蛋白质和多肽的氨基酸序列分析

N端序列分析Edman降解（埃德曼降解）法，是由菲尔•埃德曼（Pehr Edman）首先创立用于肽链或蛋白质中N-端氨基酸序列分析的方法。

Edman降解法检测的原理非常简单，在碱性条件下反应，用异硫氰酸苯酯（Phenylisothiocyanate, PITC）与待检测的蛋白质（多肽）的N-端氨基生成苯氨基硫甲酰（PTC）的衍生物，然后处理-关环-选择性切断肽链N-端，得到N-端氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。

接着用有机溶剂萃取衍生物，在酸的作用下，不稳定的衍生物转变为稳定的的乙内苯酰硫脲（PTH）衍生物，余下肽链中的酰胺键不受影响。

通过用HPLC或电泳法分析生成的乙内酰苯硫脲氨基酸（PTH-氨基酸），可以鉴定出氨基酸类别。

重复氨基酸鉴定反应可以达到对N端氨基酸按照从N端到C端的方向依次对氨基酸序列进行分析。

对于序列较长的蛋白质（多肽），还可以将样品先切成小的肽段，先对肽段序列分析，再将肽段信息进行拼接即可获得完整蛋白质的序列信息。

蛋白质N端测序流程。

Edman降解法用于N端测序的优点：1. PITC与所有氨基酸残基的反应产率和回收率高，因此副产物少，可通过色谱进行准确鉴定；2. 反应时间快，对于大多数氨基酸残基来说，30min耦合时间，5min切割反应时间即可；3. 反应后的肽链仍然是完整的，可用Edman降解法重复测定新生的N末端氨基酸。

Edman降解法用于N端测序需要注意的问题：1. 样品纯度需>90%，盐离子含量在50 mmol/L之内，不含SDS等变性剂，N端必须是均一的高纯样品；2. 10 Pmol 样品可以测定20 aa；3. 液体样品不能含有蛋白酶，建议尽早测试，防止时间太长容易降解；4. 转膜样品在转膜前不宜放置太久以防样品扩散，转膜后可密封保存3-6个月，建议使用Coomassie R-250进行染色，电泳缓存液建议使用CAPS buffer；5. 样品无信号峰是，建议蛋白进行N-端封闭；6. 建议整个反应过程中尽可能使用高纯buffer。

c端氨基酸序列
C端氨基酸序列指的是蛋白质或多肽链的羧基端（C端）的氨基酸排列顺序。

C端是蛋白质重要的结构和功能部位，其序列可以影响蛋白质的空间结构和生物学功能。

对C端氨基酸序列进行研究有助于揭示蛋白质的结构和功能，进而为人工合成活性多肽提供依据。

常用的C端氨基酸序列测定方法主要有羧肽酶法、化学法和基于质谱的方法等。

羧肽酶法和化学法是通过酶解法或化学试剂裂解法获得C端氨基酸，再结合液相色谱或质谱技术对氨基酸种类进行鉴定。

而串联质谱法则是将蛋白质样品酶解、消化成肽段混合物，然后对肽段混合物进行串联质谱分析，通过一级质谱信息选择C端肽段离子进行二级质谱分析，再根据二级质谱数据结合相应软件和数据库计算蛋白质的C端氨基酸序列。

百泰派克生物科技
多肽氨基酸序列分析
多肽的氨基酸序列分析就是对组成多肽的氨基酸种类、数量以及排列次序进行鉴定，也称为多肽测序，属于多肽一级结构鉴定的内容。

目前较常用的多肽氨基酸序列分析方法包括经典的Edman降解法、C末端酶解法、C末端化学降解法以及新兴的质
谱法等。

Edman降解法主要是对多肽的N末端氨基酸序列进行分析，但是其对N末端封闭的
肽链无能为力。

此外，Edman降解法测序速度较慢、样品用量较大、样品纯度要求
很高，而且对发生修饰的氨基酸残基识别的准确性不高。

C末端测序法在寻找理想
的PITC化学探针方面仍面临着很大的困难。

在这种背景下，高分辨率（达fmol 级）、高准确性以及操作简便的质谱测序技术则备受青睐，质谱分析技术的灵敏度
及准确性与待测物的分子质量成负相关，分子量增大时检测结果的准确性明显降低，多肽的分子量相比蛋白质小得多，因此采用质谱进行多肽氨基酸序列分析比蛋白质简单，许多研究均是以多肽作为分析对象。

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Q ExactiveHF质谱平台，结合Nano-LC
纳升色谱，提供高效精准的蛋白/多肽氨基酸序列分析服务技术包裹，可对各种蛋
白/多肽样品的一级结构进行解析，包括多肽链中氨基酸的种类、数目和排列顺序
以及多肽链内或链间二硫键的位置和数目等，欢迎免费咨询。

蛋白质工程部氨基酸测序及其蛋白质质量评价2.深圳亚辉龙生物科技股份有限公司，广东深圳518000【摘要】氨基酸序列是蛋白质和多肽重要的结构，其决定蛋白质的高级结构。

氨基酸测序在蛋白质研究中越发重要，高分辨率质谱技术的发展大大促进了氨基酸测序的研究。

本文综述了氨基酸测序的方法、原理以及其应用的研究进展，随着质谱技术的不断发展，新的测序方法不断建立，氨基酸测序将在蛋白质研究中发挥更大的作用。

【关键词】蛋白质；氨基酸测序；质谱技术；从头测序蛋白质是一类最重要的生物大分子，在生物体内占有特殊的地位。

其一级结构是由多肽链主链上共价连接的氨基酸残基决定的，二级结构和其它高级结构主要是由非共价力如氢键、离子键、范德华力和疏水作用决定的。

一级结构中氨基酸序列的排列决定蛋白质高级结构的生物学活性。

因此，氨基酸序列测定具有非常重要的意义。

氨基酸序列测定一般需要测定其相对分子质量、等电点、N-末端肽段序列和C-末端肽段序列，虽然测定每种蛋白质的氨基酸序列都有自己特殊的问题需要解决，但是氨基酸测定的一般方法都可以概括为：①测定蛋白质分子中多肽链的数目，根据蛋白质N-末端或C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量可以确定蛋白质分子中的多肽数目；②拆分蛋白质分子的多肽链，断开多肽链间的二硫键，如果蛋白质分子是由一条以上多肽链构成的，则这些链必须加以拆分；③鉴定多肽链的N-末端残基和C-末端残基，裂解多肽链成较小的片段，测定各肽段的氨基酸序列，目前最常用的肽段测序方法有Edman降解法[1]、酶解法和质谱法；④运用软件重建完整多肽链的一级结构，确定二硫键的位置，利用两套或多套肽段的氨基酸序列彼此间交错拼凑出完整多肽链的氨基酸测序。

目前氨基酸序列测定的方法主要有化学降解法、酶降解法和质谱法以及核苷酸序列的推定法，每种方法都有其自身的优势和劣势，以前面三种测序方法最为常用。

1化学降解法化学降解法是指蛋白质或多肽物质与相应的化学试剂反应后，专一裂解多肽链肽段并检测相关裂解片段的方法，包括N-末端肽段序列测定法和C-末端肽段序列测定法。

2.2.56氨基酸分析（1）（见注解）氨基酸分析是指利用方法对蛋白质，多肽和其他药物制剂进行氨基酸组成或含量的分析。

蛋白质和多肽一般是氨基酸残基以共价键的形式组成的线性大分子。

蛋白质或多肽中氨基酸的序列决定了其分子的性质。

蛋白质普遍是由大分子以折叠的方式形成的特定构象，而多肽则比较小，可能只有几个氨基酸组成。

氨基酸分析方法可以用于对蛋白质和多肽的量化，基于氨基酸的组成来确定蛋白质或多肽的类型，支撑蛋白质和多肽的结构分析，评估碎片肽段，并检测可能存在于蛋白质或多肽中的不规则氨基酸。

并且在氨基酸分析之前必须进行将蛋白质或多肽水解为个别氨基酸。

伴随着蛋白质或多肽的水解，氨基酸分析的过程和其他药物制剂中氨基酸的游离是一致的。

通常我们采用易于分析的方法来测定样品中的氨基酸成分。

设备用于氨基酸分析方法通常是基于色谱分离氨基酸的方法设定的。

当前的方法是利用自动化色谱仪进行分析。

氨基酸分析仪通常是一个能够产生梯度的低压或高压的液相色谱仪，并在色谱柱上分离氨基酸。

除非样品在柱前进行了衍生化，否则这些仪器必须具备柱后衍生化的能力。

检测器使用的是紫外可见光检测器或荧光检测器。

此外，还需具有一个记录仪器（例如，积分仪），用于转化检测到的信号及用于定量测定。

而且，这些仪器是专门用于氨基酸分析使用的。

一般预防策施在氨基酸分析中，分析师关注的一个重点是背景的污染。

高纯度的试剂是必要的（例如，低纯度的盐酸的使用在分析中会产生甘氨酸污染）。

分析试剂通常是每隔几周更换一次，并且仅使用HPLC级别的溶剂。

所用试剂使用之前必须用过滤器将溶剂中可能潜在的微生物和外来材料污染过滤除去，保持溶剂贮存器出于密封状态，并且不可将氨基酸分析仪放置于光照条件下。

实验室的操作规范决定了氨基酸分析的质量。

仪器应放置在实验室的空旷区域。

保持实验室的卫生干净。

根据维修计划，及时清洁和校准移液管，将移液吸头放置在相应的盒子中，分析师不得用手处理移液管。

分析师需要穿戴一次性的乳胶手套或同等质量的其他手套。

氨基酸,多肽,蛋白质的关系
氨基酸是构成蛋白质的基本单元，是一类含有羧基（-COOH）和氨
基（-NH2）的有机分子。

它们通过共价键结合形成多肽，多个多肽之
间再形成蛋白质。

氨基酸在蛋白质中的序列是非常重要的，因为它们决定了蛋白质
的结构和功能。

蛋白质的结构包含着四个层次：一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。

一级结构是氨基酸序列的线性排列；二级结构
包括α螺旋和β折叠；三级结构是主链的三维摆动，使得氨基酸侧
链在空间上排列成为蛋白质的特定形状；四级结构是由两个或多个链
相互作用而形成的复杂蛋白质结构。

蛋白质的功能非常广泛，包括结构支持、酶催化、信号传导和免
疫保护等。

每个蛋白质的功能都与它的结构密切相关，因此对于蛋白
质的结构和功能的研究非常关键。

一种具有特定功能的蛋白质的序列通常由数百个甚至上千个氨基
酸组成。

不同的氨基酸组成不同的序列，则产生不同的蛋白质结构和
功能。

在人体中，氨基酸可以由体内合成或外源性摄取获得。

不同种类
的氨基酸在人体中的相对含量不同，因此也影响了蛋白质的合成和功能。

总之，氨基酸、多肽和蛋白质之间是密不可分的关系。

氨基酸是
构成蛋白质的基本单元，而多个氨基酸结合形成多肽，多个多肽之间
再形成蛋白质。

蛋白质的序列和结构决定了其功能，因此研究氨基酸、多肽和蛋白质的相互关系对于解决人类健康问题具有重要意义。

多肽到蛋白质发生的变化
多肽到蛋白质发生的变化可以概括为以下几个步骤：
1. 氨基酸连接：多肽和蛋白质都由氨基酸组成，多肽是由少量氨基酸连接而成，而蛋白质则由较长的氨基酸序列连接而成。

在转化过程中，多肽的氨基酸序列会经过蛋白质合成机制中的翻译过程，氨基酸通过肽键连接起来，形成较长的氨基酸序列。

2. 折叠与构象变化：在蛋白质的转化过程中，氨基酸序列会逐渐折叠成特定的三维结构。

这种折叠是由非共价相互作用力（如氢键、离子键、疏水相互作用）和共价连接（如二硫键）共同作用形成的。

折叠后的蛋白质具有特定的构象，这决定了其功能和活性。

3. 翻译后修饰：除了氨基酸连接和折叠外，蛋白质转化过程中还可能发生其他修饰。

这包括翻译后修饰，如磷酸化、醋酸化、甲基化等，以及修饰后的切割，如蛋白质酶的切割。

4. 蛋白质功能：蛋白质的转化不仅仅是指其从多肽到蛋白质的过程，还包括其功能的发挥。

蛋白质的多样性功能基于其特定的氨基酸序列和结构。

蛋白质可以发挥催化酶、抗体、结构支持、传导信号等多种功能。

总之，多肽到蛋白质的转化过程是一个复杂且精确的过程，它涉及多个步骤，包括氨基酸连接、折叠与构象变化、修饰及蛋白质功能的发挥。

这些步骤都对蛋白质的最终结构和功能产生重要影响。