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海南凡纳滨对虾机体内三种常见弧菌鉴定、分子血清型研究及其拮抗菌筛选针对近年来海南养殖凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)常暴发早期死亡综合症、白便综合症、发光病等重大流行性疾病,同时其机体内常携带大量弧菌的现象,本文选择海南临高新盈、海口荣山、万宁山根、东方四更和新龙、昌江昌化的重要代表性凡纳滨对虾养殖区的患病对虾,从48个病虾样品中共分离获得514株弧菌；采用3种弧菌的特异性PCR检测方法进行鉴定,结果表明,哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)91株,溶藻弧菌(V. alginolyticus)24株,副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)0株,其它弧菌399株；按照5%的比例随机抽取上述鉴定菌株开展16S rDNA序列分析和标准生理生化鉴定,结果与特异性PCR检测方法结果一致。
因此,除了哈维氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌外,海南地区养殖对虾机体内还存在多种其它弧菌。
在良好水质环境中开展投喂和浸泡方式的回归感染试验结果表明,仅从东方分离的哈维氏弧菌PBVH3311具有明显的致病性,可产生与自然患病对虾相似的症状。
因此,我们推测：海南地区的对虾弧菌病原绝大多数应该为严格依赖环境条件的条件致病性菌株,可通过改善养殖环境防止这些疾病的暴发。
以肠杆菌基因间重复共有序列PCR (ERIC-PCR)技术对上述哈维氏弧菌和溶藻弧菌开展了分子血清型研究,结果表明：(1)对哈维氏弧菌而言,在45%的相似度时,91株哈维氏弧菌聚为1类群；在80%的相似度时,这些菌株分为14个类群(分子血清型),其中来自东方四更和新龙的发光病对虾机体内的36株哈维氏弧菌属同一个类群,而其他地区来源的菌株无明显的地域集中分布特征。
(2)对溶藻弧菌而言,在45%的相似度时,24个菌株也完全聚为1类群；在80%的相似度时,这些溶藻弧菌分为15个类群,且无明显的地域集中特征。
总之,除了从发光病对虾机体内分离的哈维氏弧菌外,从其它患病对虾机体内的分离的哈维氏弧菌和溶藻弧菌的遗传多样性都较高,未出现某一分子血清型集中分布的现象。
凡纳滨对虾细菌的分离与鉴定钱诗悦１，王兴强１∗，邹易恒１，曹梅１，刘栩华１，李永２（１．江苏海洋大学海洋科学与水产学院，江苏连云港２２２００５；２．连云港侨海渔业科技有限公司，江苏连云港２２２０４５）摘要㊀以凡纳滨对虾（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ）为研究对象，通过ＤＮＡ提取和ＰＣＲ扩增分离鉴定样本中的欧文斯弧菌（Ｖｉｂｒｉｏｏｗｅｎｓｉｉ）㊁哈维氏弧菌（Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ）㊁溶藻弧菌（Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）㊁副溶血性弧菌（Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）㊁新喀里多尼亚弧菌（Ｖ．ｎｅｏｃａｌｅｄｏｎｉｃｕｓ）㊁创伤弧菌（Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）㊁坎式弧菌（Ｖ．ｃａｍｐｂｅｌｌｉｉ）㊁霍乱弧菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）㊁含ＣＴＸ肠毒素霍乱弧菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａＣＴＸ）㊁拟态弧菌（Ｖ．ｍｉｍｉｃｕ）和河流弧菌（Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）１１种致病性弧菌㊂根据样本ＴＣＢＳ平板检测结果，统计样本中所检测弧菌的重复出现率，按出现频率逐级分析，对检出率较高的欧文斯弧菌（Ｖ．ｏｗｅｎｓ）㊁哈维氏弧菌（Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ）和溶藻弧菌（Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）进行详细探讨，并根据养殖过程出现的具体情况制定相应的预防和控制策略，为凡纳滨对虾细菌性疾病的防治提供技术支撑㊂关键词㊀凡纳滨对虾；细菌；分离；鉴定中图分类号㊀Ｓ９４５．４＋９㊀㊀文献标识码㊀Ａ㊀㊀文章编号㊀０５１７－６６１１（２０２３）２４－００７４－０４ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０５１７－６６１１．２０２３．２４．０１６㊀㊀㊀㊀㊀开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＢａｃｔｅｒｉａｆｒｏｍＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉＱＩＡＮＳｈｉ⁃ｙｕｅ，ＷＡＮＧＸｉｎｇ⁃ｑｉａｎｇ，ＺＯＵＹｉ⁃ｈｅｎｇｅｔａｌ㊀（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＭａｒｉｎｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＦｉｓｈｅｒｉｅｓ，ＪｉａｎｇｓｕＯｃｅａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ，Ｊｉａｎｇｓｕ２２２００５）Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉｗｅｒｅｔａｋｅｎａｓｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｂｊｅｃｔ，１１ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃＶｉｂｒｉｏｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＶ．ｏｗｅｎｓｉｉ，Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ，Ｖ．ａｌｇｉ⁃ｎｏｌｙｔｉｃｕｓ，Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ，Ｖ．ｎｅｏｃａｌｅｄｏｎｉｃｕｓ，Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ，Ｖ．ｃａｍｐｂｅｌｌｉｉ，Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ，Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａＣＴＸ，Ｖ．ｍｉｍｉｃｕａｎｄＶ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｓａｍｐｌｅＴＣＢＳｐｌａｔｅ，ｔｈｅｒｅｐｅａｔｅｄｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｒａｔｅｏｆｖｉｂｒｉｏｓｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｔｈｅｓａｍｐｌｅｗｅｒｅｃｏｕｎｔｅｄ，ａｎａｌｙｚｉｎｇｓｔｅｐｂｙｓｔｅｐａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙ．Ｖ．ｏｗｅｎｓ，Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉａｎｄＶ．ａｌｇｉｎｏ⁃ｌｙｔｉｃｕｓｗｉｔｈｈｉｇｈｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒａｔｅｗｅｒｅｄｉｓｃｕｓｓｅｄｉｎｄｅｔａｉｌ，ｆｏｒｍｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｓｔｒａｔｅｇｉｅｓａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｓｉｔｕａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｂｒｅｅｄｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓａｎｄｐｒｏｖｉｄｉｎｇｔｅｃｈｎｉｃａｌｓｕｐｐｏｒｔｆｏｒｔｈｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｄｉｓｅａｓｅｓｏｆＬ．ｖａｎｎａｍｅｉ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ；Ｂａｃｔｅｒｉａ；Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ；Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ基金项目㊀江苏省政策引导类计划苏北科技专项（ＳＺ－ＬＹＧ２０２０３８）；江苏海洋大学２０２２年大学生创新创业训练计划㊂作者简介㊀钱诗悦（１９９７ ），女，江苏连云港人，硕士研究生，研究方向：水产动物病害防治㊂∗通信作者，教授，硕士生导师，从事水产动物病害防治研究㊂收稿日期㊀２０２３－０１－１４㊀㊀凡纳滨对虾（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ）是目前产量最高的养殖甲壳类，它具有生长速度快㊁抗病能力强和出肉率高等优点㊂从２０１０年开始，在人工养殖过程中病害频发，导致成活率显著降低甚至绝收，严重影响其养殖的经济效益㊂凡纳滨对虾常患的病害包括细菌性疾病，病毒性疾病以及寄生虫病，其中细菌性疾病较为常见，如副溶血性弧菌（Ｖｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）㊁鳗弧菌（Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）㊁欧文斯弧菌（Ｖｉｂｒｉｏｏｗｅｎｓｉｉ）㊁哈维氏弧菌（Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ）㊁溶藻弧菌（Ｖ．ａｌｇｉｎｏ⁃ｌｙｔｉｃｕｓ）㊁新喀里多尼亚弧菌（Ｖ．ｎｅｏｃａｌｅｄｏｎｉｃｕｓ）㊁创伤弧菌（Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）㊁坎式弧菌（Ｖ．ｃａｍｐｂｅｌｌｉｉ）㊁霍乱弧菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）㊁含ＣＴＸ肠毒素霍乱弧菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａＣＴＸ）㊁拟态弧菌（Ｖ．ｍｉｍｉｃｕ）和河流弧菌（Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）以及假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）等引起的相关疾病，其主要表现有红体㊁红腿㊁肠炎和烂鳃等症状㊂陈健舜等［１］对浙江地区凡纳滨对虾红体病病原研究后，从病虾体内分离出的病原体大多为弧菌，包括副溶血性弧菌㊁坎氏弧菌和需钠弧菌（Ｖ．ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ），病菌主要分布在凡纳滨对虾体内㊁甲壳上皮和结缔组织等部位，处于急性期的对虾通体呈红色，特别是尾扇和游泳足最为明显㊂研究表明，对虾的肝胰腺受到破坏后能够分泌出大量的肝胰腺类胡萝卜素，引起红体症状［２］㊂夏秋季雨水较多，养殖水体盐度较低，而养殖水温明显升高，凡纳滨对虾易受嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）的感染，可诱发红腿病；当凡纳滨对虾患严重的红腿病时，它的胃壁会呈现红色，肝部表现橙黄色［３］㊂张玲宏等［４］通过显微镜检查发现，红腿病虾患部红色素细胞呈扩张状态，鳃丝末端也存在大量活动的短杆菌，即弧菌㊂肠炎病多发于７ ８月，主要由嗜水气单胞菌㊁大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）和沙门氏菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）等细菌感染引起，肠道㊁胃部呈血红色，中肠红肿㊁后肠浑浊［５］㊂该时期水体温度偏高，加上未按时清理饵料和粪便，易引起缺氧和呼吸困难㊂当凡纳滨对虾细菌性肠炎发病后，轻则营养吸收能力下降导致对虾营养不良㊁脱壳困难㊁生长缓慢和空肠空胃等现象，重则导致凡纳滨对虾体质与抗病力下降，容易继发其他细菌病或病毒病，导致偷死或大面积死亡㊂黄雪敏［６］对２０１８年广东省湛江地区春夏季凡纳滨对虾烂鳃病主要病原进行探讨，发现为非发光哈维氏弧菌，加上水体污染进一步引起藻类死亡，病原菌的大量蓄积于对虾鳃部，进一步破坏其组织；病虾鳃丝肿大呈灰色，溃烂，缺氧，影响吃食，呼吸艰难和食欲不振；水中大量的藻类颗粒能够通过呼吸进入鳃部，长时间蓄积则会引起黑鳃病以及烂鳃病㊂鉴于凡纳滨对虾细菌性疾病频发的现状，该研究通过ＤＮＡ提取和ＰＣＲ扩增分离鉴定样本中的欧文斯弧菌㊁哈维氏弧菌㊁溶藻弧菌㊁副溶血性弧菌㊁新喀里多尼亚弧菌㊁创伤弧菌㊁坎式弧菌㊁霍乱弧菌㊁含ＣＴＸ肠毒素霍乱弧菌㊁拟态弧菌和河流弧菌１１种致病性弧菌，以期为凡纳滨对虾细菌性疾病病原菌的确定和对症下药提供技术支撑㊂㊀㊀㊀安徽农业科学，Ｊ．ＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃ．Ｓｃｉ．２０２３，５１（２４）：７４－７７１㊀材料与方法１．１㊀ＤＮＡ提取㊀利用试剂盒提取弧菌ＤＮＡ，提取的ＤＮＡ可置于２ ８ħ保存，３ｄ内使用，或－２０ħ以下长期冻存㊂１．２㊀ＰＣＲ扩增㊀ＰＣＲ管中分别加入１７μＬ的扩增反应液，然后向每个ＰＣＲ管的液面下加入３μＬ对虾样本ＤＮＡ模板或阴性对照，加入后对样本进行轻轻吸打，之后将盖子盖上，离心数秒备用㊂根据ＰＣＲ标准程序扩增，５０ħ２ｍｉｎ；９４ħ４ｍｉｎ；（９４ħ３０ｓ，５２ħ３０ｓ，７２ħ２０ｓ），４０循环；（９４ħ３０ｓ，６８ħ３０ｓ，７２ħ２０ｓ），３循环；４ħ保存㊂当扩增反应完成后，马上检测ＰＣＲ产物或置于－２０ħ保存㊂１．３㊀弧菌芯片鉴定㊀必须在其他的通风房间内进行，切勿与样本ＤＮＡ提取㊁ＰＣＲ扩增的操作在同一环境内进行㊂试验过程中，需提前２０ｍｉｎ把微孔板恒温振荡器打开，温度控制在４５ħ㊂将对应样本数量的晶格取出，进行标记编号㊂每份样本应将６００μＬ反应液１和待检样本的２０μＬＰＣＲ扩增产物加入反应槽中㊂将晶格转入微孔板恒温振荡器，１５００ｒ／ｍｉｎ振荡１０ｍｉｎ㊂反应结束后，把晶格取出，打开盖子，然后将晶格稍微倾斜，让反应槽内的液体都被吸净㊂根据实际的检测数量，将预先准备好的混合反应液１和反应液２放置到１５ｍＬ的试管中，反应液１每份取量为６００μＬ，反应液２每份取１μＬ㊂向每个反应槽内分别加入６００μＬ反应液１和反应液２预混合液，振荡仪１５００ｒ／ｍｉｎ振荡３ｍｉｎ㊂打开盖子，把晶格稍微倾斜，以使反应槽内的液体被吸收干净㊂在每个反应槽中加入２ｍＬ的ｂｕｆｆｅｒ，盖盖，置于恒温振荡仪，１５００ｒ／ｍｉｎ，２ｍｉｎ㊂为确保将芯片完全浸没，需要在反应槽内加入５００μＬ的反应液３，然后在恒温条件下，用１５００ｒ／ｍｉｎ的振荡仪振荡３ｍｉｎ㊂把自来水依次加入每个反应槽后，缓慢摇晃晶格５ｓ，观察水中不同芯片上的试验结果㊂质量控制标准为阴性对照品的膜芯片除ＨＣ（用于质控杂交过程的）存在颜色的位置显示外，其他的均不出现任何显色，出现颜色的显示则表示该区域可能存在环境污染情况㊂１．４㊀结果判读㊀试验结果如果ＨＣ呈阳性，ＮＣ探针呈阴性，则可以判断试验结果满足条件，再将不同菌种鉴定试验样本的颜色与芯片探针排布图进行对比，判读致病性弧菌的种类㊂２㊀结果与分析由图１可以看出，蒋涛样本在检测指标内其优势弧菌为哈维氏弧菌和欧文斯弧菌（图１ａ）㊂张艳样本ＴＣＢＳ平板培养显示未见黄色菌落与绿色菌落，在检测指标内其存在弧菌为溶藻弧菌和欧文斯弧菌（图１ｂ）㊂王祥友样本ＴＣＢＳ平板培养显示黄色菌落，在检测指标内其存在弧菌为副溶血性弧菌和欧文斯弧菌（图１ｃ）㊂文帅第２个样本ＴＣＢＳ平板培养显示为少量黄色菌落，在检测指标内未检出弧菌（图１ｄ）；第２个样本ＴＣＢＳ平板培养显示黄色菌落，在检测指标内其存在优势弧菌为副溶血性弧菌，存在弧菌为哈维氏弧菌（图１ｅ）㊂宋忠鑫样本ＴＣＢＳ平板培养显示为黄色菌落和绿色菌落，在检测指标内其存在弧菌为溶藻弧菌㊁创伤弧菌和欧文斯弧菌（图１ｆ）㊂宋忠良第１个样本ＴＣＢＳ平板培养显示为黄色菌落，在检测指标内其优势弧菌为哈维氏弧菌，存在弧菌为溶藻弧菌（图１ｇ）；第２个样本ＴＣＢＳ平板培养显示黄色菌落，在检测指标内其存在弧菌为溶藻弧菌㊁新喀里多尼亚弧菌和欧文斯弧菌（图１ｈ）㊂房根善第１个样本ＴＣＢＳ平板培养显示为黄色菌落，在检测指标内其存在弧菌为副溶血性弧菌㊁溶藻弧菌和欧文斯弧菌（图１ｉ）；第２个样本ＴＣＢＳ平板培养显示为黄色菌落和少量绿色菌落，在检测指标内其优势弧菌为溶藻弧菌，存在弧菌为哈维氏弧菌和欧文斯弧菌（图１ｊ）㊂陈永利样本ＴＣＢＳ平板培养未显示菌落，在检测指标内未检出弧菌（图１ｋ）㊂辛伟样本ＴＣＢＳ平板培养显示为黄色菌落，在检测指标内存在弧菌为哈维氏弧菌和欧文斯弧菌（图１ｌ）㊂董淑花样本ＴＣＢＳ平板培养显示为黄色菌落，在检测指标内其优势弧菌为哈维氏弧菌和欧文斯弧菌（图１ｍ）㊂孙成梅样本ＴＣＢＳ平板培养显示为黄色菌落，在检测指标内其优势弧菌为副溶血性弧菌㊁哈维氏弧菌和欧文斯弧菌（图１ｎ）㊂夏正发样本ＴＣＢＳ平板培养显示为黄色菌落，在检测指标内其优势弧菌为溶藻弧菌和哈维氏弧菌，存在弧菌为副溶血性弧菌和新喀里多尼亚弧菌（图１ｏ）㊂董淑志样本ＴＣＢＳ平板培养显示为黄色菌落和绿色菌落，在检测指标内其优势弧菌为欧文斯弧菌，存在弧菌为溶藻弧菌和哈维氏弧菌（图１ｐ）㊂陈胜利样本ＴＣＢＳ平板培养显示为绿色菌落，在检测指标内其存在弧菌为新喀里多尼亚弧菌和欧文斯弧菌（图１ｑ）㊂沈卫飞样本ＴＣＢＳ平板培养显示为黄色菌落，在检测指标内未发现弧菌（图１ｒ）㊂陈文贵ＴＣＢＳ平板培养显示为黄色菌落，在检测指标内优势弧菌为新喀里多尼亚弧菌和欧文斯弧菌，存在弧菌为副溶血性弧菌和溶藻弧菌（图１ｓ）㊂毛峰海ＴＣＢＳ平板培养显示无菌落，在检测指标内未检测出弧菌（图１ｔ）㊂㊀㊀经过对２０个样本中不同弧菌分布统计发现，欧文斯弧菌在样本中存在数量为１３个，哈维氏弧菌和溶藻弧菌存在数量均为９个，副溶血性弧菌存在数量为６个，新喀里多尼亚弧菌存在数量为４个，创伤弧菌存在数量为１个，其余弧菌种类在样本中未能发现（表１）㊂３㊀结论与讨论欧文斯弧菌可能带导致急性肝胰腺坏死症（ＥＭＳ）的毒力因子，存在ＡＣＭＭ６４２等高致病性毒株，水体中含有１００ＣＦＵ／ｍＬ该毒株，即可导致对虾死亡，需要严格防控［７］㊂哈维氏弧菌是一种重要的致病性海洋弧菌之一，为近海海洋动物体表或体内正常菌群，其在水体或虾体内载量较高时容易导致对虾发光病和胰岛细胞坏死病，该弧菌数量较少时属正常范围［８］㊂溶藻弧菌是养殖水体主要弧菌病原，数量较多容易直接或间接导致虾苗幼体菌血症㊁对虾红体症㊁细菌白斑病，数量较少属于正常［９］㊂副溶血性弧菌是养殖水体主要病原，即使有少量数量时若在养殖过程中出现毒理蛋白ｔｏｘｉｎＡ／Ｂ，也可能爆发ＥＭＳ；由于ＥＭＳ死亡率较高，故需要严格防控［１０］㊂新喀里多尼亚弧菌在今年最新的报道中指出，该弧菌可能是引发 玻璃苗 的重要病源之一，在玻璃苗中，该菌和溶藻弧菌㊁副溶血性弧菌为优势菌种［１１］㊂坎氏弧菌可以导致ＥＭＳ，但世界动物组织尚未将其列入ＥＭＳ病原菌，但５７５１卷２４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀钱诗悦等㊀凡纳滨对虾细菌的分离与鉴定图１㊀２０个样本弧菌ＴＣＢＳ平板培养结果Ｆｉｇ．１㊀ＴＣＢＳｐｌａｔｅｃｕｌｔｕｒｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｖｉｂｒｉｏｆｒｏｍ２０ｓａｍｐｌｅｓ考虑ＥＭＳ具有较强的致病性，故暂将其定位为需要较严格防控的弧菌种［１２］㊂霍乱弧菌数量较多时易导致对虾红体病，在多处对虾养殖水体中爆发，导致较高的对虾排塘率，该弧菌数量少时属于正常范围［１３］㊂含ＣＴＸ肠毒素霍乱弧菌致病性较普通霍乱弧菌更强，发病症状为行动呆滞，时而浮头，随着病情加重全身肌肉发白，一般在１周内死亡，需要严格控制［１４］㊂河流弧菌可引发对虾的红体综合征，容易在短期内迅速增殖，故需要严格控制［１５］㊂拟态弧菌能引起水产动物６７㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２３年表１㊀２０个样本中不同弧菌分布统计Ｔａｂｌｅ１㊀Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓｔａｔｉｓｔｉｃｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｖｉｂｒｉｏｓｉｎ２０ｓａｍｐｌｅｓ单位：个序号Ｎｏ．名称Ｎａｍｅ数量Ｑｕａｎｔｉｔｙ１欧文斯弧菌（Ｖ．ｏｗｅｎｓｉｉ）１３２哈维氏弧菌（Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ）９３溶藻弧菌（Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）９４副溶血性弧菌（Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）６５新喀里多尼亚弧菌（Ｖ．ｎｅｏｃａｌｅｄｏｎｉｃｕｓ）４６创伤弧菌（Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）１７坎式弧菌（Ｖ．ｃａｍｐｂｅｌｌｉｉ）０８霍乱弧菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）０９含ＣＴＸ肠毒素霍乱弧菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａＣＴＸ）０１０拟态弧菌（Ｖ．ｍｉｍｉｃｕ）０１１河流弧菌（Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）０的多种弧菌病，如蟹类的气泡病，黄颡鱼溃烂病等，虽目前未见其对虾养殖影响的明显案例报道，单考虑其含有溶血素㊁黏附素㊁外毒素和肠毒素等多种毒素，存在与其他弧菌协同致病的可能，对虾养殖的潜在病原，数量较少时属正常范围［１６］㊂创伤弧菌是三大致病性弧菌之一，同时也是一种人鱼共患病原菌，是人类和水产养殖动物的重要病原弧菌㊂在水产养殖中，若创伤弧菌超标，可使许多种经济动物患病，如罗非鱼㊁金鲳鱼㊁安圭拉鳗鱼㊁鲟鱼㊁草鱼和南美白对虾等，该细菌对对虾养殖而言，数量少时属正常范围［１７］㊂根据２０个样本弧菌ＴＣＢＳ平板检测结果，欧文斯弧菌在样本中存在数量最多，哈维氏弧菌和溶藻弧菌存在数量居中，副溶血性弧菌和新喀里多尼亚弧菌存在数量较少，创伤弧菌存在数量最少，因而在购买虾苗时，要选择能提供检验检疫合格证的正规渠道，才能有效地从源头控制病原体进入塘中㊂虾苗的放养数量不能过大，否则容易减小虾的活动空间，从而虾的摄食量会减少影响营养的吸收，虾的生长将会放慢；同时活动空间减少，会增加虾的相互碰撞刺伤，受伤的虾容易感染病原体从而引发疾病［１８］㊂王淑生［１９］研究发现，好的水质对养虾十分重要，想要养好虾需要将水质养好，良好的水质就是水质中具有良好的藻相，这是养殖对虾成功的关键环节㊂在养殖模式上，主要选用生态养殖方式㊂生态养殖模式具有水体空间进行了合理的利用，水体的自然净化能力强，从而减少虾的患病等优势，同时生态养殖方式可以减少投入成本，从而提高经济效益㊂为进一步防治红腿㊁红体病，应于季节交替时全面消毒养殖池，预防肠炎病的有效措施是定期向水池中泼洒有益活菌，包括ＥＭ菌㊁芽孢杆菌㊁硝化细菌等㊂这样可以保持水质优良，水中的氨㊁氮和亚硝酸盐等含量不超标，同时保持水质中的菌种平衡，不会造成蓝藻过量繁殖［２０］㊂参考文献［１］陈健舜，朱凝瑜，丁雪燕，等．浙江省主要养殖区凡纳滨对虾（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ）红体病病原研究［Ｊ］．浙江大学学报（农业与生命科学版），２０１４，４０（６）：６９７－７０８．［２］周燕侠，余开．说说关于养殖南美白对虾病害的那些事［Ｊ］．科学养鱼，２０１３（６）：１３－１６，９３．［３］姚洪，张吉鹏，杨川，等．辽宁一例凡纳滨对虾大规模死亡的病原研究［Ｊ］．大连海洋大学学报，２０１６，３１（３）：２５６－２６０．［４］张玲宏，古田．南美白对虾养殖技术与病害防治［Ｊ］．河南水产，２００２（４）：１７－１８．［５］王涛．凡纳滨对虾无公害养殖的病害防治技术［Ｊ］．动物医学进展，２００６，２７（５）：１０９－１１１．［６］黄雪敏．凡纳滨对虾育苗系统细菌资源挖掘及溶藻弧菌基因组初步分析［Ｄ］．湛江：广东海洋大学，２０２０．［７］ＬＩＵＦ，ＬＩＳＨ，ＹＵＹ，ｅｔａｌ．ＰａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆａＶｉｂｒｉｏｏｗｅｎｓｉｉｓｔｒａｉｎｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＦｅｎｎｅｒｏｐｅｎａｅｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓｃａｒｒｙｉｎｇｐｉｒＡＢｇｅｎｅｓａｎｄｃａｕｓｉｎｇＡＨＰＮＤ［Ｊ］．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，２０２１，５３０：１－９．［８］ＺＨＡＯＮ，ＪＩＡＬ，ＨＥＸ，ｅｔａｌ．ＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓｏｆｍｕｃｏｓａｌｅｘｏｓｏｍｅｓｏｆＣｙｎｏｇｌｏｓ⁃ｓｕｓｓｅｍｉｌａｅｖｉｓａｌｔｅｒｅｄｗｈｅｎｉｎｆｅｃｔｅｄｂｙＶｉｂｒｉｏｈａｒｖｅｙｉ［Ｊ］．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌａｎｄｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０２１，１１９：１－１０．［９］ＹＩＮＸＬ，ＺＨＵＡＮＧＸＱ，ＬＩＡＯＭＱ，ｅｔａｌ．Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓｐａｎｉｃｕｌａｔａｉｍ⁃ｐｒｏｖｅｓｇｒｏｗｔｈａｎｄｎｏｎ⁃ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｍｍｕｎｉｔｙｏｆｓｈｒｉｍｐＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ，ａｎｄｐｒｏｔｅｃｔｓｉｔｆｒｏｍＶｉｂｒｉｏａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓｂｙｒｅｄｕｃｉｎｇｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌａｎｄｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０２３，１３９：１－１２．［１０］ＳＡＮＴＨＯＳＨＰ，ＫＡＭＡＲＡＪＭ，ＳＡＲＡＶＡＮＡＮＭ，ｅｔａｌ．Ｄｉｅｔａｒｙｓｕｐｐｌｅｍｅｎ⁃ｔａｔｉｏｎｏｆＳａｌｖｉｎｉａｃｕｃｕｌｌａｔａｉｎｗｈｉｔｅｓｈｒｉｍｐＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉｔｏｅｎ⁃ｈａｎｃｅｔｈｅｇｒｏｗｔｈ，ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，ａｎｄｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏＶｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ［Ｊ］．Ｆｉｓｈａｎｄｓｈｅｌｌｆｉｓｈｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０２３，１３２：１－１０．［１１］王印庚，于永翔，刘潇，等．凡纳滨对虾虾苗细菌性玻化症（ＢＶＳ）的病原㊁病理分析［Ｊ］．水产学报，２０２１，４５（９）：１５６３－１５７３．［１２］ＰＨＵＫＥＴＴＲＮ，ＣＨＡＲＯＥＮＳＡＰＳＲＩＷ，ＡＭＰＡＲＹＵＰＰ，ｅｔａｌ．Ａｎｔｉｂａｃｔｅ⁃ｒｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙｒｏｌｅｏｆａｐｒｏｌｉｎｅ⁃ｒｉｃｈａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｅｐｔｉｄｅＳｐＰＲ⁃ＡＭＰ１ａｇａｉｎｓｔＶｉｂｒｉｏｃａｍｐｂｅｌｌｉｉｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｓｈｒｉｍｐＬｉｔｏｐｅ⁃ｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ［Ｊ］．Ｆｉｓｈａｎｄｓｈｅｌｌｆｉｓｈｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０２３，１３２：１－９．［１３］ＪＯＳＥＰＨＴＣ，ＭＵＲＵＧＡＤＡＳＶ，ＲＥＧＨＵＮＡＴＨＡＮＤ，ｅｔａｌ．ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＶｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅＯ１３９ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｍａｓｓｍｏｒｔａｌｉｔｙｉｎＰｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎａｎｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｈａｌｌｅｎｇｅｉｎｐｏｓｔｌａｒｖａｅｏｆｔｈｒｅｅｓｐｅ⁃ｃｉｅｓｏｆｓｈｒｉｍｐ［Ｊ］．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，２０１５，４４２：４４－４７．［１４］ＫＯＲＡＬＡＧＥＭＳＧ，ＡＬＴＥＲＴ，ＰＩＣＨＰＯＬＤ，ｅｔａｌ．Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅａｎｄｍｏｌｅｃ⁃ｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＶｉｂｒｉｏｓｐｐ．ｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｐｒｅｈａｒｖｅｓｔｓｈｒｉｍｐｏｆｔｈｅＮｏｒｔｈＷｅｓｔｅｒｎＰｒｏｖｉｎｃｅｏｆＳｒｉＬａｎｋａ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｆｏｏｄｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，２０１２，７５（１０）：１８４６－１８５０．［１５］ＡＬＡＶＡＮＤＩＳＶ，ＶＩＪＡＹＡＮＫＫ，ＳＡＮＴＩＡＧＯＴＣ，ｅｔａｌ．ＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．ＰＭ１１ａｎｄＶｉｂｒｉｏｆｌｕｖｉａｌｉｓＰＭ１７ｏｎｉｍｍｕｎｅｉｎｄｉｃｅｓｏｆｔｉｇｅｒｓｈｒｉｍｐ，Ｐｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎ［Ｊ］．Ｆｉｓｈａｎｄｓｈｅｌｌｆｉｓｈｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００４，１７（２）：１１５－１２０．［１６］ＭＵＮＫＯＮＧＷＯＮＧＳＩＲＩＮ，ＰＲＡＣＨＵＭＷＡＴＡ，ＥＡＭＳＡＡＲＤＷ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏ⁃ｐｉｏｎｉｇｅｎｉｕｍａｎｄＶｉｂｒｉｏｓｐｅｃｉｅｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓｐｏｓｓｉｂｌｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｃａｕｓｅｓｏｆｓｈｒｉｍｐｗｈｉｔｅｆｅｃｅｓｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＷＦＳ）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａｎＥｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎｈｅｐａｔｏｐｅｎａｅｉ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０２２，１９２（１）：１－１０．［１７］ＪＩＨ，ＣＨＥＮＹ，ＧＵＯＹＣ，ｅｔａｌ．ＯｃｃｕｒｒｅｎｃｅａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｉｎｒｅｔａｉｌｍａｒｉｎｅｓｈｒｉｍｐｉｎＣｈｉｎａ［Ｊ］．Ｆｏｏｄｃｏｎｔｒｏｌ，２０１１，２２（１２）：１９３５－１９４０．［１８］高晶，马力，陈隆升，等．油茶粕制备复合茶皂素清塘剂产品对鱼和虾毒杀效能的研究［Ｊ］．湖南林业科技，２０２１，４８（３）：６１－６８．［１９］王淑生．北方地区南美白对虾 １３５ 二茬分级接续养殖技术［Ｊ］．科学养鱼，２０１９（６）：２９－３０．［２０］田国昌．南美白对虾养殖技术与病害防治措施［Ｊ］．新农业，２０２２（２３）：６１－６２．７７５１卷２４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀钱诗悦等㊀凡纳滨对虾细菌的分离与鉴定。
几种环境因子对IHHNV在凡纳滨对虾体内增殖的影响作者：张丽马文婷姚洪旺李娜包海岩来源：《河北渔业》2023年第11期摘要：为阐明在凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）养殖过程中影响传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）增殖的关键因子，在实验室条件下，研究了温度、盐度、氨氮、亚硝酸盐氮等环境因子变化对凡纳滨对虾体内IHHNV增殖的影响。
结果显示：在同样条件下，水温25 ℃和30 ℃凡纳滨对虾体内IHHNV病毒数具有明显差异，且在30℃时最大；2.5‰、10.0‰、20.0‰三个盐度梯度IHHNV增殖组间差异显著，且增殖速度与盐度呈正相关；在氨氮0.05、3.00、7.00 mg/L三个浓度梯度下，IHHNV在凡纳滨对虾体内增殖数量的变化未表现出线性关系，但氨氮0.05 mg/L浓度组凡纳滨对虾体内病毒数明显低于3.00、7.00 mg/L浓度组；在亚硝酸盐氮0.05、5.00、10.00 mg/L三个浓度梯度下，IHHNV在凡纳滨对虾体内增殖数的变化组间差异不显著。
关键词：凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）；环境因子；传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）；增殖随着凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）养殖业的迅猛发展，养殖疾病逐年增多，造成了极大的经济损失。
环境因子作为养虾池塘生态系统的主要部分，对对虾病毒病的暴发起着重要作用。
环境因子超出对虾的适应范围就会成为胁迫因子，这种胁迫既影响生物体也影响病原体。
养殖环境涉及的胁迫因子包括水质理化因子（温度、盐度、pH、溶解氧、环境污染物等）、生物因子（媒介生物等）。
近年来环境胁迫因子对养殖生物的生理病理影响受到越来越多国内外科研工作者的重视。
已有研究表明：疾病暴发主要是宿主、环境和病原体三者经过复杂的相互作用的结果，在一定环境条件下，宿主与其携带的病原体可以共存，当某些环境条件发生了大的变化，可能会导致疾病的暴发。
第41卷 第5期 渔 业 科 学 进 展Vol.41, No.5 2020年10月Oct., 2020* 山东省自然科学基金项目(ZR2018BC051)和山东省海水养殖病害防治重点实验室开放课题(KF201903)共同资助 [This work was supported by Natural Science Foundation of Shandong Province (ZR2018BC051), and the Open Fund of Shandong Key Laboratory of Disease Control in Mariculture(KF201903)]. 于 鹏，E-mail:******************① 通讯作者：单洪伟，E-mail: *******************.cn 收稿日期: 2019-05-09, 收修改稿日期: 2019-07-02DOI: 10.19663/j.issn2095-9869.20190509001 /于鹏, 叶海斌, 单洪伟, 马甡, 王腾. 凡纳滨对虾养殖体系中群体感应淬灭菌的筛选、安全性评估及发酵条件优化. 渔业科学进展, 2020, 41(5): 82–91Yu P, Ye HB, Shan HW, Ma S, Wang T. Screening, safety evaluation and fermentation conditions optimization of quorum quenching bacteria from Litopenaeus vannamai culture system. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(5): 82–91凡纳滨对虾养殖体系中群体感应淬灭菌的筛选、安全性评估及发酵条件优化*于 鹏1,2 叶海斌2 单洪伟1① 马 甡1 王 腾1(1. 中国海洋大学 海水养殖教育部重点实验室 青岛 266003;2. 山东省海水养殖病害防治重点实验室 山东省海洋生物研究院 青岛 266104)摘要 从凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamai )养殖体系中筛选得到具有群体感应淬灭(Quorum quenching, QQ)活性的潜在功能菌，并对菌株进行16S rDNA 鉴定、安全性评估及发酵条件优化。
虾源哈维氏弧菌的致病性与生物学特性比较分析刘迪;房文红;周红霞;王元;陈甜甜;李健;周俊芳【摘要】哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是导致养殖对虾暴发弧菌病的重要病原之一.从我国南方养殖凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)分离、鉴定了10株哈维氏弧菌(Vh00947、Vh00949、Vh11011、Vh11014、Vh21217、Vh21218、Vh21220、Vh21229、Vh21231和Vh31487),分别肌注感染健康凡纳滨对虾后发现,菌株Vh21229致病性很弱,Vh00949其次,其它菌株毒力较强;对8种哈维氏弧菌常见毒力基因(Vh1、Vh2、Vh3、Vh4、toxS、hcp、zot 和pap6)的检测显示,南方虾源哈维氏弧菌无论强弱毒株都很少携带zot、pap6、toxs和4种Vh基因(≤10％),表明这10个菌株的致病性与这7种常见毒力因子的相关度很低;hcp基因在所有菌株中均有检出,其中强毒株中检出率较高(50％),在较弱毒株(Vh00949)中也存在,表明hcp基因与这些菌株的致病性密切相关,但不是决定性因子.因此,这10株南方虾源哈维氏弧菌菌株的致病性差异应由这8种常见毒力因子以外的未知或未检测到的因子所决定.生化特征分析显示,所有菌株中只有弱毒株Vh21229不能利用D-甘露糖、蔗糖、D-海藻糖,而且只有其赖氨酸脱羧酶反应至阳性,而其它菌株均为阴性,推测导致哈维氏弧菌菌株生化特性改变的某种因子可能对菌株的致病性也产生了影响.药敏实验表明,10株哈维氏弧菌均对环丙沙星、氯霉素、恩诺沙星、美罗培南、头孢曲松、多西环素、头孢吡肟、诺氟沙星敏感,而对氨苄西林耐受性强,表明在虾类养殖过程中应当严格规范和控制抗菌药物尤其是青霉素类药物的使用.%Vibrio harveyi is one of the major pathogens responsible for the shrimp vibriosis.In this study,10 V.harveyi strains(Vh00947,Vh00949,Vh11011,Vh11014,Vh21217,Vh21218,Vh21220,Vh21229 ,Vh21231 and Vh31487) were isolated from Penaeus vannamei in southernChina and identified.The animal infection experiment showed that all the strains were virulent to P.vannamei except Vh21229 and Vh00949.The detection of 8 common virulence genes of V.harveyi(Vh1,Vh2,Vh3,Vh4,toxS,hcp,zot and pap6) showed that these southern China shrimp-derived V.harveyi strains,whether virulent or lentogenic,rarely carried zot,pap6 and 4 Vh virulence genes (≤10％),indicating that the pathogenicity of these 10 strains was in low relation to the 7 common virulence genes.The hcp gene was found in both virulent and lentogenic strains,suggesting that hcp gene is closely related to the pathogenicity of the 10 strains,but not the decisive factor and the pathogenicity of 10 strains was decided by some unknown or undetected factors other than the 8 common virulence factors.The biochemical characteristics analysis showed that in the 10 strains,Vh21229 strain was the only one that was negative for D-mannose,sucrose and D-trehalose while positive for lysine decarboxylase.So it is speculated that the factors altering the biochemical charcteristics of V.harveyi also alter its pathogericity.The drug susceptibility test showed that all the 10 strains were susceptible tociprofloxacin,chloramphenicol,enrofloxacin,meropenem,cefiriaxone,doxycy cline,cefepime and norfloxacin but highly resistant to ampicillin,suggesting that the antimicrobial agents,especially penicillins,should be strictly controlled during the shrimp farming.【期刊名称】《海洋渔业》【年(卷),期】2017(039)002【总页数】9页(P197-205)【关键词】哈维氏弧菌;致病性;毒力基因;药敏实验;生化特征【作者】刘迪;房文红;周红霞;王元;陈甜甜;李健;周俊芳【作者单位】中国水产科学研究院东海水产研究所,农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室,上海200090;上海海洋大学水产与生命学院,上海201306;中国水产科学研究院东海水产研究所,农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室,上海200090;贵州大学动物科学学院,贵阳550025;中国水产科学研究院东海水产研究所,农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室,上海200090;中国水产科学研究院东海水产研究所,农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室,上海200090;上海海洋大学水产与生命学院,上海201306;中国水产科学研究院东海水产研究所,农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室,上海200090;上海海洋大学水产与生命学院,上海201306;中国水产科学研究院东海水产研究所,农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室,上海200090【正文语种】中文【中图分类】Q93-331弧菌病是海水动物养殖中危害最为严重的病害之一[1]。
动物营养学报２０１８ꎬ３０(８):３０８２￣３０９０ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ㊀ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００６￣２６７ｘ.２０１８.０８.０２５小肽对凡纳滨对虾幼虾生长㊁体成分㊁非特异性免疫力及抗病力的影响李日美１㊀申光荣２㊀黄㊀放２㊀杨奇慧１∗㊀谭北平１㊀董晓慧１(１.广东海洋大学水产动物营养与饲料实验室ꎬ湛江５２４０８８ꎻ２.深圳市裕农科技股份有限公司ꎬ深圳５１８１１０)摘㊀要:本试验旨在研究小肽对凡纳滨对虾幼虾生长㊁体成分㊁非特异性免疫力及抗病力的影响ꎮ在基础饲料中分别添加０(对照)㊁０.５％㊁１.０％㊁２.０％㊁４.０％和６.０％的小肽ꎬ共配制６种试验饲料ꎬ分别命名为Ｓ０㊁Ｓ０.５㊁Ｓ１.０㊁Ｓ２.０㊁Ｓ４.０㊁Ｓ６.０ꎮ选取初始体重为(０.１９ʃ０.０１)ｇ的凡纳滨对虾幼虾ꎬ随机分为６组ꎬ每组设３个重复ꎬ每个重复３０尾ꎮ饲养试验持续５６ｄꎮ结果表明:各添加小肽组的增重率(ＷＧＲ)㊁特定生长率(ＳＧＲ)和蛋白质效率(ＰＥＲ)均显著高于对照组(Ｐ<０.０５)ꎬ饲料系数(ＦＣＲ)则显著低于对照组(Ｐ<０.０５)ꎻ各组对虾的存活率无显著差异(Ｐ>０.０５)ꎮ血清中ꎬ酚氧化物酶(ＰＯ)活性在Ｓ１.０和Ｓ２.０组显著高于其他组(Ｐ<０.０５)ꎻ超氧化物歧化酶(ＳＯＤ)活性在Ｓ０.５和Ｓ１.０组显著高于对照组(Ｐ<０.０５)ꎻ酸性磷酸酶(ＡＣＰ)活性在Ｓ１.０和Ｓ２.０组显著高于对照组(Ｐ<０.０５)ꎻ碱性磷酸酶(ＡＫＰ)和溶菌酶(ＬＳＺ)活性各组之间无显著差异(Ｐ>０.０５)ꎻ丙二醛(ＭＤＡ)含量在Ｓ４.０和Ｓ６.０组显著低于其他组(Ｐ<０.０５)ꎮ肝胰腺中ꎬＬＳＺ活性在Ｓ０.５㊁Ｓ２.０和Ｓ４.０组显著高于对照组(Ｐ<０.０５)ꎬ在Ｓ６.０组则显著低于对照组(Ｐ<０.０５)ꎻＳＯＤ活性各组之间无显著差异(Ｐ>０.０５)ꎻＡＣＰ活性在Ｓ０.５和Ｓ１.０组较高ꎬ但与对照组差异不显著(Ｐ>０.０５)ꎻＡＫＰ活性在Ｓ４.０组显著低于对照组(Ｐ<０.０５)ꎻＭＤＡ含量在各小肽添加组均显著低于对照组(Ｐ<０.０５)ꎬ同时Ｓ４.０组还显著低于Ｓ６.０组(Ｐ<０.０５)ꎮ通过哈维氏弧菌攻毒试验发现ꎬ小肽添加量为０.５％~４.０％的组凡纳滨对虾幼虾攻毒７ｄ后的累积死亡率显著低于对照组(Ｐ<０.０５)ꎬ但小肽添加量为６.０％的组则与对照组无显著差异(Ｐ>０.０５)ꎮ综上所述ꎬ饲料中添加１.０％~２.０％的小肽可促进凡纳滨对虾幼虾的生长ꎬ提高其非特异性免疫力及抗病力ꎮ关键词:小肽ꎻ凡纳滨对虾ꎻ生长ꎻ非特异性免疫力ꎻ抗病力中图分类号:Ｓ９６３㊀㊀㊀㊀文献标识码:Ａ㊀㊀㊀㊀文章编号:１００６￣２６７Ｘ(２０１８)０８￣３０８２￣０９收稿日期:２０１８－０１－１５基金项目:广东省科技厅社会发展领域科技计划项目(２０１３Ｂ０２１１０００１７)ꎻ海洋高效微生态制剂的开发利用与产业化(２０１３Ｂ０２１１０００)ꎻ深圳裕农生物技术有限公司资助项目(Ｂ１６２４４)作者简介:李日美(１９９２ )ꎬ女ꎬ广东湛江人ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为水产动物营养与饲料ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｌｉｒｉｍｅｉ２０１７＠１６３.ｃｏｍ∗通信作者:杨奇慧ꎬ教授ꎬ硕士生导师ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｑｉｈｕｉｙａｎｇ０３＠１６３.ｃｏｍ㊀㊀凡纳滨对虾(Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ)又称南美白对虾ꎬ别名白脚对虾㊁凡纳对虾ꎬ原产于厄瓜多尔ꎬ生活在热带㊁亚热带㊁暖温带和温带海域[１]ꎮ凡纳滨对虾是当前世界上养殖产量最高的三大优良品种之一ꎬ它具有生长快㊁抗病能力强㊁养殖经济效益显著㊁环境适应能力强㊁肉质鲜美等优点ꎬ是华南地区主要的对虾养殖品种ꎮ然而ꎬ在对虾养殖过程中ꎬ随着集约化养殖程度的提高ꎬ环境污染等问题造成养殖水质变差ꎻ鱼粉价格提高ꎬ饲料中鱼粉含量和蛋白质水平的不断降低ꎬ严重影响了对虾的生长ꎬ还导致了疾病频发等问题ꎮ因此ꎬ促进对虾生长及提高其免疫力和抗病力的研究成为关注热点ꎮ㊀㊀小肽ꎬ也称寡肽㊁微肽㊁短肽ꎬ一般是指由２个以上氨基酸组成的寡肽ꎬ来源主要有天然及通过８期李日美等:小肽对凡纳滨对虾幼虾生长㊁体成分㊁非特异性免疫力及抗病力的影响水解蛋白质获得[２]ꎮ研究表明ꎬ蛋白质在消化道中的消化终产物往往大部分是小肽而非游离氨基酸ꎬ小肽可完整地被吸收并以二㊁三肽形式进入血液循环[３]ꎮ小肽作为一种优质蛋白质对水产动物的促生长效应早有研究ꎮ研究指出ꎬ小肽能促进凡纳滨对虾[４]㊁草鱼(Ｃｔｅｎｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎｉｄｅｌｌｕｓ)[５]和幼建鲤(Ｃｙｐｒｉｎｕｓｃａｒｐｉｏｖａｒ.Ｊｉａｎ)[６]等的生长ꎮ本试验在前人研究小肽促凡纳滨对虾生长的基础上ꎬ通过添加不同比例小肽提高饲料蛋白质水平的同时ꎬ将小肽作为一种免疫增强剂ꎬ研究小肽对凡纳滨对虾非特异性免疫力和抗病力的影响ꎬ为水产饲料中小肽的应用提供理论依据与科学参考ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验饲料与试验设计㊀㊀基础饲料以鱼粉㊁豆粕㊁花生粕等为蛋白质源ꎬ鱼油和磷脂油等为脂肪源ꎬ并添加维生素和矿物元素预混料配制而成ꎮ在基础饲料中分别添加０(对照)㊁０.５％㊁１.０％㊁２.０％㊁４.０％和６.０％的小肽ꎬ共配制６种试验饲料ꎬ分别命名为Ｓ０㊁Ｓ０.５㊁Ｓ１.０㊁Ｓ２.０㊁Ｓ４.０㊁Ｓ６.０ꎮ试验饲料组成及营养水平见表１ꎮ试验所用小肽来源于微生物产酶分解的豆粕蛋白质ꎬ分子质量ɤ５０００ｕꎬ由深圳裕农生物技术有限公司提供ꎮ各种饲料原料粉碎后过８０目筛ꎬ按饲料配方准确称量ꎬ微量成分采取逐级扩大法添加ꎬ与大宗原料混合均匀后ꎬ用双螺杆制粒机挤压成１.０和１.５ｍｍ２种粒径的颗粒饲料ꎬ经６０ħ熟化３０ｍｉｎ后风干ꎬ置于封口袋中封存ꎬ于－２０ħ冰箱保存待用ꎮ１.２㊀试验动物与饲养管理㊀㊀养殖试验在广东海洋大学东海岛海洋生物研究基地室内养殖系统内进行ꎮ㊀㊀试验凡纳滨对虾虾苗购于湛江市中联养殖有限公司ꎬ购回后在室外水泥池暂养３周ꎮ挑选大小均匀㊁体格健康㊁初重为(０.１９ʃ０.０１)ｇ的凡纳滨对虾幼虾５４０尾ꎬ随机分成６组ꎬ每组设３个重复ꎬ每个重复３０尾虾ꎬ以重复为单位饲养于容积为０.３ｍ３的玻璃纤维桶中ꎬ养殖试验持续５６ｄꎮ投喂量按照体重的８％~１０％计算ꎬ分别于０７:００㊁１１:００㊁１７:００㊁２１:００各投喂１次ꎻ投喂１ｈ后观察摄食情况ꎬ根据天气㊁水质等情况适当调整投喂量ꎮ试验初期隔天换水ꎬ养殖试验结束前２周每天换水ꎬ换水量为总水量的１/３~１/２ꎬ试验期间连续充氧ꎬ溶解氧浓度>６.７ｍｇ/Ｌꎬ水温为２８.４~３１.２ħꎬ盐度为２６~２８ꎬｐＨ为７.８~８.２ꎬ氨氮浓度<０.０３ｍｇ/Ｌꎮ表１㊀试验饲料组成及营养水平(干物质基础)Ｔａｂｌｅ１㊀Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄｎｕｔｒｉｅｎｔｌｅｖｅｌｓｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｉｅｔｓ(ＤＭｂａｓｉｓ)％项目Ｉｔｅｍｓ饲料ＤｉｅｔｓＳ０Ｓ０.５Ｓ１.０Ｓ２.０Ｓ４.０Ｓ６.０原料Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ红鱼粉Ｂｒｏｗｎｆｉｓｈｍｅａｌ２２.０２２.０２２.０２２.０２２.０２２.０豆粕Ｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌ１５.０１５.０１５.０１５.０１５.０１５.０花生粕Ｐｅａｎｕｔｍｅａｌ１０.０１０.０１０.０１０.０１０.０１０.０小麦面粉Ｗｈｅａｔｆｌｏｕｒ２０.０２０.０２０.０２０.０２０.０２０.０玉米蛋白粉Ｃｏｒｎｇｌｕｔｅｎｍｅａｌ１０.０１０.０１０.０１０.０１０.０１０.０虾壳粉Ｓｈｒｉｍｐｓｈｅｌｌｍｅａｌ６.０６.０６.０６.０６.０６.０鱼油Ｆｉｓｈｏｉｌ２.０２.０２.０２.０２.０２.０大豆卵磷脂Ｓｏｙｂｅａｎｌｅｃｉｔｈｉｎ２.０２.０２.０２.０２.０２.０维生素预混料Ｖｉｔａｍｉｎｐｒｅｍｉｘ１)１.０１.０１.０１.０１.０１.０稳定维生素ＣＳｔａｙ￣ｖｉｔａｍｉｎＣ(３５％)０.１０.１０.１０.１０.１０.１氯化胆碱Ｃｈｏｌｉｎｅｃｈｌｏｒｉｄｅ０.５０.５０.５０.５０.５０.５矿物质预混料Ｍｉｎｅｒａｌｐｒｅｍｉｘ２)１.０１.０１.０１.０１.０１.０磷酸二氢钙Ｃａ(Ｈ２ＰＯ４)２２.０２.０２.０２.０２.０２.０微晶纤维素Ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅｃｅｌｌｕｌｏｓｅ８.４７.９７.４６.４４.４２.４３８０３㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３０卷续表１项目Ｉｔｅｍｓ饲料ＤｉｅｔｓＳ０Ｓ０.５Ｓ１.０Ｓ２.０Ｓ４.０Ｓ６.０小肽Ｓｍａｌｌｐｅｐｔｉｄｅｓ０.５１.０２.０４.０６.０合计Ｔｏｔａｌ１００.０１００.０１００.０１００.０１００.０１００.０营养水平Ｎｕｔｒｉｅｎｔｌｅｖｅｌｓ粗蛋白质Ｃｒｕｄｅｐｒｏｔｅｉｎ３８.３７３８.２６３８.３６３８.６１３９.９７４０.２４粗脂肪Ｃｒｕｄｅｌｉｐｉｄ７.４８７.９１７.９０８.０５７.６６７.７６粗灰分Ｃｒｕｄｅａｓｈ９.７７９.７３９.７９９.９９.５７９.７４水分Ｍｏｉｓｔｕｒｅ７.８６７.７７.７８７.８２７.６６７.７６㊀㊀１)每千克维生素预混料含有Ｃｏｎｔａｉｎｅｄｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｐｅｒｋｇｏｆｖｉｔａｍｉｎｐｒｅｍｉｘ:盐酸硫胺素ｔｈｉａｍｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ２５.５０ｇꎬ核黄素ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ２５.００ｇꎬ盐酸吡哆醇ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ５０.００ｇꎬＶＢ１２０.１０ｇꎬＶＫ５.００ｇꎬＶＥ９９.００ｇꎬ维生素Ａ醋酸酯ｒｅｔｉｎｙｌａｃｅｔａｔｅ１０.００ｇꎬＶＤ５０ｇꎬ烟酸ｎｉｃｏｔｉｎｉｃａｃｉｄ１０１.００ｇꎬＤ－泛酸钙Ｄ￣ｃａｌｃｉｕｍ￣ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ６１.００ｇꎬ生物素ｂｉｏｔｉｎ２５.００ｇꎬ叶酸ｆｏｌｉｃａｃｉｄ６.２５ｇꎬ肌醇ｉｎｏｓｉｔｏｌ１５３.０６ｇꎬ纤维素ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ３８９.０９ｇꎮ㊀㊀２)每千克矿物质预混料含有Ｃｏｎｔａｉｎｅｄｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｐｅｒｋｇｏｆｍｉｎｅｒａｌｐｒｅｍｉｘ:ＦｅＣ６Ｈ５Ｏ７１３.７１ｇꎬＺｎＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ２８.２８ｇꎬＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ０.１２ｇꎬＭｎＳＯ４ Ｈ２Ｏ１２.４３ｇꎬＣｕＳＯ４ ５Ｈ２Ｏ１９.８４ｇꎬＣｏＣｌ２ ７Ｈ２Ｏ４.０７ｇꎬＫＩ０.０３ｇꎬＫＣｌ１５.３２ｇꎬＮａＳｅＯ３０.０２ｇꎬ沸石粉ｚｅｏｌｉｔｅｐｏｗｅｒ９０６.１８ｇꎮ１.３㊀样品采集㊀㊀养殖试验结束后禁食２４ｈꎬ以重复为单位计数并称重ꎮ每重复随机选取５尾对虾ꎬ用吸水纸吸干体表水分后置于－２０ħ冰箱中冷冻保存ꎬ用于全虾常规营养成分分析ꎮ每重复另随机选取１０尾对虾ꎬ用１ｍＬ无菌注射器从围心腔抽血ꎬ将１０尾对虾的血液合并为１个样本置于１.５ｍＬ的离心管中ꎬ４ħ冰箱静置过夜ꎬ在４０００ｒ/ｍｉｎ条件下离心１０ｍｉｎꎬ吸取上清液分装后置于－８０ħ冰箱中冷冻保存ꎬ用于血清非特异性免疫指标的检测ꎮ每重复再随机选取２~３尾对虾ꎬ取肝胰腺ꎬ用滤纸吸干表面水分后准确称重ꎮ按照重量(ｇ)ʒ体积(ｍＬ)＝１ʒ９的比例加入９倍体积生理盐水ꎬ剪碎肝胰腺ꎬ冰水浴制备匀浆ꎬ２５００~３０００ｒ/ｍｉｎꎬ离心１０ｍｉｎꎬ取上清液分装后置于－８０ħ冰箱中冷冻保存ꎬ用于肝胰腺非特异性免疫指标的检测ꎮ１.４㊀指标测定１.４.１㊀饲料及全虾常规营养成分分析㊀㊀参照ＡＯＡＣ(１９９５)[７]的方法测定饲料及全虾样品中水分㊁粗蛋白质㊁粗脂肪㊁粗灰分和总磷含量ꎮ采用恒温烘箱１０５ħ烘干至恒重测定水分含量ꎻ采用凯氏定氮法(ＫｊｅｌｔｅｃＴＭ８４００ꎬ瑞典)测定粗蛋白质含量ꎻ采用索氏抽提法(石油醚作为提取溶剂)测定粗脂肪含量ꎻ采用５５０ħ马弗炉灰化法测定粗灰分含量ꎻ采用比色法测定总磷含量ꎮ１.４.２㊀血清和肝胰腺中非特异性免疫指标的测定㊀㊀血清和肝胰腺中溶菌酶(ＬＳＺ)活性的测定采用比浊法ꎬ超氧化物歧化酶(ＳＯＤ)活性的测定采用ＷＳＴ￣１法ꎬ丙二醛(ＭＤＡ)含量的测定采用微板法ꎬ酸性磷酸酶(ＡＣＰ)活性的测定采用微板法ꎬ碱性磷酸酶(ＡＫＰ)活性的测定采用微板法ꎬ上述指标均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定ꎬ试验步骤按照试剂盒说明书操作ꎮ血清中酚氧化物酶(ＰＯ)活性测定参照Ａｓｈｉｄａ[８]的方法进行ꎮ１.５㊀哈维氏弧菌(Ｖｉｂｒｉｏｈａｒｖｅｙｉ)攻毒试验㊀㊀攻毒试验所用哈维氏弧菌菌种由广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点试验室提供ꎮ养殖试验结束后ꎬ每个重复随机选取１０尾虾用于攻毒试验ꎬ通过预试验确定哈维氏弧菌对凡纳滨对虾的半致死浓度(ＬＤ５０)(７ｄ)为１.９６ˑ１０７ＣＦＵ/ｍＬꎬ取３０μＬ此浓度哈维氏弧菌菌液注射于对虾第２~３腹节背部ꎮ统计对虾攻毒后７ｄ的死亡数量ꎬ计算累积死亡率(ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅｍｏｒｔａｌｉｔｙｒａｔｅꎬＣＭＲ)ꎮ１.６㊀计算公式存活率(ｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅꎬＳＲꎬ％)＝１００ˑ终末尾数/初始尾数ꎻ增重率(ｗｅｉｇｈｔｇａｉｎｒａｔｅꎬＷＧＲꎬ％)＝１００ˑ(终末均重－初始均重)/初始均重ꎻ特定生长率(ｓｐｅｃｉａｌｇｒｏｗｔｈｒａｔｅꎬＳＧＲꎬ％/ｄ)＝４８０３８期李日美等:小肽对凡纳滨对虾幼虾生长㊁体成分㊁非特异性免疫力及抗病力的影响１００ˑ(ｌｎ终末均重－ｌｎ初始均重)/饲喂天数ꎻ蛋白质效率(ｐｒｏｔｅｉｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｒａｔｉｏꎬＰＥＲ)＝(终末体重－初始体重)/蛋白质摄入量ꎻ饲料系数(ｆｅｅｄｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｒａｔｅꎬＦＣＲ)＝摄食饲料干重/(终末体重－初始体重)ꎻ累积死亡率(％)＝１００ˑ累计死亡尾数/初始尾数ꎮ１.７㊀数据处理与分析㊀㊀试验数据以平均值ʃ标准差(ｍｅａｎʃＳＤ)表示ꎬ使用ＳＰＳＳ１７.０软件进行单因素方差分析(ｏｎｅ￣ｗａｙＡＮＯＶＡ)ꎬ组间若存在显著性差异ꎬ则再采用Ｄｕｎｃａｎ氏法进行多重比较检验ꎮ以Ｐ<０.０５作为差异显著性判断标准ꎮ２㊀结㊀果２.１㊀小肽对凡纳滨对虾幼虾生长性能的影响㊀㊀由表２可知ꎬ各添加小肽组(Ｓ０.５㊁Ｓ１.０㊁Ｓ２.０㊁Ｓ４.０㊁Ｓ６.０组)终末均重显著高于不添加小肽的对照组(Ｓ０组)(Ｐ<０.０５)ꎻ各添加小肽组的增重率㊁特定生长率和蛋白质效率均显著高于对照组(Ｐ<０.０５)ꎬ同时饲料系数显著低于对照组(Ｐ<０.０５)ꎻ各组凡纳滨对虾幼虾的存活率无显著差异(Ｐ>０.０５)ꎮ表２㊀小肽对凡纳滨对虾幼虾生长性能的影响Ｔａｂｌｅ２㊀ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｓｍａｌｌｐｅｐｔｉｄｅｓｏｎｇｒｏｗｔｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｏｆｊｕｖｅｎｉｌｅＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ(ｎ＝３)组别Ｇｒｏｕｐｓ初始均重ＩＢＷ/ｇ终末均重ＦＢＷ/ｇ存活率ＳＲ/％增重率ＷＧＲ/％特定生长率ＳＧＲ/(％/ｄ)蛋白质效率ＰＥＲ饲料系数ＦＣＲＳ００.１９ʃ０.０１８.４５ʃ０.６４ａ９３.３４ʃ４.７２４４６７.５６ʃ３４４.００ａ６.５９ʃ０.１３ａ１.１８ʃ０.１４ａ２.２２ʃ０.２８ｂＳ０.５０.１９ʃ０.００１３.２４ʃ０.０４ｂｃ９８.３４ʃ２.３５７０５６.７６ʃ２２.９３ｂｃ７.３６ʃ０.０１ｂ１.９４ʃ０.１４ｃ１.３４ʃ０.０７ａＳ１.００.１９ʃ０.０１１２.９４ʃ０.０９ｂｃ１００.００ʃ０.００６８９１.８９ʃ４９.６９ｂｃ７.３２ʃ０.００ｂ１.９５ʃ０.０１ｃ１.３３ʃ０.０１ａＳ２.００.１９ʃ０.００１２.５２ʃ０.７３ｂｃ９５.００ʃ２.３６６６６４.８７ʃ３９３.６８ｂｃ７.２６ʃ０.１５１.９１ʃ０.００ｃ１.３５ʃ０.０１ａＳ４.００.１９ʃ０.０１１２.２５ʃ０.３５ｂ９０.００ʃ９.４０６５２１.６２ʃ１９１.１１ｂ７.２９ʃ０.０５ｂ１.５９ʃ０.１２ｂ１.５７ʃ０.１２ａＳ６.００.１９ʃ０.０１１３.４２ʃ０.３１ｃ９８.３４ʃ２.３５７１５４.０６ʃ１６８.１７ｃ７.３８ʃ０.０４ｂ１.８６ʃ０.０４ｃ１.３３ʃ０.０３ａ㊀㊀同列数据肩标不同字母表示显著差异(Ｐ<０.０５)ꎮ下表同ꎮ㊀㊀Ｖａｌｕｅｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｌｉｎｅｄｉｆｆｅｒｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ(Ｐ<０.０５).Ｔｈｅｓａｍｅａｓｂｅｌｏｗ.２.２㊀小肽对凡纳滨对虾幼虾体成分的影响㊀㊀由表３可知ꎬ全虾的水分含量各组之间无显著差异(Ｐ>０.０５)ꎻＳ１.０㊁Ｓ２.０㊁Ｓ４.０和Ｓ６.０组全虾的粗蛋白质含量均显著高于对照组(Ｐ<０.０５)ꎬＳ０.５组与对照组无显著差异(Ｐ>０.０５)ꎻＳ２.０和Ｓ４.０组全虾粗脂肪含量与对照组差异不显著(Ｐ>０.０５)ꎬ但Ｓ０.５㊁Ｓ１.０和Ｓ６.０组显著高于对照组(Ｐ<０.０５)ꎻＳ０.５组全虾粗灰分含量显著低于对照组(Ｐ<０.０５)ꎬＳ２.０㊁Ｓ４.０和Ｓ６.０组显著高于对照组(Ｐ<０.０５)ꎬＳ１.０与对照组无显著差异(Ｐ>０.０５)ꎻＳ０.５和Ｓ４.０组全虾的总磷含量显著低于对照组(Ｐ<０.０５)ꎬ其他组与对照组无显著差异(Ｐ>０.０５)ꎮ表３㊀小肽对凡纳滨对虾幼虾体成分的影响(干物质基础)Ｔａｂｌｅ３㊀ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｓｍａｌｌｐｅｐｔｉｄｅｓｏｎｂｏｄｙｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｊｕｖｅｎｉｌｅＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ(ＤＭｂａｓｉｓ)(ｎ＝３)％组别Ｇｒｏｕｐｓ水分Ｍｏｉｓｔｕｒｅ粗蛋白质Ｃｒｕｄｅｐｒｏｔｅｉｎ粗脂肪Ｃｒｕｄｅｌｉｐｉｄ粗灰分Ａｓｈ总磷ＴｏｔａｌｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓＳ０７５.５８ʃ１.３９７５.５８ʃ０.８３ａ５.８５ʃ０.０３ａｂ１３.０８ʃ０.０８ｂ１.２１ʃ０.０２ｃＳ０.５７５.２２ʃ１.４９７５.３５ʃ０.１４ａｂ８.５０ʃ０.６９ｄ１２.６０ʃ０.０４ａ１.０８ʃ０.０１ａＳ１.０７５.８３ʃ１.４１７６.５２ʃ０.０８ｃ７.２７ʃ０.２８ｃｄ１３.１７ʃ０.００ｂ１.１８ʃ０.００ｃＳ２.０７５.７９ʃ０.４７７５.８６ʃ０.１７ｂｃ６.２８ʃ０.００ｂｃ１３.８２ʃ０.０１ｄ１.２１ʃ０.０２ｃＳ４.０７６.５０ʃ０.４７７６.６１ʃ０.３２ｃ４.８２ʃ０.６１ａ１４.３９ʃ０.０１ｅ１.１２ʃ０.０１ｂＳ６.０７５.２３ʃ５.０４７５.９５ʃ０.６２ｂｃ７.３５ʃ０.７８ｃｄ１３.３６ʃ０.０４ｃ１.２２ʃ０.００ｃ５８０３㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３０卷２.３㊀小肽对凡纳滨对虾幼虾血清非特异性免疫指标的影响㊀㊀由表４可知ꎬＬＳＺ活性各组之间无显著差异(Ｐ>０.０５)ꎻ随着小肽添加量的增加ꎬＰＯ活性呈现出先上升后下降趋势ꎬ以Ｓ２.０组最高ꎬＳ２.０组次之ꎬ二者显著高于其他组(Ｐ<０.０５)ꎻＳ０.５和Ｓ１.０组ＳＯＤ活性显著高于对照组和Ｓ４.０组(Ｐ<０.０５)ꎬＳ０.５组还显著高于Ｓ２.０组(Ｐ<０.０５)ꎬ其余各组间无显著差异(Ｐ>０.０５)ꎻＳ１.０和Ｓ２.０组ＡＣＰ活性显著高于其他组(Ｐ<０.０５)ꎻＡＫＰ活性各组之间无显著差异(Ｐ>０.０５)ꎬ但各添加小肽组在数值上均高于对照组ꎻＳ４.０和Ｓ６.０组ＭＤＡ含量显著低于其他组(Ｐ<０.０５)ꎬＳ４.０组显著低于Ｓ６.０组(Ｐ<０.０５)ꎮ表４㊀小肽对凡纳滨对虾幼虾血清非特异性免疫指标的影响Ｔａｂｌｅ４㊀Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｍａｌｌｐｅｐｔｉｄｅｓｏｎｓｅｒｕｍｎｏｎ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｍｍｕｎｅｉｎｄｅｘｅｓｏｆｊｕｖｅｎｉｌｅＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ(ｎ＝３)组别Ｇｒｏｕｐｓ溶菌酶ＬＳＺ/(Ｕ/ｍＬ)酚氧化物酶ＰＯ/(Ｕ/ｍＬ)超氧化物歧化酶ＳＯＤ/(Ｕ/ｍＬ)酸性磷酸酶ＡＣＰ/(金氏单位/ｄＬ)碱性磷酸酶ＡＫＰ/(金氏单位/ｄＬ)丙二醛ＭＤＡ/(ｎｍｏｌ/ｍＬ)Ｓ０５０.００ʃ７.１４６６１.１１ʃ１３８.５３ａ１１９０.６４ʃ４９.２８ａ８.１７ʃ２.０７ａ３.１７ʃ３.２２１９.４２ʃ１.０２ｃＳ０.５６１.９０ʃ３５.９５５９７.２２ʃ６４.７３ａ１４７１.５３ʃ５３.７５ｃ８.９２ʃ０.４６ａ６.４０ʃ１.８５１６.９６ʃ０.４１ｃＳ１.０６４.２９ʃ７.１４９９４.４４ʃ７８.７６ｂ１４１０.００ʃ１９.３５ｂｃ１３.５２ʃ０.１２ｂ６.６１ʃ０.６７１８.１９ʃ２.１５ｃＳ２.０５２.３８ʃ８.２５１９１１.１１ʃ４５.８９ｃ１２７２.００ʃ１３７.４６ａｂ１２.３７ʃ０.７３ｂ６.３７ʃ５.３６１７.４３ʃ０.８４ｃＳ４.０５４.７６ʃ１４.８７６２７.７８ʃ６０.２８ａ１２１４.１４ʃ１６.４３ａ８.４３ʃ０.５０ａ５.０６ʃ０.８５１３.０３ʃ０.９３ｂＳ６.０７３.８１ʃ８.２５６２７.７８ʃ１２.７３ａ１３０７.７２ʃ１３.６３ａｂｃ９.６１ʃ０.４６ａ４.８０ʃ０.９３９.６７ʃ０.０９ａ２.４㊀小肽对凡纳滨对虾幼虾肝胰腺非特异性免疫指标的影响㊀㊀由表５可知ꎬＬＳＺ活性ꎬＳ０.５㊁Ｓ２.０和Ｓ４.０组显著高于对照组(Ｐ<０.０５)ꎬＳ６.０组则显著低于对照组(Ｐ<０.０５)ꎻＳＯＤ活性ꎬ各组间无显著差异(Ｐ>０.０５)ꎻＡＣＰ活性ꎬ各小肽添加组与对照组无显著差异(Ｐ>０.０５)ꎬ但Ｓ０.５和Ｓ１.０组显著高于Ｓ２.０和Ｓ４.０组(Ｐ<０.０５)ꎻＡＫＰ活性ꎬＳ４.０组显著低于对照组(Ｐ<０.０５)ꎬ其余各组之间无显著差异(Ｐ>０.０５)ꎻＭＤＡ含量ꎬ各小肽添加组均显著低于对照组(Ｐ<０.０５)ꎬ同时Ｓ４.０组还显著低于Ｓ６.０组(Ｐ<０.０５)ꎮ表５㊀小肽对凡纳滨对虾幼虾肝胰腺非特异性免疫指标的影响Ｔａｂｌｅ５㊀Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｍａｌｌｐｅｐｔｉｄｅｓｏｎｈｅｐａｔｏｐａｎｃｒｅａｓｎｏｎ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｍｍｕｎｅｉｎｄｅｘｅｓｏｆｊｕｖｅｎｉｌｅＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ(ｎ＝３)组别Ｇｒｏｕｐｓ溶菌酶ＬＳＺ/(Ｕ/ｍｇｐｒｏｔ)超氧化物歧化酶ＳＯＤ/(Ｕ/ｍｇｐｒｏｔ)酸性磷酸酶ＡＣＰ/(金氏单位/ｇｐｒｏｔ)碱性磷酸酶ＡＫＰ/(金氏单位/ｇｐｒｏｔ)丙二醛ＭＤＡ/(ｎｍｏｌ/ｍｇｐｒｏｔ)Ｓ０１０.０７ʃ０.９５ｂ４０.９７ʃ７.４５４９８.０５ʃ５６.３５ａｂ２６７.１９ʃ４３.９９ｂ３.５４ʃ０.１４ｃＳ０.５１２.７４ʃ０.２３ｃ４５.６１ʃ５.４０５７６.８５ʃ１４２.１３ｂ２５４.５８ʃ５６.５１ｂ１.９５ʃ０.１５ａｂＳ１.０１１.２４ʃ０.１２ｂｃ３９.０７ʃ７.４７６５８.６４ʃ１９２.０３ｂ２５９.５５ʃ７６.０３ｂ２.１９ʃ０.６１ａｂＳ２.０１２.４４ʃ１.４６ｃ３７.０５ʃ７.５０３６１.７６ʃ６２.１３ａ２５３.５８ʃ７５.７２ｂ１.９７ʃ０.２５ａｂＳ４.０１６.０７ʃ０.９７ｄ３５.８０ʃ３.６５３３２.８４ʃ８５.３３ａ１２６.３０ʃ３６.０５ａ１.６０ʃ０.１５ａＳ６.０７.９３ʃ０.０９ａ３７.８９ʃ０.６８４９１.５３ʃ５５.４３ａｂ３２２.９４ʃ１５.４５ｂ２.４９ʃ０.０６ｂ２.５㊀小肽对凡纳滨对虾幼虾哈维氏弧菌攻毒后累积死亡率的影响㊀㊀凡纳滨对虾幼虾经哈维氏弧菌攻毒后累积死亡率的变化趋势如图１所示ꎮ图２显示ꎬ小肽添加量为０.５％㊁１.０％㊁２.０％和４.０％时ꎬ凡纳滨对虾幼虾哈维氏弧菌攻毒后７ｄ的累积死亡率显著低于对照组(Ｐ<０.０５)ꎻ小肽添加量为６.０％时ꎬ凡纳滨对虾幼虾哈维氏弧菌攻毒后７ｄ的累积死亡率与对照组无显著差异(Ｐ>０.０５)ꎮ６８０３８期李日美等:小肽对凡纳滨对虾幼虾生长㊁体成分㊁非特异性免疫力及抗病力的影响图１㊀小肽对凡纳滨对虾幼虾哈维氏弧菌攻毒后累积死亡率的影响Ｆｉｇ.１㊀ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｓｍａｌｌｐｅｐｔｉｄｅｓｏｎＣＭＲｏｆｊｕｖｅｎｉｌｅＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉａｆｔｅｒｃｈａｌｌｅｎｇｅｄｂｙＶｉｂｒｉｏｈａｒｖｅｙｉ㊀㊀数据柱标注不同字母表示显著差异(Ｐ<０.０５)ꎮ㊀㊀Ｖａｌｕｅｃｏｌｕｍｎｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｄｉｆｆｅｒｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ(Ｐ<０.０５).图２㊀凡纳滨对虾幼虾哈维氏弧菌攻毒后７ｄ的累积死亡率Ｆｉｇ.２㊀ＣＭＲｏｆ７ｄａｙｓｆｏｒｊｕｖｅｎｉｌｅＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉａｆｔｅｒｃｈａｌｌｅｎｇｅｄｂｙＶｉｂｒｉｏｈａｒｖｅｙｉ３㊀讨㊀论３.１㊀小肽对凡纳滨对虾幼虾生长和体成分的影响㊀㊀小肽由２个以上氨基酸组成ꎬ有些是天然的ꎬ有些则是由蛋白质水解产生ꎮ小肽作为蛋白质主要消化产物ꎬ在氨基酸的消化㊁吸收及动物营养代谢中起重要作用ꎮ在水产养殖中ꎬ饲料中适当添加小肽能够增强水产动物的免疫力ꎬ提高存活率和增重率以及饲料利用率ꎮ本试验结果表明ꎬ饲料中添加小肽能够促进凡纳滨对虾幼虾生长ꎬ这一试验结果与林启存等[４]的研究结果一致ꎮ另外ꎬＴｅｔｓｈｉｍａ等[９]研究发现ꎬ小肽对对虾幼苗具有显著的促生长作用ꎮ于辉等[１０]㊁冯健等[５]在对草鱼的研究中发现小肽能够提高饲料的消化率ꎬ具有促生长作用ꎮ同样ꎬ在幼建鲤[６]和欧洲鳗鲡(Ａｎｇｕｉｌｌａａｎｇｕｉｌｌａ)[１１]的研究中也发现小肽具有促生长作用ꎮ㊀㊀小肽与游离氨基酸都是蛋白质酶解后得到的产物ꎬ但是两者的吸收存在着２种相互独立的转运机制[１２]ꎮ游离氨基酸的吸收是由肠细胞主动转运ꎬ是逆浓度转运ꎬ通过不同的钠离子(Ｎａ＋)转运系统进行[１３]ꎮ小肽则是不经过降解直接被肠壁吸收转运进入血液循环ꎮ肠道黏膜上有小肽的转运载体ꎬ与游离氨基酸的吸收相比ꎬ小肽转运系统具有转运速度快㊁耗能低㊁不易饱和的特点[１４]ꎮ研究表明ꎬ小肽被直接吸收后ꎬ能够参与机体的生理活动和代谢调节ꎬ提高蛋白质沉积ꎬ从而促进机体的生长性能ꎮ㊀㊀本试验结果显示ꎬ饲料中添加小肽可显著影响凡纳滨对虾幼虾全虾的粗蛋白质㊁粗脂肪㊁粗灰分和总磷含量ꎬ但对水分含量无显著影响ꎮ关于添加小肽对机体成分的影响ꎬ在鱼类中有相关的报道ꎬ其中ꎬ对西伯利亚鲟(ＡｃｉｐｅｎｓｅｒｂａｅｒｉｉＢｒａｎｄｔ)的研究发现ꎬ小肽替代饲料中鱼粉对全鱼水分㊁粗蛋白质㊁粗脂肪和粗灰分含量无显著影响[１５]ꎬ在对异育银鲫(Ｃａｒａｓｓｉｕｓａｕｒａｔｕｓｇｉｂｅ￣ｌｉｏ)[１６]的研究中也有相似的发现ꎬ与本试验结果存在差异ꎬ这可能是由于不同种类的水产动物ꎬ小肽所产生的体成分的沉积能力有差异所致ꎮ３.２㊀小肽对凡纳滨对虾幼虾非特异性免疫力及抗病力的影响㊀㊀小肽是一类分子质量较小㊁结构较为松散的具有多种生物功能的生物肽ꎮ这些由蛋白质水解所产生的小肽具有一定的免疫功能ꎮ因此小肽是一种重要的免疫增强剂ꎬ添加小肽能够提高水产动物的非特异性免疫酶活性ꎮ㊀㊀ＬＳＺ作为对虾非特异性免疫因子ꎬ参与机体多种免疫反应ꎬ能改善和增强巨噬细胞吞噬能力和消化功能ꎬ从一定程度上提高对虾的生长率和存活率[１７]ꎮ本试验结果表明ꎬ各添加小肽组血清中ＬＳＺ活性与对照组相比虽然无显著差异ꎬ但在７８０３㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３０卷数值上均高于对照组ꎻ饲料中添加０.５％~４.０％的小肽显著提高凡纳滨对虾肝胰腺中ＬＳＺ活性ꎮ许培玉等[１７]的研究发现ꎬ饲料中添加１.５％的小肽可提高凡纳滨对虾肌肉和头部ＬＳＺ活性ꎮ㊀㊀ＳＯＤ是机体清除氧自由基的重要酶系[１８]ꎬ对机体的氧化和抗氧化平衡起重要作用[１９－２０]ꎬ其活性高低可间接反映机体清除氧自由基的能力ꎮ本试验结果表明ꎬ饲料中添加０.５％~１.０％的小肽可显著提高凡纳滨对虾幼虾血清中ＳＯＤ活性ꎬ但对肝胰腺中ＳＯＤ活性则无显著影响ꎮ㊀㊀ＰＯ是一种反映机体免疫状态的具有异物识别作用的防御酶ꎬ在甲壳动物体内以酶原的形式存在ꎬ外来病原入侵和环境胁迫时酶原激活进行免疫识别与防疫[２１]ꎮ本试验中ꎬ血清中ＰＯ活性随着小肽添加量的增加呈现出先上升在下降的趋势ꎬＳ１.０和Ｓ２.０组显著高于其他组ꎮ王秀华等[２２]研究表明ꎬ通过添加小肽类制剂对凡纳滨对虾体液免疫能产生影响ꎬ可显著提高对虾血清中ＰＯ活性ꎬ本试验结果与该研究结果相似ꎮ㊀㊀ＡＣＰ和ＡＫＰ是凡纳滨对虾体内重要的具有免疫功能的酶ꎬ可直接杀死侵入病原ꎬ并且可以将其进一步水解消化ꎬ在机体免疫系统抵御病原的免疫反应中起重要作用[２２]ꎮ本试验结果表明ꎬ饲料中添加１.０％~２.０％的小肽能够提高凡纳滨对虾幼虾血清中ＡＣＰ活性ꎮ㊀㊀ＭＤＡ是生物体内自由基作用于脂质发生过氧化反应的终产物[２３－２４]ꎬ其会引起蛋白质㊁核酸等生命大分子的交联聚合ꎬ且具有细胞毒性ꎮ因此ꎬ降低ＭＤＡ含量即减少了细胞的受损程度ꎮ本试验结果表明ꎬ饲料中添加小肽能够降低凡纳滨对虾幼虾血清和肝胰腺中ＭＤＡ的含量ꎬ这可能是由于添加小肽能够对细胞起到保护作用ꎬ从而提高对虾的生长性能和攻毒后的存活率ꎮ研究发现ꎬ在饲料中添加谷胱甘肽能降低凡纳滨对虾肝胰腺中ＭＤＡ的含量[１８]ꎮ另外ꎬ王际英等[２５]对星斑川鲽(Ｐｌａｔｉｃｈｔｈｙｓｓｔｅｌｌａｔｕｓ)幼鱼的研究表明ꎬ饲料中添加适量小肽能有效提高消化道中消化酶活性ꎮ此外ꎬ还有研究发现ꎬ饲料中添加小肽能降低赤点石斑鱼(Ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓａｋａａｒａ)的蛋白质需求量ꎬ促进脂肪代谢ꎬ提高消化道中消化酶活性[２６]ꎮ㊀㊀人工攻毒是评估对虾非特异性免疫力和抗病力的有效方法[２７]ꎮ哈维氏弧菌是一种在海洋环境中广泛存在的革兰氏阴性发光细菌ꎬ会致使凡纳滨对虾患发光病㊁肝胰腺细胞坏死ꎬ最终导致死亡[２８]ꎮ本试验采用哈维氏弧菌对凡纳滨对虾幼虾进行攻毒试验ꎬ结果显示ꎬ小肽添加量为０.５％~４.０％时凡纳滨对虾幼虾在攻毒７ｄ后的累积死亡率显著降低ꎮ可见ꎬ饲料中添加适量小肽有利于提高凡纳滨对虾的非特异性免疫力和抗病力ꎬ这与林启存等[４]的研究结果一致ꎮ４㊀结㊀论㊀㊀饲料中添加１.０％~２.０％的小肽可促进凡纳滨对虾幼虾生长ꎬ提高其非特异性免疫力和抗病力ꎮ参考文献:[１]㊀李玉虎ꎬ宋芹芹ꎬ张志怀ꎬ等.凡纳滨对虾生长发育规律及生长曲线拟合研究[Ｊ].南方水产科学ꎬ２０１５ꎬ１１(１):８９－９５.[２]㊀向枭ꎬ周兴华ꎬ唐龙碧.小肽的营养及在水产养殖上的应用[Ｊ].山东饲料ꎬ２００２(８):１１－１４. 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[２０]㊀ＶＩＮＣＥＮＺＩＮＩＭＴꎬＩＡＮＴＯＭＡＳＩＴꎬＦＡＶＩＬＬＩＦ.Ｇｌｕ￣ｔａｔｈｉｏｎｅｔｒａｎｓｐｏｒｔａｃｒｏｓｓｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｂｒｕｓｈ￣ｂｏｒｄｅｒｍｅｍ￣ｂｒａｎｅｓ:ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｉｏｎｓꎬｐＨꎬΔΨꎬａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ[Ｊ].ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ:Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓꎬ１９８９ꎬ９８７(１):２９－３７.[２１]㊀杨留冰ꎬ潘鲁青.注射磷脂酰丝氨酸对凡纳滨对虾血蓝蛋白合成㊁酚氧化酶活性的影响[Ｊ].水产学报ꎬ２０１３ꎬ３７(９):１３７８－１３８８.[２２]㊀王秀华ꎬ宋晓玲ꎬ黄倢.肽聚糖制剂对南美白对虾体液免疫因子的影响[Ｊ].中国水产科学ꎬ２００４ꎬ１１(１):２６－３０.[２３]㊀刘树青ꎬ江晓路ꎬ牟海津ꎬ等.免疫多糖对中国对虾血清溶菌酶㊁磷酸酶和过氧化物酶的作用[Ｊ].海洋与湖沼ꎬ１９９９ꎬ３０(３):２７８－２８３.[２４]㊀ＴＲＥＮＺＡＤＯＣꎬＨＩＤＡＬＧＯＭＣꎬＧＡＲＣÍＡ￣ＧＡＬ￣ＬＥＧＯＭꎬｅｔａｌ.Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｎｚｙｍｅｓａｎｄｌｉｐｉｄｐｅｒｏｘｉ￣ｄａｔｉｏｎｉｎｓｔｕｒｇｅｏｎＡｃｉｐｅｎｓｅｒｎａｃｃａｒｉｉａｎｄｔｒｏｕｔＯｎ￣ｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓｍｙｋｉｓｓ.Ａｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｓｔｕｄｙ[Ｊ].Ａｑｕａｃｕｌ￣ｔｕｒｅꎬ２００６ꎬ２５４(１/２/３/４):７５８－７６７.[２５]㊀王际英ꎬ姜柯君ꎬ夏斌ꎬ等.小肽对星斑川鲽幼鱼消化酶活性㊁抗氧化能力和生化组成的影响[Ｊ].中国水产科学ꎬ２０１４ꎬ２１(６):１１５４－１１６４.[２６]㊀ＨＯＣＨＡＣＨＫＡＰＷꎬＳＯＭＥＲＯＧＮ.Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｄ￣ａｐｔａｔｉｏｎ:ｍｅｃｈａｎｉｓｍａｎｄｐｒｏｃｅｓｓｉｎｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｅｖｏ￣ｌｕｔｉｏｎ[Ｍ].Ｏｘｆｏｒｄ:ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓꎬ２００２. [２７]㊀赵书燕ꎬ林黑着ꎬ黄忠ꎬ等.不同蛋白质水平下添加小肽对石斑鱼生长㊁消化酶㊁血清生化和抗氧化能力的影响[Ｊ].南方水产科学ꎬ２０１６ꎬ１２(３):１５－２３. 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张 芹，吴小军，杨兴丽．凡纳滨对虾不同养殖模式下微生物群落结构分析［Ｊ］．江苏农业科学，２０２４，５２（６）：２２５－２３５．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２４．０６．０２９凡纳滨对虾不同养殖模式下微生物群落结构分析张 芹，吴小军，杨兴丽（河南省水产科学研究院，河南郑州４５００４４） 摘要：为了解不同养殖模式对凡纳滨对虾养殖环境微生物多样性和群落结构的影响，利用高通量测序技术，结合生物信息学分析，比较凡纳滨对虾主养模式和鱼－虾混养模式中水体、底泥以及虾肠道微生物的多样性和群落结构。
结果显示，无论是物种的多样性水平还是丰富性水平，均是底泥＞水＞虾肠道，主养池塘底泥和虾肠道样品的物种多样性和丰富性均高于混养池塘。
不同样品微生物群落的菌群分布于５９个门，其中１０个门的丰度＞１％，变形菌门（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）和拟杆菌门（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）属于绝对优势菌群，在混养池塘和主养池塘中均＞１０％。
主养池塘的微生物标志物共有８个类群，分别为双歧杆菌目（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、双歧杆菌科（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、双歧杆菌属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等，混养池塘的微生物标志物共有１８个类群，分别为蓝色芽殖杆菌属（Ｇｅｍｍｏｂａｃｔｅｒ）、外硫红螺菌科（Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、外硫红螺菌属（Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ）等。
通过功能预测及其相对丰度比较，发现主养模式在这些代谢通路中基因注释的相对丰度值均高于混养模式。
以上研究表明，在凡纳滨对虾主养模式中添加的益生菌，有效提高了水体、虾肠道和底泥的微生物多样性，塑造了更健康、多元化、功能更强大的微生物群落，提高了养殖系统的物质循环能力和能量利用效率，更有利于虾体的健康成长。
关键词：凡纳滨对虾；微生物群落结构；高通量测序 中图分类号：Ｓ１８２；Ｓ９１７．１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０２４）０６－０２２５－１０收稿日期：２０２３－０５－０２基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项（编号：ＣＡＲＳ－４５）；河南省农业科学院自主创新项目（编号：２０２３ＺＣ１１３）；国家淡水水产种质资源库建设项目（编号：ＦＧＲＣ：１８５３７）；河南省农业产业技术体系（编号：ＨＡＲＳ－２２－１６－Ｓ）。
中国水产科学 2014年1月, 21(1): 189−196 Journal of Fishery Sciences of China研究论文收稿日期: 2013-04-25; 修订日期: 2013-05-27. 基金项目: 上海市科委重大项目(08DZ1981000).作者简介: 罗词兴(1987−), 男, 硕士研究生, 主要从事虾类营养免疫研究. E-mail:414599280@ 通信作者: 黄旭雄, 教授. E-mail: xxhuang@DOI: 10.3724/SP.J.1118.2014.00189溶藻弧菌感染后凡纳滨对虾鳃组织免疫相关基因的表达罗词兴, 黄旭雄, 李桑, 赵利斌, 危立坤, 陈春燕, 刘林林, 曾蓓蓓上海海洋大学 水产与生命学院, 上海 201306摘要: 分别给凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei )注射生理盐水、3×106 CFU/mL(低浓度组)和9×106 CFU/mL(高浓度组)溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus )菌液, 采用荧光定量PCR 技术, 检测不同处理后凡纳滨对虾鳃组织中Toll 受体、IMD 和溶菌酶基因表达量随时间的变化。
结果表明, 处理42 h 内, 注射生理盐水组对虾的Toll 受体和IMD mRNA 表达量无显著变化, 溶菌酶mRNA 表达量在注射36 h 后显著升高。
急性感染溶藻弧菌后, 凡纳滨对虾鳃组织中Toll 受体、IMD 和溶菌酶mRNA 的表达量峰值分别出现在感染后24、42和36 h; 溶藻弧菌的感染剂量不影响上述基因表达峰值的出现时间, 但显著影响上述基因的表达峰值(P <0.05), 各基因表达量峰值由大到小均依次为高浓度组、低浓度组、生理盐水组。
急性感染初期, 对虾鳃组织中Toll 受体mRNA 表达量呈现显著下调, 而IMD 和溶菌酶mRNA 表达量在感染初期不存在显著下调现象。
凡纳滨对虾对哈维氏弧菌不同攻毒方式的响应樊英;许拉;王晓璐;李乐;盖春蕾;于晓清;李天保;叶海斌【摘要】Litopenaeus vannamei with 3.5 cm body length was infected by Vibrio harveyi with the methods of injection and dipping, the accumulative mortalities within 7 days were investigated.The change of gut histological structure and the dynamics of Vibrio num-ber in the gut were studied by tissue slice. The results showed that the accumulative mortality ofL.vannamei in high concentration (107CFU·mL-1) dipping treatment was the highest with about 68%;while t hat in high concentration(107CFU·mL-1) injection treatment was about 62%. The Vibrio number in the gut ofL.vannamei infected increased significantly,the increase in dipping treat-ment was earlier and larger than that in injection treatment;the Vibrio number in the gut decreased and stabilized over time. The gut histological structure of L.vannamei infected was damaged seriously within a short time in the treatment of high concentration with the epithelial cells degraded and collapsed,mucosal folds exfoliated, as well as the muscular layer damaged, which were not repaired during the test.%通过注射和浸浴2种方式,使体长约3.5 cm的凡纳滨对虾感染哈维氏弧菌,测定7 d内各组对虾死亡率;通过组织切片探究肠道组织结构变化,并对肠道内容物中弧菌数量进行监测.结果表明:高浓度(107CFU·mL-1)浸浴组的对虾死亡率最高,约68%;高浓度(107CFU·mL-1)注射组对虾死亡率约62%.被感染的对虾肠道中弧菌数量明显增多,浸浴组比注射组弧菌数量增加时间较早且幅度较大;随着时间延长对虾肠道中的弧菌数量发生回落,且趋于稳定.感染哈维氏弧菌后对虾肠道组织受到损伤,2种感染方式均呈现高浓度处理下短时间内受损加重,上皮细胞溃散,黏膜褶皱处发生不同程度的脱落,肌层发生损伤,且试验期间未能修复.【期刊名称】《福建农林大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(047)003【总页数】5页(P342-346)【关键词】凡纳滨对虾;哈维氏弧菌;攻毒;肠道;组织结构【作者】樊英;许拉;王晓璐;李乐;盖春蕾;于晓清;李天保;叶海斌【作者单位】山东省海洋生物研究院,山东省海水养殖病害防治重点实验室,山东青岛266104;山东省海洋生物研究院,山东省海水养殖病害防治重点实验室,山东青岛266104;山东省海洋生物研究院,山东省海水养殖病害防治重点实验室,山东青岛266104;山东省海洋生物研究院,山东省海水养殖病害防治重点实验室,山东青岛266104;山东省海洋生物研究院,山东省海水养殖病害防治重点实验室,山东青岛266104;山东省海洋生物研究院,山东省海水养殖病害防治重点实验室,山东青岛266104;山东省海洋生物研究院,山东省海水养殖病害防治重点实验室,山东青岛266104;山东省海洋生物研究院,山东省海水养殖病害防治重点实验室,山东青岛266104【正文语种】中文【中图分类】S945.4;S917.1哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)隶属于弧菌科弧菌属，是海水中一种常见的病原菌，在海洋环境中分布很广，主要感染虾及鱼类[1-2].通常情况下，哈维氏弧菌是凡纳滨对虾(Litopenaeus vanname)的正常菌群;在养殖动物自身健康或养殖环境发生变化的情况下，该菌开始大量繁殖，通过不同方式不同程度地打破宿主微生态平衡，损伤宿主的组织结构.对虾被感染后一般会出现肝胰腺混沌、白鳃、红腿、肌肉白浊等症状[3].目前发现哈维氏弧菌的致病性相关因子主要为胞外产物(extracellular products, ECP)，包括蛋白酶、溶血素、外毒素、脂多糖等，还与噬菌体介导的毒力基因转移相关[4-7].弧菌的致病过程与对虾生理状态、环境胁迫、菌的攻毒方式等相关.注射和浸浴是病原学研究中常见的攻毒手段.本文研究凡纳滨对虾在不同浓度和不同感染途径的哈维氏弧菌作用下，肠道组织形态、肠道弧菌数量及虾体死亡率的变化，为阐明哈维氏弧菌的致病机理提供理论基础.1 材料与方法1.1 攻毒对象及养殖条件健康的凡纳滨对虾来自山东滨州某养殖场，体长约3.5 cm.正式试验前，凡纳滨对虾暂养于塑料桶(85 cm×55 cm×45 cm)内4 d，连续充气，以配合饲料饱食投喂.养殖水体盐度为18‰，水温26 ℃，pH 8.0，亚硝酸盐含量0.01 mg·L-1，氨氮含量0.01 mg·L-1.随后将凡纳滨对虾随机分组，每组20尾.在攻毒试验前禁食1 d.1.2 供试菌株及致病性试验所用攻毒菌株是从某养殖场濒死对虾肝胰腺分离的哈维氏弧菌，由山东省海水养殖病害防治重点实验室分离、保存(命名TCBS-G).通过预试验确定哈维氏弧菌的半致死浓度LD50(7 d)为1.3×107 CFU·mL-1.将分离纯化的哈维氏弧菌接种于2216e液体培养基，28 ℃培养20 h，通过分光光度计560 nm(D560 nm)比浊测定后备用.将供试菌液(1.8×107 CFU·mL-1)300 mL加入20 L水体中，浸泡20尾试验对虾，对照组为同体积无菌生理盐水.浸泡12 h后捞出试验对虾，彻底换水，健康养殖条件下暂养4 d，每天观察对虾被感染后的发病与死亡情况，以濒死对虾重新分离到原感染菌为致病性判定指标.1.3 注射攻毒试验根据预试验结果，设立对照组和不同浓度的哈维氏弧菌试验组，每组3个平行.将供试弧菌浓度通过无菌生理盐水稀释至105和107 CFU·mL-1.采用1 mL无菌注射器将0.1 mL稀释哈维氏弧菌注射入凡纳滨对虾第五至第六腹节处，对照组注射同体积的无菌生理盐水.监测所有凡纳滨对虾在哈维氏弧菌感染后的生存情况，并记录死亡的时间，试验周期为7 d.1.4 浸浴攻毒试验根据预试验结果，共设立3个处理组.将活化的哈维氏弧菌供试菌液[105和107 CFU·mL-1]300 mL加入20 L水体中，浸泡20尾试验凡纳滨对虾，同时设同体积无菌生理盐水作为对照，每组3个平行.隔离养殖于试验水箱中，浸泡过夜后捞出试验对虾，彻底换水，暂养，每天观察凡纳滨对虾感染后的发病与死亡情况，试验周期为7 d.1.5 凡纳滨对虾肠道对哈维氏弧菌感染的响应在供试菌株感染凡纳滨对虾12、24、48、72、96 h，分别从对照组和攻毒试验组中随机挑取濒死的凡纳滨对虾3尾，冰上解剖，获取肠道，-80 ℃无菌保存，备用.将肠道内容物稀释后置于TCBS选择性培养基上进行弧菌计数.将48 h中肠组织样品置于Bouin氏液中固定，放入不同浓度酒精进行梯度脱水后浸蜡、包埋，使用切片机(SHANDON, AS325)连续7 μm切片，干燥后利用苏木精—伊红(HE)染色法染色，最后观察并进行显微摄影(OLYMPUS, BX53F).1.6 计算公式及统计方法累积死亡率/%=Dt/D0×100(D0和Dt分别为攻毒过程中凡纳滨对虾初始数量和累计死亡数量).采用SPSS 17.0软件对所得数据进行单因素方差分析，若差异显著，则用Duncan′s检验法进行多重比较，显著性水平为P<0.05.2 结果与分析2.1 供试菌的致病性凡纳滨对虾被供试哈维氏弧菌感染后出现死亡现象，而对照组在4 d观察期内均正常.发病虾体发白，肝胰腺出现混浊状态，有的呈现浅白色，提取肠胃样品肉眼观察，呈现空、透现象；被感染的濒死对虾经细菌学检验，分离到大量的感染菌，其形态及理化特性与原感染菌一致(表1).2.2 注射方式对感染凡纳滨对虾的影响图1显示，高浓度(107 CFU·mL-1)试验组的对虾在第1天便出现死亡现象，第3天死亡率达到最大值，之后趋于稳定；低浓度(105 CFU·mL-1)试验组对虾出现死亡的时间与高浓度试验组相近，但死亡数量相对较少，第4天达到最大值.2.3 浸浴方式对感染凡纳滨对虾的影响图2显示，高浓度(107 CFU·mL-1)试验组对虾在第1天的死亡情况较低浓度(105 CFU·mL-1)试验组严重，第2天死亡数量急剧增大，第3天死亡率达到最大值；低浓度试验组死亡情况相对平缓，第4天达到最大值.表1 供试菌生化反应结果(陆桥生物有限公司试剂盒)1)Table 1 Biochemical reaction results of V.harveyi tested (Beijing Land Bridge Technology CO, LTD)菌种生化反应革兰氏性质蔗糖阿拉伯糖3% NaCl葡萄糖(产气)纤维二糖3% NaCl乳糖氧化酶试纸赖氨酸脱羧酶供试菌---+--+-分离菌---+--+-菌种生化反应鸟氨酸脱羧酶精氨酸双水解酶硝酸盐还原酶VP试验甲基红酚红葡萄糖肉汤甘露醇供试菌 -----++分离菌 -----++1)“+”表示阳性,“-”表示阴性.图1 注射哈维氏弧菌7 d内凡纳滨对虾累积死亡率Fig.1 Accumulative mortality of L.vannamei injected V.harveyi in 7 days图2 浸浴哈维氏弧菌7 d内凡纳滨对虾累积死亡率Fig.2 Accumulative mortality of L.vannamei immersedV.harveyi in 7 days2.4 肠道内容物弧菌数量对不同攻毒方式的响应不同攻毒方式导致弧菌数量出现不同程度的增加.注射12 h肠道弧菌数量未见显著变化(P>0.05)，第3天达到最多，与对照组差异显著(P<0.05)；而浸浴第1天肠道弧菌数量即大量增加，与对照组差异显著(P<0.05)，第2天达到最大值，随后弧菌数量发生回落(表2).表2 攻毒方式对凡纳滨对虾肠道内容物弧菌数量的影响1)Table 2 Effect of infection methods on Vibrio number in the gut of L.vannamei攻毒方式处理弧菌总数/(×106 CFU·g-1)12 h24 h48 h72 h96 h注射对照组3.6±0.02a3.2±0.12a3.5±0.01a3.5±0.01a3.3±0.01a105 CFU·mL-1试验组3.6±0.06a3.8±0.62b4.0±0.05b4.0±0.77b3.8±0.24b107 CFU·mL-1试验组4.1±1.02b5.0±0.73c5.2±0.12c5.7±0.43c5.2±0.17c浸浴对照组3.2±0.01a3.3±0.01a3.3±0.01a3.2±0.01a3.3±0.01a105 CFU·mL-1试验组3.8±0.22c4.7±0.33c5.0±0.51c4.8±0.33d4.1±0.11b107 CFU·mL-1试验组4.0±0.23d6.1±0.12d6.2±0.24d5.3±0.41e4.9±0.32c1)数据为平均值±标准误.同列数据后附不同字母者表示差异显著(P<0.05).2.5 肠道组织结构对不同攻毒方式的响应由图3可见，在不同攻毒方式和不用浓度哈维氏弧菌作用下，对虾肠道组织可分为轻度感染和重度感染.轻度感染主要发生于低浓度注射试验组，其症状为肠道上皮细胞边缘略变薄(图3B).重度感染主要发生于高浓度试验组，且浸浴感染较严重，症状主要为上皮细胞损伤、变形并脱落，细胞核裂解，严重者肠黏膜褶皱处向下沉落或脱落，肠壁上环肌肉与纵肌层也有脱落(图3F)；高浓度注射试验组表现为细胞核模糊不清，少许出现上皮细胞与固有层分离现象(图3C).A.注射对照组;B.105 CFU·mL-1注射试验组;C.107 CFU·mL-1注射试验组;D.浸浴对照组;E.105 CFU·mL-1浸浴试验组;F.107 CFU·mL-1浸浴试验组.图3 不同攻毒方式下凡纳滨对虾肠道组织结构的变化Fig.3 Change of gut histological structure of L.vannamei infected by different methods3 讨论对虾被致病菌感染后，在血淋巴、肌肉及肝胰腺内细胞和体液免疫应答等多方面呈现对外界致病菌的防御，但是针对不同攻毒方式下弧菌与对虾肠道相互作用的研究极为缺乏.Rajendran et al[8]针对甲壳类生物开展了哈维氏弧菌浸浴攻毒试验，观察发现浸浴侵染后的动物组织形态变化与自然侵染相似，说明浸浴攻毒是一种最为自然并且行之有效的侵染生物体的方式[9-10].然而，不同攻毒方式造成的损伤不同，涉及不同的致病机理.注射攻毒是将病菌经对虾腹节处注射到肌肉内，经过自身系统循环，分散至全身，到达肠道需要一定的时间和过程；浸浴攻毒是致病菌经对虾口或鳃被摄入体内，之后到达肠道，进而伤及全身其他部位和功能.因此，浸浴攻毒比注射攻毒更容易损伤虾体的肠道组织.本研究中，浸浴攻毒后对虾出现死亡的时间比注射攻毒早且状况严重.甲壳动物被哈维氏弧菌感染后会出现许多疾病[9-10].Diggles et al[10]研究表明，绿岩龙虾(Jasus verreauxi)被哈维氏弧菌感染后出现蚕食现象，外表皮受伤更便于哈维氏弧菌的寄居繁殖，加重病害程度和发生范围.Jayasree et al[11]发现，斑节对虾(Penaeus monodon)在被哈维氏弧菌感染后出现附肢发红、外表皮松软及白便等症状，这与本研究中凡纳滨对虾被哈维氏弧菌感染后表现的症状相似.对虾肠道黏膜褶皱的高低和疏密、上皮细胞的完整性和数量等会影响肠道性能[9,12].正常肠上皮细胞排列紧密，细胞间隙清晰，内壁为高柱状上皮组织，肠内壁向肠腔凸起形成褶皱[13].对虾被致病菌感染后，其上皮组织损伤开始于上皮细胞，细胞质明显变薄，随着侵染的加深，肠道上皮细胞核肥大，核边缘模糊不清，上皮细胞核最终完全降解形成胞内空洞[14].本研究发现，在不同方式、不同浓度弧菌攻毒后对虾肠道的组织结构表现为轻度感染和重度感染.随着弧菌浓度的提高和攻毒时间的延长，中肠组织损伤情况逐渐加重.重度感染表现为上皮细胞完全溃散并脱落，肌层也被损伤.此外，对虾肠道在受到哈维氏弧菌侵染后，黏膜褶皱处发生皱缩或损伤直至脱落.然而，有关对虾的肠道修复机制需进一步深入研究.参考文献【相关文献】[1] 钱云霞,王国良,邵健忠.海水养殖鱼类细菌性疾病研究概况[J].海洋湖沼通报,2001(2):78-87.[2] 刘迪.水产养殖源哈维氏弧菌的流行特征与致病性差异分析[D].上海:上海海洋大学,2016.[3] KARUNASAGAR I, PAI R, MALATHI G R, et al. 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