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PCR实验技术指南一、引物设计设计软件有很多，既可以在线设计（如Primer3/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi），也可以用Primer5、Oligo6.65 等等1. 引物设计的原则细心地进行引物设计是PCR 中最重要的一步。
理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。
设计糟糕的引物可能会同时扩增其他的非目的序列。
下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：1）典型的引物18 到24 个核苷长。
引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。
但是长度大于24 核苷的引物并不意味着更高的特异性。
较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
2）选择GC 含量为40％到60％或GC 含量与模板GC 含量接近的引物。
3）设计5"端和中间区为G 或C 的引物。
这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。
4）避免引物对3"末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。
在用软件设计时大家常常会疑惑,究竟? G 不能低于多少?这里有个数据: ? G 为0~-2时,PCR 产率可达100%, ? G=-6 时,为40%.5）避免3"末端富含GC。
设计引物时保证在最后5 个核苷中含有3 个A 或T。
6）避免3"末端的错误配对。
3"端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。
3’最好以G或C 结尾，防止AT 的松散结合引起错配。
7）避免存在可能会产生内部二级结构如发夹结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。
8）引物的一个重要参数是熔解温度（Tm）。
这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA 分子时的温度。
两引物的Tm 值相差不应大于5℃。
计算Tm 有几种公式。
第一个公式(Wallace 规则):Tm = 4℃（g + C）+2℃（a + T）,这来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于15-20个碱基的引物,也适用于手工设计时的简单计算。
特异引物与简并引物两者之间的区别我们在设计引物的时候，经常听到“特异引物”与“简并引物”（也有写成“兼并引物”）这样的说法。
那么这两者有何异同呢？分别适合什么情况呢？今天我们就带着⼤家⼀起来学习⼀下吧纯⼲货分享！特异引物多数情况下，我们要研究的基因序列都能在数据库中找到现成的序列。
如果你要得到某⼀段序列的话，针对这个序列设计引物就⾏了。
这样得到的引物每⼀个位置上的碱基都是确定的，这样的引物就叫“特异引物”。
特异引物由于碱基是确定的，所以由这个序列所计算出的Tm值以及PCR退⽕温度都是确定的。
⼀般特异引物的退⽕温度在55-60度是⽐较常见的。
说完特异引物接下来我们⼀起来看看简并引物是什么吧（内容⽐较长，请耐⼼看完哦）简并引物有些时候，我们在研究某个不是很常见的物种的某个基因时，我们事先并不知道它的基因序列是什么，⽽到NBCI等⽹上数据库也查不到，但你的任务是要把这个基因PCR出来。
该怎么办？（恭喜你，你可能成为世界上第⼀个知道这个基因序列的⼈，你可以提交到GenBank，你的名字也会出现在GenBank）。
你要做的是：参考⼏个近缘物种的同名基因的序列，来设计这个未知序列的引物。
通常是多找⼏个亲缘关系较近的放在⼀起做⽐对，选择其中同源性最⾼的⽚段来设计引物，这样⾄少可以得到⼀个确定的⽚段。
话虽简单，但这样有可能碰这样的情况：虽然⼏段基因同源性较⾼，但区别仍是有的。
有可能你⽆论如何怎么选，都⽆法在⼏个序列中找到两段⾜够长（20个碱基左右）的、同源性100%的、GC含量合适的序列来作为⼀对引物序列。
这时，你就要退⽽求其次，允许在这20个碱基左右的⽚段内出现若⼲个不确定的碱基。
⽐如，根据已知序列⽐对的结果，在引物第3个位置上可能是A，也可能是C，甚⾄也可能是T，那么你就可以在这个位置上设计为A/C/T简并。
也就是说，你拿到⼿的引物，在第3个位置上即有A碱基，也有C碱基，也有T碱基。
同理，在同⼀条引物中，可存在N个这样的简并位点。
PCR反应中Taq酶的选择随着分子生物学研究发展的不断广泛和深入，PCR已成为一门相当成熟的常规技术，而热聚合酶（即Taq酶）的合理选择是PCR成败与否的一个关键因素。
目前市面上有多种T aq 酶，能够满足多方面的实验需要。
那么，如何选择最合适的Taq酶？根据用户经常考虑的指标，如特异性、保真性、耐热性、扩增速率、扩增片段长度、能否进行复杂模板扩增以及优化条件难易等等，我们在这儿将主要的Taq酶归归类，其性质、用途也就一目了然了。
高特异性Taq酶高度特异性地扩增所需的片段是PCR最基本的要求，影响PCR特异性的因素很多，包括模板、引物性质及质量、反应条件的控制等等，而高特异性Taq酶的出现大大减少了摸条件这一繁琐的实验过程，也为PCR产物快速有效的纯化（PCR产物直接纯化）打下了基础。
这类酶最典型的代表是热启动T aq酶。
大家都知道，在PCR第一个循环变性之前，有一个升温的过程，引物和模板会有一些非特异性配对，如果这时Taq酶发挥活性，就很容易产生非特异性扩增，由于循环初期模板量非常少，产生的非特异性条带经过后面的指数扩增，就会严重干扰目的片段的扩增，甚至导致特异性条带不能扩出。
而热启动Taq酶是必需经过高温才能激活的酶，因此在初始循环的变性之前它没有活性，不会产生非特异性扩增，这就大大提高了PCR扩增的特异性。
第一代热启动Taq酶往往直接在T aq酶上做一些修饰，比如用抗体抑制，蜡封等，如Clontech、Stratagen、Gibcol-LTI的一些产品，由于抗体、蜡等异物的掺入，对实验造成一定的影响，也给试验者带来一些不便。
新一代的热启动Taq 酶是通过内部改造的重组酶，真正实现便利的热启动，代表产品如QIAGEN公司的HotStar 系列，无需别的辅助抑制物，也不用担心抑制不稳定，使用起来方便、高效。
此外，由于几乎所有的T aq酶产品都带有相应的反应缓冲液，缓冲液的品质也对保证Taq酶特异性扩增起着不可忽视的作用，一般的缓冲液中调节H键作用的盐只有KCl，QIAGEN公司的缓冲体系通过KCl、（NH4）SO4盐离子体系的平衡调节也提高了酶作用的特异性。
引物设计原则（最全汇总）引物设计原则（汇总）普通引物设计（适用于从载体上扩增模板）：1. 普通引物长度一般在20-30bp之间，常用24-28bp左右以保证基因特异性；2. 下载基因序列到Vector NTI；3. 找到所需安装载体序列；4. 将基因序列的CDS高亮标记；5. 寻找载体序列中常用酶切位点，一般为EcoRI、BamHI、HindIII、XhoI等等，比对检测基因序列中是否有这些位点，有的话舍弃，最后选择两个酶切位点，最好离得远一点，并且最好buffer用一样的。
酶切位点一般是6bp的回文序列；6. 从基因ATG开始往后选择10-20bp均可（我的习惯是27bp-6bp酶切位点-2bp保护碱基-xbp 补齐序列），但最好保证最后两个是G或者C，以减少错配率；7. 将上游酶切位点序列补在A TG前方，并根据载体对框情况补足两者之间的空缺，再根据序列的GC含量和TM值在酶切位点前补足保护碱基，以保证GC和AT的含量不能过高。
注意，所有的补齐不能用到终止密码子；8. 检测上游序列的结构情况，理论上不要太多二级结构以及3’端匹配即可；不过重复的序列也不能太多，以免移码；9. 从下游终止密码子开始向前选择10-20bp均可，但最好保证最后两个是G或者C，以减少错配率；10. 选择complementary sequence，在N端补齐下游酶切位点，如果tag在C端（即下游），则在第9点中应该从终止密码子前开始选择（即舍弃终止密码子），并且下游引物也要对框，如果tag在N 端，则下游引物不需要对框，只要在N端加上下游酶切位点，再根据情况加上2个保护碱基，然后检测二级结构，原则上3’端部匹配即可。
不过重复的序列也不能太多，以免移码；11. 将设计好的上下游引物放在一起检测二级结构，原则上3’端部匹配即可。
不过重复的序列也不能太多，以免移码；12. 最后在NCBI的primer Blast网站上比对引物序列，看是否基因特异性的。
RACE引物设计原则用于RACE引物设计的原则引物设计的优劣对于做RACE是至关重要的，如果引物的特异性不好，就会给实验带来许多麻烦，甚至扩增不到我们这实验预期想的目的产物。
以下是结合一些网上的资料和我们在多次实验中总结出的引物设计的原则。
兼并引物的设计用兼并引物扩增，一般是我们想克隆的物种中没有我们想要克隆的目的基因的信息，但在其它物种中是存在的，我们就可以将其它物种该基因的序列进行序列同源性比较，同源性高的区域就是兼并引物设计的侯选区；或是假如这些基因的核酸序列的同源性不高，没有合适的选择区域，则我们可以用将其它物种该基因的序列翻译成氨基酸序列，然后进行序列同源性比较，同源性高的区域一般是保守区，再用保守区氨基酸对应的核酸序列设计兼并引物，但兼并引物兼并度（即单条引物上各兼并碱基之和的乘积）应小于1000 ，且兼并引物的3’端应尽量减少兼并性，并使3’端最后6个碱基的G或C的含量大于50%，以提高特异性；此外，假如我们只知道氨基酸序列，则可根据不同物种密码子的偏好性来设计引物。
有部分碱基序列的引物设计对于用差异显示(Differential Display Reverse Tranion ,DDRT)或者抑制减法杂交（Suppressive Subtractive Hybridization ，SSH）、RNA指纹、EST芯片及兼并引物扩增等方法得到DNA片断，要克隆全长cDNA，或者用同源序列克隆其他物种中的同源基因，3'端的扩增一般都不成问题，难就难在5'端的片断扩增。
利用SMART技术将SMART引物自动加入cDNA的5'端，不但能避免加接头或者加一串碱基的麻烦，而且能得到全长的cDNA 5'端。
只要少至25个碱基的已知序列即可克隆出全长的cDNA[4]。
如你欲克隆的基因在GenBank已列出的26种生物中，且是多基因家族的一个成员，则应先上网进行BLAST(/BLAST)，为了提高扩增的特异性，应选择没有同源性的区域设计引物。
利用DNA分子指纹图谱技术检测小麦粉中害虫的研究鲁玉杰;袁园;刘凤杰;王争艳;何向楠【摘要】为开发快速检测我国成品粮中害虫的技术,研究了DNA分子指纹图谱技术检测小麦粉中主要害虫的碎片和虫卵的含量.结果表明,通过对害虫的延长因子EF1基因片段引物的筛选和PCR条件的选择,确定了有效地检测出来小麦粉中的赤拟谷盗、杂拟谷盗和锯谷盗的成虫碎片、幼虫和卵通用引物和PCR扩增条件.通过改良的PCR技术可在4h内快速检测杂拟谷盗、锯谷盗的卵、幼虫和成虫碎片.最低检出限为可检测出小麦粉中0.05％(m/m)卵和幼虫、1％成虫的碎片,灵敏度超过了国际标准.DNA指纹图谱中电泳条带亮度(y)与被检测的不同害虫碎片含量(X)成正相关,回归方程为Y=858.36X+ 74.540相关系数R为0.961 9.利用该技术检测随机取样的小麦粉中成虫的碎片,检测的准确率最高可达80.56％.结果说明了利用DNA分子指纹图谱技术可快速检测出小麦粉中害虫的碎片、幼虫和卵含量,并可预测小麦粉中害虫的感染程度.本研究为开发快速小麦粉中害虫的快速检测技术具有重要的参考意义.【期刊名称】《中国粮油学报》【年(卷),期】2018(033)011【总页数】6页(P105-110)【关键词】DNA分子指纹图谱;害虫碎片;赤拟谷盗;杂拟谷盗;小麦粉;最低检测限【作者】鲁玉杰;袁园;刘凤杰;王争艳;何向楠【作者单位】河南工业大学粮油食品学院;河南省小麦储藏协同创新中心,郑州450001;河南工业大学粮油食品学院;河南省小麦储藏协同创新中心,郑州450001;河南工业大学粮油食品学院;河南省小麦储藏协同创新中心,郑州450001;河南工业大学粮油食品学院;河南省小麦储藏协同创新中心,郑州450001;河南工业大学粮油食品学院;河南省小麦储藏协同创新中心,郑州450001【正文语种】中文【中图分类】TS201.6;Q969.98小麦粉中害虫碎片的数量是面粉质量等级的划分的重要指标。
自己做过一些简并引物，现将我利用生物信息学资源设计简并引物的各个步骤作一个总结，各位战友可将各自的心得体会写下，以便大家交流！！！
一、利用ncbi搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列
因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。
首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。
随后利用这一序列使用BLASTp(通过蛋白查蛋白)，在整个Nr数据库中中查找与之相似的氨基酸序列。
二、对所找到的序列进行多序列比对
将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，可选工具有Clustal W，也可在线分析[url][/url]/clustalw/ 。
其结果入下图所示,所有序列的共有部分将会显示出来。
“*”表示保守，“：”表示次保守。
三、确定合适的保守区域
设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50～400个aa为宜，使得pcr产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个aa残基，因为每条引物至少18bp左右。
若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个aa的保守区域，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘相近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对。
总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次比对的结果反复调整。
最终目的就是有两个6个aa且两者间距离合适的保守区域。
四、利用软件设计引物
当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，其中pp5支持简并引物的设计（关于其的使用请见笔者的另一个帖子/bbs/post/view?bid=67&id=8798113&sty=1），将参与多序列比对的序列中的任一条导入pp5中，再将其翻译成核苷酸序列，有密码子简并性，其结果是有n多条彼此只相差以个核苷酸的序列群，该群可用一条有简并性的核苷酸链来表示（其中R＝A／G，Y＝C／T，M＝A／C，K＝G／T，S＝C／G，W＝A／T，H＝A／C／T，B＝C／G／T，V＝A／C／G，D ＝A/G /T,N=A／C／G/T），该具有简并性的核苷酸链必然包含上一步中找到的氨基酸保守区域的对应部分，在pp5中修改参数，令其在两个距离合适的保守的nt区域内寻找引物对，总之要保证上下游引物都落在该简并链的保守区域内，结果会有数对，分数越高越好。
五、对引物的修饰
若得到的引物为：
5-NAGSGNGCDTTANCABK-3
则其简并度＝4×2×4×3×4×3×2=2304，很明显该条引物的简并度多高不利于pcr。
我们可以通过用次黄嘌呤代替N（因为次黄嘌呤能很好的和4种碱基配对）和根据物种密码子偏好这两种方
法来降低简并度（有个查密码子偏好的数据库我以前发过大家搜索一下把）。
最后，这样子设计出来简并引物对，适用于用于比对的氨基酸序列所属物种及与这些物种分类地位相同的其他物种。
我来做过兼并引物的设计，谈点粗浅的看法，并推荐个比较好的方法。
由于引物的简并性的问题，所设计的引物通常简并性过高，导致有效引物利用率降低，PCR产物非特异性增高。
虽然减少简并引物长度可以相对减少简并性，但随之而来的问题是引物的Tm值过低，有时不得不设计第二对引物对PCR产物进行二次扩增，即巢式PCR，或者需要与Touchdown PCR相结合使用。
与通常设计的简并引物不同，利用CodeHop方法设计简并引物。
引物由两部分组成：引物3’端为根据4-5个保守氨基酸设计的核心简并区（3’core region），长度只有11-15个碱基；引物5’端为非简并性夹板结构（5’consensus clamp region）。
5’端夹板结构是根据密码子偏向性设计的一致性序列，它最大程度的预测了保守性氨基酸的编码序列，其长度取决于所需的退火温度。
这样设计的优点在于既减少了引物的简并度，又提高了引物的退火温度，保障了PCR产物的特异性。
标准简并PCR在聚合反应的晚期，随着产物的增多，引物的非特异性结合的现象增多；而CodeHop PCR的晚期，这种现象大为减少。
实验结果表明，按这种方法设计的简并引物非特异性扩增减少，是一种快捷方便的简并引物设计方案。
其与标准的简并PCR比较见图。
关于CODEHOP方法，可参见文献
Timothy MR, Emili RS, Jorja GH, et al. Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers for amplication of distantly related sequenes[J]. Nucleci Acids Reseach, 1998,26(7):1628
Rose TM, Henikoff JG, Henikoff S. CODEHOP (COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer) PCR primer design[J]. Nucleic Acids Res. 2003;31(13):3763-6.
人宫颈粘液抗菌机制:抗菌多肽的分离鉴定。
李明，潘小玲，王莉莉等。
中华医学杂志。
2005,85（16）:1109-12
粗浅的一点经验，多交流！。
