采用什么方式污染率才最低呢?下面以兰花的茎尖(去病毒)培养为例,阐述如何有效降低污染率:(1)假定有100小块(5011~1m m)经消毒的兰花茎尖材料,接入100支试管,每管接1小块,1~2周后就会出现许多污染,其余一直没有污染的,就是得到的无菌材料(如果它们能生长、增殖并通过继代培养,那么就建立了无菌培养系),如果得到10块(10管)不污染的材料,那么得率为10%.(2)假定污染率仍为90%,每支试管接入2小块茎尖组织材料,则P 1=0190@0190=018100=81%P 2=2@0190@0110=01180=18%P 3=0110@0110=010100=1%(注:P 1)2污;P 2)1污1得和1得1污;P 3)2得)实际上P 1和P 2都是污染的,都只能弃去,只有P 3能得到1小块不污染的材料.(3)如果每支试管接入3小块材料,那么,污染率为9919%,得率仅为011%,可见要做1000支试管才能得到1支不污染材料.由此可见,首次外植体接种,每支试管接种一小块材料的污染率是最低的.#102#韶关学院学报(自然科学版)2003年2 褐化的原因与预防211 造成褐化的原因褐变是由于外植体中的多酚氧化酶被激活,使细胞的代谢发生变化[4].酚类物质被氧化后产生呈棕褐色的醌类物质,它们会逐渐扩散到培养基中,抑制其他酶的活性,毒害培养的材料.褐变的影响因素极其复杂,随着植物种类、基因型、外植体的部位及生理状况等的不同,危害程度也有区别.21111 基因型:海垦2号橡胶树的花药褐变较少[4],因而易形成愈伤组织;而有些橡胶树品种极易褐变,其愈伤组织的诱导也很困难.故在组织培养中,有些品系难以成功,而有些则容易成功,其原因之一可能是酚类物质的含量及多酚氧化酶活性上的差异.因此对于容易褐变的植物,应考虑对其不同基因型的筛选,力争采用不褐变或褐变程度轻微的外植体进行培养.21112 外植体的生理状态:有研究表明,材料本身的生理状态不同,接种后褐变的程度也不同.如在欧洲栗的培养中,幼年型的外植体培养时含醌类物质少,而用成年型材料培养时含醌类物质多.在卡德利亚兰的培养中,较短的新生茎致褐物质含量高,而较长的新生茎致褐物质含量低.此外,致褐物质的寒冷因季节的不同而不同,冬季褐变少,夏秋季褐变最严重,接种后存活率也最低.分生部位接种后形成的醌类物质少,而分化的部位形成的醌类物质较多.21113培养基的成分:过高的无机盐浓度会引起棕榈科植物外植体酚的氧化,如油棕用MS 培养基容易引起外植体的褐变,而用降低了无机盐浓度的改良MS 培养基时则可减轻褐变,并可诱导出愈伤组织和胚状体.激素使用不当时,外植体也容易褐变.在芽大量增殖时,褐变也被抑制.此外,培养条件不太适宜,如过高温度或光照过强,都可使多酚氧化酶活性提高,从而加速外植体的褐变.212 防止褐变的措施21211 选择适宜的外植体和培养条件:许多研究表明,选择适当的外植体和培养条件是克服褐变的最主要手段[4].通常外植体应有较强的分生能力,在最适宜的细胞脱分化和再分化培养条件下,使外植体处于旺盛的生长状态,便可大大减轻褐变.适宜的温度和在全黑暗条件下进行培养也可显著减少外植体的褐变.据报道,如在芽初始培养的1~6周内,用黑暗培养或光强150Lx 可抑制外植体的酚类氧化.对于易褐变的材料,接种后转瓶时间长,伤口周围积累的醌类物质增多,则褐变加重;而缩短转瓶周期常常可减轻褐变.21212 加入抗氧化剂[4]:在组织培养中,加入一些氧化剂或用抗氧化剂进行材料(外植体)的预处理或预培养,可大大减轻醌类物质的毒害.这些抗氧化剂包括:Vit C 、Vit E 、聚乙烯吡咯烷酮(乙烯聚合物pyrrolidone,PVP)、血清白蛋白、柠檬酸、硫代硫酸钠(Na 2S 2O 3)等.011%~015%活性炭对吸附酚类氧化物的效果也很明显.参考文献:[1]罗士韦.植物组织培养在农业上的应用[J].植物生理学通讯,1997(1):1-6.[2]刘青林,陈青华,陈俊愉.梅花愈伤组织培养及其细胞学研究初报[J].北京林业大学学报,1999,21¦:100-105.[3]谭文澄.观赏植物组织培养技术[M].北京:中国林业出版社,1997.86-87.[4]潘瑞炽.植物组织培养[M].广州:广东高教出版社,2000.(下转第112页)#103#第6期缪耀梅,等:组织培养过程中污染和褐化的防治要求,积极研究和确立全面评价体育师范生创新意识和创造能力的内容和指标,并将其充实到学业考核评价体系中去,作为衡量学生学习成效的重要标准.参考文献:[1]冯培,贺淑曼.创新素质与人才发展[M].北京:世界图书出版公司,2000.16-20.[2]陈冀平.高师院校创新教育与课程结构改革[J].高等师范教育,1999(5):50.[3]周明星.不拘一格的创造力[M].武汉:武汉大学出版社,2000.[4]杨留锁,肖丰.试论体育院校学生创新素质的培养[J].体育科学,2003(1):17-20.A Research on the Cultivating Aproachesof the Creative Physical GraduatesXUE Liu -cheng 1,ZHE NG Wen -ling 2,HUANG Jin -ming 1(1.Department of Physical Education,Shaoguan University,Shaoguan 512005,Guangdong,China;2.Department of Physical Education,Nanyang Teaching -training College,Nanyang473061,Henan,China)Abstract:As the coming of the times of knowledge and economics,the tasks for education to cultivate the qualified graduates with creative senses and abilities for society are more and more important and ur -gent.By the analysis and reaearch on the proble ms existinhg in the cultivation of creative graduates in physics department of universities,this article probes into the cultivating approaches of creative phys-i cal graduates.Key words:physical education students for teacher -training;creative and qualified personnel;cult-i vating approaches(责任编辑:赵 鸥)(上接第103页)Study on the Prevention and Cure of the Browning and Pollu tionin the Process of the Plant Tissue CultureMIAO Yao -mei,LI Ka -i biao ,YE Tian -mou(Yingdong College of Bioengineering,Shaoguan University,Shaoguan 512005,Guangdong,China)Abstract:In this paper,the main reasons which caused the pollution and browning in the process of plant tissue culture had been discussed detaily,meanwhile,measures had been taken to overc ome these problem effitiently.Key words:tissue culture ;pollution ;browning;explant(责任编辑:颜志森)#112#韶关学院学报(自然科学版)2003年。

植物组织培养中的褐变现象与防止方法植物组织培养中出现褐变现象是一种常见的问题，褐变通常是因为植物组织培养过程中遭受到内部或外部压力所致。

褐变不仅会导致组织的死亡，也会影响到培养物的生长和发育。

因此，了解褐变的原因并采取相应的防止方法非常重要。

褐变现象发生的原因可以归纳为以下几个方面：1.感染：细菌、真菌和病毒感染是导致褐变的常见原因。

感染会导致组织坏死并产生褐色产物，从而导致组织培养失败。

解决方法：进行无菌操作，确保培养环境的无菌状态，并加强培养物的保护。

使用抗菌剂、消毒剂和抗生素等来抑制病菌的生长和传播。

2.氧化：氧化应激是导致组织褐变的常见原因之一、当细胞受到氧化应激时，产生大量的活性氧自由基，进而导致细胞内物质的氧化和组织褐变。

解决方法：在培养过程中尽量减少暴露在空气中的时间，并加入适量的抗氧化剂，如抗坏血酸、多酚等，来减少氧化损伤。

3.脱水：组织细胞在培养过程中由于脱水导致的细胞膜破裂，会释放出酶和多酚等有害物质，从而导致组织褐变。

解决方法：在组织切割后尽快进行培养，避免组织脱水。

可以使用无菌的生理盐水或培养基进行预处理，来保持组织的水分。

4.存储条件不适宜：组织在培养过程中需要适当的温度、湿度和光照等条件来维持其正常的生理活性。

如果存储条件不适宜，会导致组织的死亡和褐变的产生。

解决方法：在培养室中提供适宜的温度、湿度和光照条件，并定期检查和调节培养环境的参数，以确保组织的正常生长和发育。

总之，在植物组织培养中防止褐变现象的发生，需要保持无菌环境、抑制病菌感染、减少氧化应激、防止组织脱水和提供适宜的存储条件。

通过这些措施，可以有效减少组织的褐变现象，提高培养物的生长和发育效果。