绿僵菌发酵工艺的研究进展_梁昌聪

绿僵菌毒素的研究进展
张秋
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2009(037)030
【摘要】绿僵菌毒素是绿僵菌产生的具有杀虫活性的次生代谢物质,在农业害虫防治方面具有广阔的应用前景.根据其分子量和结构分为低分子量毒素和高分子量蛋白毒素两大类,对其分子结构、种类、提取方法、生物活性、产生条件等进行了综述.
【总页数】3页(P15077-15079)
【作者】张秋
【作者单位】辽宁省营口市鲅鱼圈出入境检验检疫局,辽宁,营口,115007
【正文语种】中文
【中图分类】S182
【相关文献】
1.绿僵菌毒素的提取 [J], 李农昌;樊美珍
2.绿僵菌 HC 毒素合成酶基因的生物信息学分析 [J], 张杰;阮先乐;侯小歌;王俊英;胡炳义
3.绿僵菌产毒素能力及产毒素动态分析 [J], 徐金柱;秦长生;杨华;赵丹阳;揭育泽;邱华龙;
4.绿僵菌产毒素能力及产毒素动态分析 [J], 徐金柱;秦长生;杨华;赵丹阳;揭育泽;邱
华龙
5.绿僵菌毒素的提取方法 [J], 李农昌;樊美珍;朱玮;柴长宏
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绿僵菌在3种不同培养基上培养时产孢量的影响因素刘磊;杨腊英;梁昌聪;黄志;柴奇;黄俊生【摘要】分析了绿僵菌菌株在3种不同培养基上培养时其产孢量的2个影响因素(初始接种浓度和相对湿度),得出菌株在3种不同培养基上培养时须分别配以适宜的接种浓度和相对湿度,以获取最大产孢量(燕麦培养基:1×107cfu,mL,65%;PPDA培养基:1×106cfu/mL,85%;玉米粉酵母浸膏培养基:1×108cfu/mL,75%).另外,随继代培养代数增加,菌株在这3种培养基上前五代的产孢量比较稳定,第七代及之后的产孢量明显下降.根据3种培养基不同的功能,在PPDA培养基上培养菌株时要着重注意不同继代培养代数对产孢量的影响,其它2种培养基培养菌株一般不超过五代,产孢量比较稳定.【期刊名称】《热带作物学报》【年(卷),期】2010(031)003【总页数】5页(P469-473)【关键词】绿僵菌;培养基;产孢量;初始接种浓度;相对湿度;继代培养代数【作者】刘磊;杨腊英;梁昌聪;黄志;柴奇;黄俊生【作者单位】海南大学农学院,海南儋州,571737;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,海南省热带农业有害生物检测监控重点实验室,海南儋州,571737;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,海南省热带农业有害生物检测监控重点实验室,海南儋州,571737;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,海南省热带农业有害生物检测监控重点实验室,海南儋州,571737;海南大学农学院,海南儋州,571737;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,海南省热带农业有害生物检测监控重点实验室,海南儋州,571737;海南大学农学院,海南儋州,571737;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,海南省热带农业有害生物检测监控重点实验室,海南儋州,571737【正文语种】中文【中图分类】TQ458随着化学农药的危害日益加重，生物农药逐渐被人们所重视。

自从1879年梅契尼柯夫最先从奥地利金龟上分离到金龟子绿僵菌以来，已有100多年的历史。

近20年来，随着巴西和澳大利亚广泛使用金龟子绿僵菌防治甘蔗和牧草害虫取得较大进展，以及在非洲用黄绿绿僵菌（Metarhizium flavoviride ）防治蝗虫实验的初步成功，借助于分子生物学技术和基因工程技术的大规模使用，人们在关注绿僵菌的同时，对它的研究领域也在不断深入。

1绿僵菌属的系统分类现状自Sorokin 于1883年建立绿僵菌属Metarhizium 以来，先后发表10余个种，由于不同作者采用的标准不一致，故分类状况比较混乱，目前国际上广泛接受的分类观点是Tulloch 建立的，他将绿僵菌属定为2个种，包括金龟子绿僵菌和黄绿绿僵菌，金龟子绿僵菌包括小孢变种和大孢变种［1］。

近年来，国内相继发表多个新种，但由于对其特征描述不尽完善收稿日期：2009－04－20基金项目：国家科技支撑计划项目（2007BAD30B03）；广西科学研究与技术开发计划项目（桂科基0778006－8）；广西农业科学院科技发展基金项目［2006004（Z ）］作者简介：丁苗苗（1984－），女，安徽淮南人，硕士研究生，主要从事农业昆虫与害虫防治研究工作。

绿僵菌的研究现状及进展丁苗苗1，于永浩2，3，曾涛2（1广西大学农学院，南宁530005；2广西农业科学院植物保护研究所，南宁530007；3华南农业大学资源环境学院昆虫学系，广州510640）摘要：介绍了近年来国内外在绿僵菌的分类、分离与鉴定方法、生物学特性和应用等方面的研究进展，指出绿僵菌在分子系统学研究、基因遗传育种、剂型的改进和扩大防治对象上已取得较大的进展，但与Bt 等杀虫微生物的研究相比还有较大差距。

提出应加强对高毒力绿僵菌菌株的筛选；在防治害虫时尽量减少湿度、紫外线以及土壤微生物和土壤物理、化学性质等对绿僵菌防效的影响，以提高绿僵菌对靶标害虫的防治效果。

关键词：绿僵菌；分类；分离鉴定；生物学特性；应用；研究进展中图分类号：S476+.12文献标识码：A文章编号：1002－8161（2009）11－1443－05Current situation and development research onMetarhizium spp．DING Miao－miao 1，YU Yong－hao 2，3，ZENG Tao 3（1Agricultural College ，Guangxi University ，Nanning 530005，China ；2Plant Protection Institute ，Guangxi Academy ofAgricultural Sciences ，Nanning 530007，China ；3Department of Entomology ，College of Resources and Environment ，South China Agricultural University ，Guangzhou ，Guangdong 510640，China ）Abstract ：The present study summarizes the researches on classification ，separation and identification method ，bio-logical characteristics and applications of Metarhizium spp．，at China and abroad during recent years．Recently ，the molec-ular systemic research ，genic inheritance breeding ，improving dosage formulation and enlarging control objects in Metarhizium spp．made a great progress ，but there is still a large gap compared to that of insecticidal microorganism such as Bt ．Therefore ，the screening of highly toxic strain of Metarhizium spp．should be explored ，and the influence of humidi-ty ，ultra－violet radiations ，soil microorganism ，and soil physical and chemical characteristics affecting Metarhizium spp．should be studied to enhance the controlling effects of Metarhizium spp．on target insect pests．Key words ：Metarhizium spp．；classification ；separation ；identification ；biological characteristics ；application广西农业科学2009年第40卷第11期1443··广西农业科学2009年第40卷第11期和各自所依据分种标准不一，因此也出现了对本属的鉴别性状和颜色变化幅度等特征的描述不够明确具体的现象。

绿色发酵技术及其应用于酿造工业的研究进展随着全球环境保护意识的不断提高，绿色发酵技术逐渐得到人们的关注和认可。

绿色发酵技术是指在保持良好发酵效果的同时，尽可能减少或消除酿造过程中对环境的污染。

近年来，绿色发酵技术在酿造工业中的应用越来越广泛，本文将对其研究进展进行探讨。

一、绿色发酵技术的研究现状绿色发酵技术是酿造工艺绿色化的有效途径之一。

在绿色发酵技术中，选择合适的微生物菌种，运用优化发酵参数和新型发酵辅料等手段，可以提高酿造效率、提高工艺稳定性以及提高工艺产率。

目前，绿色发酵技术在酿造酸奶、酸豆腐等乳品以及啤酒、白酒、黄酒等酒类制造中的应用正在逐渐得到推广和普及。

（一）绿色发酵技术在酸奶制造中的应用酸奶是由乳酸菌发酵牛奶而成的乳制品，因其有利于消化和改善健康而备受消费者青睐。

在传统的酸奶酿造工艺中，常规使用的发酵剂为传统混合革兰氏阳性乳酸菌。

随着生态环境的变化和消费者对食品品质追求的提高，对于酸奶的绿色生产也提出了更高的要求。

目前，国内外大量研究人员已经开始采用生态菌的发酵技术，通过生态菌代替传统混合革兰氏阳性乳酸菌，进一步实现酸奶生产的绿色化。

同时，在酿造工艺中添加油酸钙、太空植物酪氨酸酶等成分，能够提高酸奶的营养价值和口感。

（二）绿色发酵技术在酿造黄酒中的应用黄酒是一种古老的传统发酵酒，因其微生物发酵过程对环境没有大量污染而备受青睐。

传统的黄酒生产中，常采用传统发酵工艺和传统菌种，而绿色发酵技术则引入新型发酵菌株和新型发酵辅料，从而实现在不影响其品质的情况下更加绿色化。

新型发酵菌株的应用可以提高黄酒的口感、风味和营养价值，同时新型发酵辅料的运用则可以对黄酒发酵过程进行控制，优化发酵条件。

例如，在黄酒的发酵中添加固态培养发酵粉料、糠床等，可以改善黄酒的品质和口感，并且减少污染物的排放。

二、绿色发酵技术在酿造工业中的应用前景绿色发酵技术的应用前景非常广阔，将成为酿造工业可持续发展的主要方向之一。

淡紫拟青霉E16液体发酵工艺研究张建华;梁昌聪;刘磊;汪军;王伟伟;黄俊生【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2014(000)011【摘要】以活菌数为检测指标，通过单因子和正交试验对淡紫拟青霉 E16液体发酵工艺进行优化。

结果表明，淡紫拟青霉E16发酵最佳液体培养基配方为：白砂糖1.5％（质量分数，下同），大豆粉1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸锌0.01％；最佳发酵条件为：起始 pH 值6，500 mL 三角瓶装液量30％，接菌量5％，培养温度30℃，摇床转速150 r／min，培养时间4 d。

在最佳发酵培养基和发酵条件下，淡紫拟青霉E16产生的活菌数为9.80×109 cfu／mL，较优化前提高近1个数量级。

【总页数】6页(P87-92)【作者】张建华;梁昌聪;刘磊;汪军;王伟伟;黄俊生【作者单位】中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室/海南省热带农业有害生物检测与控制重点实验室，海南海口 571101;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室/海南省热带农业有害生物检测与控制重点实验室，海南海口571101;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室/海南省热带农业有害生物检测与控制重点实验室，海南海口571101;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室/海南省热带农业有害生物检测与控制重点实验室，海南海口571101; 海南大学环境与植物保护学院，海南海口 571101;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室/海南省热带农业有害生物检测与控制重点实验室，海南海口 571101;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室/海南省热带农业有害生物检测与控制重点实验室，海南海口 571101【正文语种】中文【中图分类】TQ920.6【相关文献】1.淡紫拟青霉液体发酵条件的优化 [J], 王曦茁;刘春秀;汪来发;苟大平;余明忠2.花生粕降解菌的筛选及液体发酵工艺研究 [J], 余水静; 吕伟超; 钱佳琳; 姚锋先3.淡紫拟青霉36-1液体产孢和发酵液的杀线虫活性 [J], 肖炎农;王明祖;付艳平4.淡紫拟青霉固体发酵工艺研究 [J], 高立红;江志阳;尹微5.淡紫拟青霉最佳液体培养基和发酵条件研究 [J], 夏振远;杨树军;李云华;祝明亮;李天飞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

绿僵菌的研究进展2005年4月Apr.2005热带农业科学CHINESEJOURNALOFTROPICALAGRICULTURE第25卷第2期V o1.25,No.2绿僵菌的研究进展①代鹏②宋妍许天委谢玉平黄俊生③(中国热带农业科学院环境与植物保护研究所海南儋州571737)摘要综述了近年来国内外对绿僵菌属的分类,绿僵菌入侵寄主过程中的相关基因的研究,剂型开发等方面的概况.关键词绿僵菌;分类现状;相关基因;剂型开发分类号$432.44;Q949.32;Q78AdvancesofResearchonMetarhiziumspp. DAIPengSONGYanXUTianweiXIEYupingHUANGJunsheng (EnviromentandPlantProtectionInstitute,CATAS,Danzhou,Hainan571737) AbstractThearticlesummarizestheresearchonclassingstatusofMetarhiziumspp.,correlati on geneinthebreakinginsectandthepreparationofMetarhiziumanisopliaeinrecentyears. KeywordsMetarhiziumspp;classifyingstatus;correlationgene;preparation真菌生防制剂具有触杀性,流行性,对环境安全和不易产生抗药性等特点.70%的昆虫真菌性病害,在害虫控制方面有巨大的潜力.对绿僵菌[Metarhiziumanisopliae(Metarhiziumspp.),Ma]的研究已有100多a的历史,但由于在发酵方法,剂型开发及环境制约等方面存在各种各样的问题,导致其防治效果不稳定,影响了其大规模的应用.直到1988年,金龟子绿僵菌制剂应用于澳洲甘蔗和牧草害虫的防治,其应用才算取得较大进展.应用绿僵菌防治地下害虫及非洲蝗虫也已取得初步成效,绿僵菌的研究和应用成了生物防治领域的一个热点.1绿僵菌属的系统分类现状11绿僵菌属的分类地位自从1879年MeqHHKOB首先大量繁殖绿僵菌防治奥地利丽金龟(,4nisopliaaustriacaHerbst)以来,绿僵菌就成为了害虫微生物防治的主角之一. 绿僵菌属(MetarhiziumSorokin)是Soroki13于1883 年建立的,它隶属于真菌门(Eumycota),子囊菌亚门(Ascomycotina),核菌纲(Pyren—mycetes),球壳菌目(Sphaeriales),麦角菌科(Clavisipitetaceae).自Sorokin建立绿僵菌属以来,先后发表10余个种.由于不同作者采用的标准不统一,故分类状况比较混乱.目前国际上被广泛接受的分类观点是Tulloch建立的,他将绿僵菌属定为2个种,即金龟子绿僵菌和黄绿绿僵菌,金龟子绿僵菌包括小孢变种和大孢变种….利用传统的分类方法很难区分绿僵菌属内各种群间的差异,而野生型菌株的遗传特性则提供了菌株间的遗传差异.现有资料表明,利用可溶性蛋白图谱能区分形态学上相似的种;酯酶同工酶区分绿僵菌突变株也明显表现出多态性,这可能与其遗传变异因子及环境因素有密切的关系.另外,分子标记方法用于绿僵菌的鉴定,分类,进化和其它各方面信息的研究,是当前和今后受重视的领域.①收稿日期:2004—12—30责任编辑/凌青根:// / rdnk@②代鹏(1978～),男,硕士,助理研究员.E-mai1:dapen008~163.tom.③通讯作者.一73—2005年4月热带农业科学第25卷第2期近年来,在DNA水平上研究遗传差异的技术早已被认可,并且已经成为研究虫生真菌群落遗传结构的有效方法.1.2绿僵菌属种间分类方法的应用限制性片段长度多态性(RFLP)和聚合酶链式反应(PCR)技术基础上的DNA随机扩增多态性RAPD方法,为研究绿僵菌的分类鉴定,系统发育,种内分型和地理型分布,及其生态学和流行学,提供了重要的检验手段.rDNA基因在进化中的高保守性和相关间隔区的多变性,使其成为研究分子系统中的最重要和应用最为广泛的工具之一.目前这项技术已广泛应用于绿僵菌的研究r2].Leal等用巢式PCR技术,将对不同地理来源和分离自不同寄主或土壤的40株绿僵菌菌株蛋白酶Prl基因扩增出来,然后用3种限制性内切酶(DdeI,HpaII和RsaI)消化扩增产物.酶切图谱共有15种类型,经聚类分析分为4组.在部分组的菌株间,其限制性酶切片断图谱和地理来源有一定的相关性[3].Fegen及Cobb等人于1993年同时首次将RAPD—PCR方法用于虫生真菌的研究.Fegen的研究发现,利用RAPD—PCR分析DNA片段长度的多态性可以得到相应的DNA遗传和进化等信息.Leal等用6种随机引物,对来自4个国家的20株绿僵菌进行RAPD研究.结果表明,多数菌株有特异RAPD—PCR图谱,一些菌株可表现明显的地理性, 另一些不同来源的菌株则不表现出地理差异r4,.我国学者刘兆伟,郭好礼等于1993年率先用Sanger法测定了几个种的绿僵菌的部分rDNA序列.结果表明,25S一635区域比其它2个区域具较高的突变率,可以准确地反映遗传关系[6].Drive和Milne的研究,是迄今为止最为详尽和完整的,基本解决了绿僵菌属的分类难题.他们共测定了121株绿僵菌菌株的ITS卜5.8S—ITS2 rDNA序列,其中26株有代表性菌株的序列数据在文中予以应用.综合Curran和他们的研究结果,建议将37株绿僵菌划分为3个种(金龟子绿僵菌,黄绿绿僵菌和白色绿僵菌),其中黄绿绿僵菌下分5个变种,金龟子绿僵菌下分4个变种.值得一提的是,他们将ITS1和ITS2的序列作为唯一的性状来进一74一行拉丁文描述,使ITS1和ITS2的序列成为绿僵菌分类最可靠的依据Ⅲ.2绿僵茵入侵过程中相关基因的研究昆虫病原真菌约有1000种,其中一些种类已成功用于蝗虫,粉虱,白蚁,蟑螂等害虫生物防治.近年研究较多的是金龟子绿僵菌(Ma),该菌含多种可降解昆虫外表皮的酶,已从中克隆到多种致病相关基因.2.1Prl基因有研究结果表明,Ma产生的昆虫表皮水解酶在高水平情况下与害虫发病机理有很大的关系.胞外弹性凝乳蛋白酶Prl基因是最早被克隆的昆虫表皮降解蛋白基因.该基因表达的2种蛋白PrlA和PrlB具有很强的分解昆虫体壁的功能,它主要降解酪蛋白,凝乳弹性蛋白,降血凝乳蛋白和胶原质蛋白等,在对昆虫的致病力中起着重要的作用.PrlA和PrlB分别位于金龟子绿僵菌不同染色体上,所编码的氨基酸序列有54%的同源性[8--10]. PrlA基因的一级结构和丝氨酸肽链内切酶——枯草杆菌蛋白酶具有相当高的同源性.PrlA与枯草杆菌蛋白酶K的氨基酸序列相似性达61%,但PrlA降解烟草天蛾体壁的能力是蛋白酶K的2倍…]. Screen等分析了PrlA基因启动子的序列,发现存在CREA和AREA结合位点.条带移位实验证实了构巢曲霉GST—CREA融合蛋白能结合CREA上3个位点中的2个.Joshi等利用差异显示RT—PCR得到1个新的类枯草杆菌蛋白酶基因(PrlB),核型分析表明,二者位于不同的染色体上,通过对绿僵菌白僵菌Prl基因的cDNA分析,发现PrlA和PrlB均首先被合成为1个大的前体蛋白,包括1个信号肽,1个前体肽和1个成熟的蛋白分子,它们的前体蛋白和成熟蛋白分子量大小均不相同.StLeger于1987年发现并于1993年克隆到了Prl基因.Prl蛋白一直被认为在绿僵菌侵染昆虫过程中具有不可代替的重要作用,但王成树等人于2000年首次报道了缺失Prl基因的野生型菌株依然保持了其毒力特性.野生型Ma菌株V275在初期单孢分离过程中发现了3株缺失弹性凝乳蛋代鹏等绿僵菌的研究进展白基因PrlA和PrlB的突变株,经嵌套PCR扩增和Southern杂交实验,证明了该基因的确已丢失.28srDNA保守序列分析比对证明了该突变体都是金龟子绿僵菌,但形态学和遗传与野生型差异明显.RAPD分析表明,二者之间的整体遗传相似性低于70%.生物测定发现,突变菌株对Tenebno molitor致死能力仅比野生型菌株低20%,而对Galleriamellone的致死能力却相当.因此,王成树指出,在人造培养基上培养的绿僵菌缺失Prl基因是一种常见现象,应该得到足够的重视[1.2.2Pr2基因在昆虫病原真菌中另一个重要的内切蛋白酶是丝氨酸类胰蛋白酶,也是一组碱性蛋白同工酶. Smithson等从绿僵菌液体培养基中通过阴离子交换色谱得到丝氨酸类胰蛋白酶Pr2,并对N一末端序列进行了测定[1.利用寡脱氧核糖核酸探针,从绿僵菌的基因文库中钓出该蛋白酶基因.经研究发现,该基因编码一个由254个氨基酸组成的蛋白质,含有2个长度分别为94和40bp的内含子.信号序列断裂分析表明,Pr2的同工型Tryl在它的N末端含有21个氨基酸的信号肽,产生一个含226个氨基酸成熟蛋白.Pr2基因编码的丝氨酸蛋白酶可以水解酪蛋白和白蛋白,但不能降解凝乳弹性蛋白.StLeger等人的研究结果表明,Pr2是Prl活性的4%～10%,而Cole等人的研究结果是5.4%～26%.液体培养发现,在接种绿僵菌后48h,即可检测到Pr2的活性,而到72h才检测到Prl的活性,因此认为,Pr2可能在Prl的诱导和激活方面起着重要作用n.2.3Pr3及Pr4基因StLeger在研究过程中发现,Pr3是一种酸性内切水解蛋白酶,pH5.0～5.5,等电点低,目前对其组成及作用机制仍不太清楚.Pr4表现出胰岛素的特性,但根据其特性和活性研究,将其划分为半胱氨酸蛋白酶,其活性是Prl的51%,远高于Pr2.2.4毒素毒素基因是编码"环状六肽毒素"合成酶的基因.通过研究不同来源的绿僵菌的"破坏素"的合成酶的基因序列,发现该类毒素中每一个氨基酸都有一个酶化的区域,每个域内有许多的保守序列.目前已发现了不少昆虫病原真菌毒素,但尚未开发出与毒素相关的商业制剂[1.Mollier将这些毒素分为两大类:低分子量毒素和高分子蛋白毒素.破坏素(destruxin)是Kodaira从金龟子绿僵菌[anisopliae(Metschn.)Sorokin]的培养液中分离到的低分子量的环缩肽.当时从滤液中分离出6 种环缩肽,其中2种的杀虫活性高,分别命名为destruxinA和destruxinB,二者结构类似,均由分丙氨酸,丙氨酸,撷氨酸,异亮氨酸和脯氨酸这5种氨基酸组成.破坏素对竹节虫,大蜡螟等昆虫表现出毒性.用破坏素进行体腔注射后,不同昆虫表现的症状不同,多数鳞翅目(Lepidoptera)昆虫表现为强直性麻痹.从金龟子绿僵菌中分离出的细胞松弛素(cytochalasins)是一种吲哚环结构毒素,细胞松弛素对哺乳动物有急性毒性,可抑制血细胞的运动,降低血细胞的吞噬能力[1.提纯破坏素主要是采用吸附法,即将绿僵菌培养液的滤液用7g/L的活性炭吸附,再用体积分数为50%的丁醛水溶液将活性物质从活性炭上洗脱下来,然后分离黄色相,真空喷雾浓缩,用苯充分萃提.苯液过中性氧化铝柱子,然后分别用含5%和10%(体积分数)乙醇的苯洗脱,分开收集,便可得到破坏素A(简称DA)和破坏素B(简称DB),苯油经重结晶即可得无色的DA和DB的晶体.李农昌以金龟子绿僵菌小孢变种(anisopliaeSorokinvat. anisopliaeTulloch)为材料,将其菌丝体捣碎,过滤浓缩后得黄色粘稠状粗提物,然后对粗提物进行薄层层析,最终也纯化到了破坏素[1.目前对昆虫病原真菌毒素研究较多的是小分子环缩肽类和可降解寄主体壁的酶类,对其研究主要还是集中在实验室内,直接应用于防治田间害虫的实例尚未见报道,主要是因为其发酵含量低,对哺乳动物有急性毒性,并且提取和制造工艺繁琐,目前还不能产生较好的经济效益.3绿僵菌剂型的开发研究3.1绿僵菌生产工艺的研究75—2005年4月热带农业科学第25卷第2期在绿僵菌生产工艺方面,单纯的液体发酵生产的孢子或菌体,因活性和耐储性降低而受到限制.主要采用传统的液固双相发酵生产工艺生产真菌孢子粉,固相发酵阶段存在搅拌不均,通透性差,发酵周期长和设备价格偏贵等问题.国内多采用浅盘,窗纱或无纺布开放式生产模式,空间利用率低,容易感染杂菌,产品质量不稳定,成为阻碍真菌生防制剂产业化发展的重要原因之一.另外,太阳光紫外线是一种影响金龟子绿僵菌田间使用效果的主要影响因子.Drauzio等人的研究结果表明,绿僵菌对紫外线相当敏感,且用PDA,PDAY等人工培养基生长的绿僵菌对紫外线的敏感度要低于直接用昆虫体培养的绿僵菌,其中稻谷类人工培养基能显着提高绿僵菌对紫外线的耐受性[1B]. Braga等提出,即使室外紫外线强度低于致死剂量,也会对真菌孢子的致病力及萌发速率产生一定影响n9j.3.2绿僵菌剂型的开发研究在长期的剂型研究过程中,真菌杀虫剂剂型研究取得了较快的发展.到目前为止,真菌杀虫剂主要剂型有粉剂,可湿性粉剂,乳剂,油剂,干菌丝,微胶囊等.其中,已大面积应用的绿僵菌剂型主要是粉剂,干菌丝和油剂等.据国外报道,醇烷氧基化合物也是一种有效的乳化剂.与水剂相比,油剂在低的相对湿度下更有利于孢子的萌发,同时在高温下也更能延长孢子的寿命.油剂还有利于孢子对疏水基质的吸附,如昆虫体壁或植物表面]. Inyang等研究了溶剂油对黄绿绿僵菌(anisopli oe)分生孢子活性的影响,结果表明,菜子油,花生油或色拉油是较好的溶剂油,制成的油剂(加有抗氧化剂)在17℃下贮藏127周后的孢子萌发率仍达到60%C.目前国外研究的真菌生防制剂大概有100多种,其中主要是真菌杀虫剂.除草剂,杀菌剂和杀线虫剂也在不断增加.杀虫制剂包括白僵菌14个,绿僵菌7个.其中,影响最大且最成功的范例,是英国CABIBioscience蝗虫生物防治国际合作项目(LUBILOSA)研制的杀蝗绿僵菌生物农药,已在非洲注册登记,投产,大面积用于沙漠蝗的防治,一76一施药l0～15d后防效达到90%以上,成为有效的蝗虫生防手段.澳大利亚蝗虫生物防治研究项目(CSIRO)研制出了杀蝗绿僵菌生物农药,并用于大面积草原蝗虫的防治,对蝗虫天敌等非目标生物安全.EcoScience绿僵菌产品(Bio—Path,Bio—Blast)用于防治蟑螂,白蚁;美国Ecoscien的绿僵菌产品(Bio—Path,Bio—Blast)防治蟑螂和白蚁;巴西和委内瑞拉的绿僵菌产品(Metaquino,Cobican)防治甘蔗沫蝉等等.我国对杀虫真菌制剂的研究,主要是重庆真菌农药研制工程中心获得的杀蝗绿僵菌孢子母粉和杀蝗生物制剂"100{L/mL杀蝗绿僵菌油悬浮剂",已在我国北方部分蝗虫发生省区使用和推广.参考文献1TullochM.ThegenusMetarhizium.Transactionof theBritishMycologicalSociety,1976,66:407～4112黄勃,樊美珍,李增智.绿僵菌属系统分类的研究进展.安徽农业大学,2002,29(2):169～1723LealSCM,BertioliDJ,ButtTM,eta1.Amp1ifi—cationandrestrictionendonucleasedigestionof thePrlgeneforthedetectionandcharactization ofMetarhiziumstrains.MycologyResearch,1997,101:257～2654CobbBD,ClarkonJM.Detectionofmolecular variationintheinsectpathogenicfungusMetarhiz—iumusingRAPD-PCR.FEMSMicrobiologyLetter, 1993,112:319~3245LealSCM.Characterizationofisolatesoftheen- tomopathogenicfugusMetarhiziumanisopliaeby RAPD-PCR.MycologyResearch,1994,98(9):1077～10886刘兆伟,郭好礼,KurtzmanCP.由部分核糖体RNA序列确定的绿僵菌属种系统发育关系.真菌,1994,13(2):139～1517DriverF,MilnerRJ,TruemanWH.Ataxonomis revisionMetarhiziumofbasedonaphylogenetic analysisofrDNAsequencedata.MycologyResearch, 2000.104:134～1508裴炎,冀志霞,杨星勇,等.绿僵菌分解昆虫外壳蛋白酶MAP一21的纯化与特性.微生物,2000,40 (3):306~31I代鹏等绿僵菌的研究进展9ColeSCJ,CharnleyAK,CooperRM.Purification andparticalcharacterizationofanoveltrypsiir一1ikecysteineproteasefromMtarhiziumanisopliae. FEMSMicrobio1ogyLetters,1993,113:189～19610StLegerRJ,BidochkaMJ,RobertsDW.Construc—tionofanimprovedmycoinsecticideoverexpress—ingatoxicprotease.ProceedingsoftheNational AcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmeri—ca,1996,93(13):6349~635411StLegerRJ,RobertsDW.Engineeringimproved mycoinsecticides.TrendsinBiotechno1ogy,1997,15(3):83~8512SmithsonSL,PatersonIC,BaileyAM,eta1. Cloningandcharacterizationofageneencodinga cuticle—degradingproteasefromtheinsect pathogenicfungusMetarhiziumanisopliae.Gene, 1995,166(1):161～16513StLegerRJ,JoshiL,RobertsD.AmbientpHisa majordeterminantintheexpressionofcuti—cle—degradingenzymesandbydrophobinby Metarhiziumanisopliae.AppliedandEnvironmental Microbiology,1998,64(2):709~71314WangChengshu,MiItonA,TariqM,eta1.Detec—tionandcharacterizationofPrlvirulentgene deficienciesintheinsectpathogenicMetarhizium anisopliae.FEMSMicrobiologyLetter,2002,213:25l～25515沈坤发,茅绍雄,林光明,等.主要虫生真菌的分子生物学研究概述.江西农业大学,2001,5(23): 140～14416李建庆,张永安,张星耀,等.昆虫病原真菌毒素的研究进展.林业科学研究,2003,16(2):233~23917李农昌,樊美珍,朱玮,等.绿僵菌毒素的提取方法.林业科技通讯,1989(1O):30~3118DrauzsioENRangel,GibertoULBraga,StephanD, eta1.Variationsin[IV—Btoleranceandgermina—tionspeedofMetarhiziumanisopliaeconidiapro—ducedoninsectsandartificalsubstrates.Jour—nalofInvertebratepathology,2004,115:207～21119BragaGUL,F1intSD,Mi1lerCD,eta1.Both solarUV AandUvBradiationconidialculturabi1i—tyanddelaygerminationintheentomopathogenic fugusMetarhiziumanisopliae.Photochemistryand Photobio1ogy,2001,74:734~73920王滨,樊美珍,李增智.真菌杀虫剂剂型的研究与应用.安徽农业大学,2003,30(2):206~20921InyangEN,McCartneyHA,OyejolaB,eta1.Ef—fectofformulation,applicationandrainonthe persistenceoftheentomogenousfungusMetarh~ium anisopliaeonoilseedrape.MycologyResearch,2000,104(6):653～66(上接第52页)27NinS,BenniciA,RoselliG,eta1.Agrobcteri—am—meadiatedtransformationofArtemisiaabsir~hium L.(wormwood)andproductionofsecondarymetabo一1ites.PlantCellReports,1997,16(1O):725～73028赵亚华,何平,高向阳.根癌农杆菌介导的mMT—I cDNA转化枸杞及其表达的研究.中国农业科学, 2000,33(2):92~9729费厚满,梅康凤,沈听,等.发根农杆菌对绞股蓝的转化及毛状根中皂甙的产生.植物,1993,353233(8):626~631盛世红,陈惠明.防风悬浮细胞的原生质再生植株培养.植物,1994,32(4):268~273谭红,龚革,李志东,等.利用原生质体诱变技术筛选脱落酸高产菌株.应用与环境生物,1998, 4(3):281～285周延清,苑保军,张根发,等.决明原生质体的分离与培养研究.华北农,1998,13(3):107～1l1孙如勇,安锡培.植物原生质体培养.北京:科学出版社,1991.108～116—77—。

中国生物防治CH INESE JOURNAL OF BI OLOGI CAL CONTROL　1996,12(4)182～187　绿僵菌研究的新进展高　松(中国农科院生物防治研究所,北京　100081)CURRENT STATUS OF STUD IES ON M E TARH IZ IUM SPP.GAO Song(In stitu te of B i o logical Con tro l,Ch inese A cadem y of A gricu ltu ral Sciences,B eijing100081)自从1879年Мечников首先大量繁殖绿僵菌防治奥地利丽金龟(A n isop liae austriaca)以来,绿僵菌就成为害虫微生物防治的主角之一。

由于本世纪初人们对绿僵菌防治效果不稳定感到失望,对绿僵菌的研究仅限于分类、培养特性、感染机制及其影响因素等方面。

近20年来,随着巴西和澳大利亚广泛使用金龟子绿僵菌防治甘蔗和牧草害虫取得较大进展,以及在非洲用黄绿绿僵菌防治蝗虫的试验初步成功,对绿僵菌的研究进入了一个高潮。

本文着重总结了1990年以后的研究进展,其它有关绿僵菌的研究成果详见梁宗琦(1992)、樊美珍等(1994)的论著,这里不再赘述。

1　绿僵菌系统学进展1.1　分类现状　自So rok in于1883年建立绿僵菌属M eta rh iz ium以来,先后发表十余个种,由于不同作者采用的标准不统一,故分类状况比较混乱,目前国际上被广泛接受的分类观点是T u lloch(1976)建立的,他将绿僵菌属定为2个种,包括金龟子绿僵菌和黄绿绿僵菌,金龟子绿僵菌包括小孢变种和大孢变种。

1986年,Rom bach等进一步将黄绿绿僵菌分为黄绿变种(M.f lavov irid e var.f lavov irid e)和小孢变种(M.f lavov irid e var.m inus),樊美珍等(1994)依据瓶梗和分生孢子的形状及排列方式,总结了国内发现的新种,将绿僵菌属定为7个种或变种:白色绿僵菌(M.a lbum Petch)、金龟子绿僵菌小孢变种(M.an isop liae M etsch So rok in var.an isop liae T u lloch)、金龟子绿僵菌大孢变种[M.an isop liae M etsch So rok in var.m a j us (John ston)T u lloch]、双型孢绿僵菌(M.bif o m isp orae L iang et L iu)、黄绿绿僵菌黄绿变种(M.f lavov irid e Gam s&Rozsypal var.f lavov irid e Rom bach,H um ber et Roberts)、黄绿绿僵菌小孢变种(M.f lavov irid e Gam s&Rozsyp al var.m inus Rom bach,H um ber et Roberts)、戴氏绿僵菌(M.ta ii L iang et L iu)。

专利名称：一种绿僵菌菌浆膜的发酵方法
专利类型：发明专利
发明人：蔡守平,曾丽琼,杨际伟,宋海天,何学友,詹芳芳,徐云,汤陈生
申请号：CN202210261535.9
申请日：20220316
公开号：CN114540207A
公开日：
20220527
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及虫生真菌发酵技术领域，特别涉及一种绿僵菌菌浆膜的发酵方法，包括如下步骤：S1、将混合有绿僵菌菌液、营养液和稠化剂的菌浆涂布在基板上，以在所述基板表面形成0.1～0.3cm厚度的菌浆膜；S2、按如下发酵条件对所述菌浆膜进行发酵：发酵时间在0～96h时，发酵温度为23～25℃，湿度为98％～100％；发酵时间在96～168h时，发酵温度为25～27℃，湿度为85％～90％；发酵时间至168h后，对菌浆膜进行低温干燥并收集孢子；所述低温干燥的条件为干燥温度5～10℃，干燥40～60min；所述收集采用刮板、刷子或吸尘器收集。

通过该方法收集得到的分生孢子含量可达到500亿孢子/g。

申请人：福建省林业科学研究院
地址：350000 福建省福州市晋安区新店镇上赤桥35号
国籍：CN
代理机构：福州市博深专利事务所(普通合伙)
代理人：董晗
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绿僵菌菌株JF-813的抗逆性黄志;梁昌聪;杨腊英;刘磊;黄生精;黄俊生【期刊名称】《江苏农业学报》【年(卷),期】2009(025)005【摘要】通过测定菌落生长速度和孢子萌发率对绿僵菌菌株JF-813抗逆性进行了研究,结果表明:菌株JF-813有较强的抗逆性,在pH值4～9范围内的PPDA培养基(添加1%蛋白胨的PDA培养基)中均可以生长,其最适pH值为8;在NaCl浓度为0.05～0.25 mol/L条件下,NaCl对菌株JF-813的生长有一定的促进作用,浓度越大促进越明显,该菌株有较强的耐盐能力;高温条件及紫外光对绿僵菌菌株JF-813孢子萌发有较强的抑制作用.【总页数】3页(P1007-1009)【作者】黄志;梁昌聪;杨腊英;刘磊;黄生精;黄俊生【作者单位】中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,海南,儋州,571737;海南大学,海南,儋州,571737;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,海南,儋州,571737;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,海南,儋州,571737;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,海南,儋州,571737;海南大学,海南,儋州,571737;海南大学,海南,儋州,571737;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,海南,儋州,571737【正文语种】中文【中图分类】Q949.320.5【相关文献】1.绿僵菌菌株MAX-2鉴定及其抗逆性特性研究 [J], 陈自宏;徐玲;杨凤连;杨丽华2.紫外线-亚硝酸复合诱变选育高抗逆性绿僵菌的初步研究 [J], 陈瑞勤3.ARTP与紫外线复合诱变选育高性能绿僵菌菌株 [J], 黄玉;尼玛扎西;薛正莲;张国强4.对西花蓟马高效金龟子绿僵菌菌株筛选及在花生田间的应用效果 [J], 裴松松;吴轩;李瑞军;赵丹;陆秀君;郭巍5.对西花蓟马高效金龟子绿僵菌菌株筛选及在花生田间的应用效果 [J], 裴松松;吴轩;李瑞军;赵丹;陆秀君;郭巍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

绿僵菌的研究现状及进展
丁苗苗;于永浩;曾涛
【期刊名称】《南方农业学报》
【年(卷),期】2009(040)011
【摘要】介绍了近年来国内外在绿僵菌的分类、分离与鉴定方法、生物学特性和应用等方面的研究进展,指出绿僵菌在分子系统学研究、基因遗传育种、剂型的改进和扩大防治对象上已取得较大的进展,但与Bt等杀虫微生物的研究相比还有较大差距.提出应加强对高毒力绿僵菌菌株的筛选;在防治害虫时尽量减少湿度、紫外线以及土壤微生物和土壤物理、化学性质等对绿僵菌防效的影响,以提高绿僵菌对靶标害虫的防治效果.
【总页数】5页(P1443-1447)
【作者】丁苗苗;于永浩;曾涛
【作者单位】广西大学农学院,南宁,530005;广西农业科学院植物保护研究所,南宁,530007;华南农业大学资源环境学院昆虫学系,广州,510640;广西农业科学院植物保护研究所,南宁,530007
【正文语种】中文
【中图分类】S476+.12
【相关文献】
1.绿僵菌防治蛴螬的应用研究进展 [J], 于永浩;龙秀珍;曾宪儒;韦德卫;曾涛;
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5.绿僵菌防治烟田主要害虫的研究进展与展望 [J], 杨华;杨恩兰;张功营;万树青因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

绿僵菌Ma83几丁质酶的发酵研究蔡荟梅;刘斌;蔡敬民;吴克;樊美珍【期刊名称】《激光生物学报》【年(卷),期】2006(15)6【摘要】本实验从虫生真菌中筛选出金龟子绿僵菌Ma83菌株,它的几丁质酶合成能力最强.其产酶的适宜条件是,碳源为胶体几丁质加葡萄糖,氮源为NaNO3,培养温度为28℃,培养基起始pH 6.O;接种量为5 mL液态种,最适装液量为5 mL,添加维生素C可以提高酶活;正交实验表明培养因子的最佳组合是:NaN03 1 g/L,胶体几丁质O.6 g/L,酵母膏0.05 g/L,葡萄糖0.10 g/L.根据液态培养产酶过程结果可知,当Ma83菌培养6天时,几丁质酶活力达到8.1 U/mL.【总页数】5页(P646-650)【作者】蔡荟梅;刘斌;蔡敬民;吴克;樊美珍【作者单位】安徽省产品质量监督检验所,安徽,合肥,230022;合肥学院化学与生物工程系,安徽,合肥,230022;安徽农业大学虫生真菌研究所,安徽,合肥,230036;合肥学院化学与生物工程系,安徽,合肥,230022;合肥学院化学与生物工程系,安徽,合肥,230022;合肥学院化学与生物工程系,安徽,合肥,230022;安徽农业大学虫生真菌研究所,安徽,合肥,230036【正文语种】中文【中图分类】Q815【相关文献】1.绿僵菌Ma83固态发酵几丁质酶和部分酶学性质的初步研究 [J], 蔡荟梅;刘斌;蔡敬民;吴克;樊美珍2.金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae Ma83)几丁质酶的纯化及性质 [J], 蔡荟梅;刘斌;蔡敬民;杜先锋;樊美珍3.绿僵菌Ma83固态发酵几丁质酶和部分酶学性质的初步研究 [J],4.金龟子绿僵菌深层培养产几丁质酶的研究 [J], 杨革;陈洪章;李佐虎5.昆虫生长调节剂和绿僵菌对意大利蝗几丁质酶活力的影响 [J], 赵忠伟;曹广春;徐光青;吴乐年;张泽华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。