植物组织培养中的污染成因及其预防

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下部, 围绕在正在灭菌的材料周围。在这种情况 下, 假如锅内空气仅排掉一半, 当压力表指针达到 1 kg/ cm2 时, 锅内实际温度仅达 112 , 比要求的 121 低很多, 导致灭菌不彻底, 可能造成大面积 染菌( 全自动高压锅不存在这种问题) 。灭菌锅的 压力应稳定在 1 1 kg/ cm2, 即温度为 121 的条件 下, 维持 15~ 20 min, 时间不宜过长, 也不可超过规 定的压力范围, 否则培养基中的蔗糖、有机物质、维 生素、激素等物质就会分解, 导致培养基变质、变 色, 降低培养基的 pH 值, 使培养基难以凝固。灭 菌完成后, 切忌立刻打开放气阀放气, 因为锅内气 压降低太快会引起减压沸腾, 导致灭菌锅内各容器 中的培养基溢出, 甚至造成人身事故。应在灭菌锅 内气压接近常压时打开放气阀。
3 1 1 培养基 为了保证灭菌彻底, 培养基以及培 养器皿灭菌通常采用高压蒸汽灭菌法灭菌, 因为空 气是热的不良导体。对于半自动高压灭菌锅来说, 灭菌过程中当锅内压力上升到 0 5 kg/ cm2 时, 应 注意再次开启放气阀 1 次[ 15] , 将锅内冷空气排净, 否则冷空气就会聚集并滞留在灭菌锅消毒筒的中
材料常用深灭菌方法, 一般用 20% 次氯酸钠溶液 浸泡 20~ 30 min, 较难消毒的可用 0 1% 升汞消 毒 5 m in。对不同植物材料种子的灭菌方法也不 相同, 在禾本科 Gram ineae 种子与 豆科 L egumi nosar 种子灭菌中, 由于禾 本科草种种皮 较薄且 小, 较易灭菌, 而豆科植物种皮较硬且厚, 必须深 灭菌才能彻底灭菌并打破休眠。赵永辉等[ 12] 对
收稿日期: 2003 11 24 基金项目: 国家 转基因 植物 研究 与 产业 化专 项( J2002 B
006) 资助 作者简介: 杜雪玲, ( 1978 ) , 女, 河南周口人, 讲师, 硕士。
E mail: duxueling1978@ 126 com
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PRA TA CU LTU RA L SC IENCE( V ol. 22, No. 1)
中图 分类号: Q 943 1
文献标识码: A
文章编号: 1001 0629( 2005) 01 0024 04
植物组织培养是 20 世纪初以植物生理学为 基础发展起来的一门新兴技术, 这项技术已在科 研和生产中得到广泛应用, 成为举世瞩目的生物 技术重要内容之一。特别是近几年, 不少组织培 养工厂应用该技术大量生产花卉、蔬菜及特种经 济植物幼苗、脱毒苗, 使作物种植逐步摆脱周期 长、完全受自然控制的分散状态, 逐步走向集中控 制、规模化、自动 化、不受 自然 影响 的 工厂 化生 产[ 1] 。尽管组织培养方面理论研究已相当精深, 但技术方面仍存在很多问题。因此, 如何获得无 菌苗也成为亟待研究的问题。在总结分析有关文 献的基础上, 结合多年生黑麦草 Loli um per enne 组织培养研究中的实践, 介绍和讨论了组织培养 中的污染原因及其对策。
生黑麦草的草坪草品种百瑰易灭菌, 但分化率极 低。因此, 组织培养过程中, 选择不易污染且易表 达全能性的外植体, 是成功建立组织培养体系的 决定因素之一。
2 2 外植体灭菌的方法 外植体灭菌方法有
表面灭菌和深灭菌。如以茎尖、茎段和叶片等为
较嫩外植体材料时, 常用表面灭菌方法, 其具体方 法: 先用自来水冲洗数分钟( 对于表面不光滑或长 有绒毛结构不易洗净的材料冲洗时间要长, 几个 小时或过夜) , 用软毛刷( 添加洗洁净或肥皂粉) 进 行刷洗以去除尘土, 用吸湿纸吸干, 接着浸泡到灭 菌溶液( 如 70% 的酒精) 中, 用无菌水冲洗 2~ 3 次; 再 用表 面消毒 剂如 0 1% ~ 0 5% 氯 化汞或 1% ~ 2% ( 体积/ 重量) 溴水或 2% ~ 10% 次氯酸 钠浸 泡, 一般 对 较易 灭菌 的外 植体 采用 2% ~ 10% 次氯酸钠浸泡即可, 而对较难灭菌的荚果类 采用 0 1% ~ 0 5% 氯化汞才能较好灭菌。如 Lu an[ 11] 等在红花刺槐 Robi ni a p aeudoacacie 茎段组 织培养研究中取带 1~ 2 个小侧芽的小茎段, 先用 酒精灭 菌 30 s, 然 后在 0 1% 升汞中灭 菌 3~ 5 min, 其消毒效果好。一般的灭菌材 料在灭菌剂 中浸泡时间的长短以及灭菌剂浓度的高低以不同 外植体而定, 如李慧等[ 11] 在草莓茎尖组织培养中 比较了 5 种不同灭菌方法, 分别是次氯酸钠 10% ( 含有效氯 0 4% ~ 0 5% ) 浸泡接种材料 10~ 15 min; 次氯 酸 钙 ( 漂白 粉) 饱 和 上 清液 浸 泡材 料 15~ 30 min; 过氧 化氢 10% ~ 12% 浸泡 10 ~ 20 min; 新洁尔灭溶液 5% ~ 10% 浸泡 10~ 15 min; 升汞 0 1% 浸泡 8~ 10 min, 结果显示前 4 种灭菌 剂对接种材料比较安全, 但因灭菌时间较长, 常常 使接种材料的外层氧化变褐, 影响培养效果。虽 然升汞有很强的杀菌能力, 但浸泡时间稍长会造 成接种材料中毒。因此, 组织培养中, 把握好灭菌 时间和灭菌剂浓度很重要。对于种子等难消毒的
2 1 外植体的选择 外植体的选择要以污染
少易启动( 易培养) 为原则。迄今为止, 组织培养 获得的成功, 几乎包括了植物体的各个部位, 如茎 尖、茎段的皮层及维管组织、髓细胞、表皮, 块茎的 贮藏薄壁细胞、花瓣、根、叶、子叶、鳞茎、胚珠和花
药等。其中植物胚不易被污染且具有幼嫩的分生 组织细胞[ 6, 7] , 是常用的外植体。另 外在用茎尖 作外植体时, 可在室内或无菌条件下对枝条进行 预培养, 如将枝条用水冲洗干净后插入无糖的营 养液或自来水中, 使其抽枝, 然后以这种新抽的嫩 枝条 作 为 外 植 体, 污 染 率 可 下 降 到 20% ~ 30% [ 8] 。罗小芳等人[ 9] 在金丝小枣 Ziz ip hus j u j uba var inermis 快繁中用休眠芽、室外嫩茎及水 培嫩 芽 为 外 植 体, 得 出 水 培 嫩 芽 的 污 染 率 为 31% , 存活率高达63 3% , 而休眠芽和室外嫩茎的 污染率分别为 46 2% , 77 1% , 成活率 16 25% , 17 14% 。在无菌条件下对枝条进行暗 培养[ 10] , 待抽出徒长的黄化枝条时再采取枝条, 也可明显 减少污染。另外也可用成熟种子在无菌条件下经 严格消毒培育成无菌苗[ 8] , 然后采用无菌芽苗的 胚轴、胚根、子叶等为材料, 也可减少污染, 笔者在 多年生黑麦草的组织培养中采用此法。同时, 应 避免阴雨天在户外采取外植体。在晴天采料时, 下午采取的外植体要比早晨采的污染少, 这主要 是因为 经过日晒 后可杀 死部分细 菌或真 菌[ 10] 。 当然, 外植体的选择在考虑污染控制的同时, 还应 考虑外植体的分化率问题。例如, 在控制污染条 件一致的情况下, 百合科 L iliaceae 植物鳞茎不同 部位的再生能力差别很大, 外层鳞片叶比内层的 再生能力强, 下段比中、上段再生能力强[ 10] ; 多年
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草业科学 PRA TA CU LTU RA L S CIENC E
22 卷 1 期 Vol. 22N o. 1
牧草 研究
植物组织培养中的污染成因及其预防
杜雪玲1, 张振霞2, 余如刚1, 符义坤3
( 1 安徽淮北煤炭师范学院生物系, 安徽 淮北 235000; 2 中山大学生命科学院, 广东 广州 510275; 3 甘肃农业大学草业学院, 甘肃 兰州 730070)
3 1 培养基以及培养器皿的灭菌 必须采用
有效的方法, 将所用培养器皿、培养基、操作工具、 培养材料、接种间进行灭菌。通常, 灭菌有物理方 法和化学方法 2 种。高压蒸汽、烘箱干热、紫外线 照射为物理方法灭菌。0 1% 新洁尔灭溶液、70% 酒精、漂白粉或 3% ~ 7% 漂白精片、甲醛、次氯酸 钠溶液等消毒剂都属于化学方法灭菌或抑菌 。
2 外植体
在组织培养中, 无菌的外植体是植物组织培 养取得成功的最基本前提, 特别是在热带、南亚热 带, 由于常年高温多雨, 空气湿度大, 在植物茎叶 表面容易滋生大量的微生物, 一些菌丝体甚至侵 入表皮内的薄壁组织, 不能被一般的表面消毒方 法所清除, 材料被带入组织培养过程中易引起内 生菌的污染[ 3 5] , 如细菌的污染。因此, 必须选择 合适的外植体( 如成熟的种子、健壮植株等) , 并进 行严格的消毒和无菌操作, 以确保组织培养工作 的顺利进行。
在组织培养中污染经常发生又难以控制。造 成污染的原因多种多样, 如外植体的种类, 取材的 季节、时间、预处理方法, 消毒药剂的种类、浓度, 消毒时间, 消毒方法, 培养基和器皿灭菌, 操作人 员, 工作环境, 超净工作台的工作质量等都与污染 密切相关, 导致污染成因的复杂性。依据上述因 素, 将污染原因归结为 3 个方面: 一是组织培养室 或接种室的清洁问题; 二是外植体自身带菌; 三是 组织培养过程各环节操作不适宜或不严格。
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结缕草 Zoysia j aponica 种子的灭菌先采用乙醇浸 泡 2 min, 再用次氯酸钠溶液浸泡 20 m in 时消毒 效果好。若材料表面不光滑, 最好在灭菌液中加 入 1~ 2 滴表面活性剂, 如吐温 80 或吐温 20, 可 以湿润外植体整个组织, 促进灭菌液进一步接触 表面组织, 达到好的消毒效果; 有时还可用磁力搅 拌、超声振动等方法使消毒液进入外植体[ 13] 。消
1 组织培养室或无菌操作室
在进行组织 培养之前, 首先 要建立实 验室。 实验室包括准备室、无菌操作室( 接种室) 和培养 室。植物组织培养是一种要求做到无菌操作和无 菌培养的技术( 这种技术有 2 个主要目的: 一是防
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止实验室的培养物被外来微生物, 如皮肤、衣服或 周围环境中的微生物污染; 二是防止实验工作者 被微生物感染[ 2] ) 。组织培养室或无菌操作室的 污染源主要是空气中的细菌和真菌孢子, 若培养 室内不清洁就会引起细菌和霉菌污染。因此在接 种室每次接种前必须进行彻底地消毒, 常用的方 法是先用 70% 酒精在室内喷雾使空气中的细菌 和真菌孢子沉降, 在接种前后要用 70% 的酒精或 者 1 50 的新洁尔灭湿性消毒溶液擦洗超净工作 台, 每次 接 种 前 还 要用 紫 外 线 灯 照 射 20 ~ 60 min, 以净化空气, 工作人员不能在停止照射后即 刻进入室内, 以免紫外线辐射对人体的影响。接 种前应再次进行超净台台面消毒, 可用新洁尔灭 湿性消毒溶液擦抹和 70% 酒精消毒, 保证超净工 作台处于严格的无菌状态。在接种后要及时打扫 卫生( 清洁工具如扫帚、拖把必须消毒) , 用 2% 的 新洁尔灭溶液擦洗地面、墙壁和门窗。组织培养 室要经常用 70% 酒精喷雾和 2% 的新洁尔灭溶液 擦洗地面和门窗。有些真菌适应性很强, 上述措 施不一定奏效, 因此, 对组织培养室或接种室一般 用高锰酸钾和甲醛每周熏蒸 1 次, 甲醛用量 4~ 6 mL/ m3, 高锰酸钾 3~ 6 g/ m3。