霉变干枣中菌种的分离纯化及初步鉴定

第33卷总第86期西北民族大学学报(自然科学版)Vol.33,N o.2 2012年6月Journal of Northwest University f or Nationalities(Natural Science)June,2012霉变干枣中菌种的分离纯化及初步鉴定陈妍,卢建雄,范怀德,李昌辉(西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730030)[摘要]红枣在干制和储藏过程中易于霉变,为了研究引起霉变的原因及为长期储藏和安全食用提供依据,本试验用4种不同培养基,采用涂布平板法,对霉变干枣提取悬液中的微生物进行了分离培养1在霉变干枣悬液中未发现放线菌和酵母,而有明显的细菌和霉菌菌落1对分离的细菌和霉菌进一步纯化培养,得到2株细菌和3株霉菌,通过形态特征及镜检分析,初步鉴定细菌为葡萄球菌属(Staphy lococcus)和微球菌属(M icrococcus Co hn),霉菌为青霉菌(Penicill-i um)、白曲霉(Asp.candidus Link)和米曲霉(Asp.oryzae),并发现青霉菌和白曲霉最适生长温度为28e~32e,而米曲霉为28e~37e1[关键词]霉变干枣;霉变菌种;分离纯化;初步鉴定[中图分类号]Q93-331[文献标识码]A[文章编号]1009-2102(2012)02-0075-06红枣(Ziziphus jujuba Mill)又名大枣,为鼠李科枣属植物[1],自古以来位列桃、杏、李、栗、枣/五果之首0[2]1枣的果实为椭圆形,未成熟时黄绿色,成熟后褐红色,栽培历史悠久1红枣含有丰富的维生素C,100克鲜枣含300毫克[3],远高于一般水果1此外,红枣中胡萝卜素、B族维生素及钙、铁等丰富,含有多种必需氨基酸,具有健脾益胃、补气养血、提高免疫力等功效1由于具有耐旱、耐涝的特性,红枣栽培及加工成为我国许多地区重要的特色农业产业之一1红枣鲜果易腐烂,多以干果形式保藏1在干燥和储藏过程中,除形状、色泽变化外,干枣也容易被霉菌污染,然而,目前虽然对鲜枣在低温储藏过程中霉菌的污染有一定研究[4],但对干枣霉变菌种及其污染情况了解较少1因此,本试验分离纯化了干枣中的霉变菌种,并初步鉴定出主要的霉菌,同时对霉菌在不同温度下的生长情况进行了研究,从而为干枣的长期储藏和安全食用提供科学依据11材料与方法1.1材料1.1.1试验样品市售宁夏中卫干枣11.1.2试验仪器DNP-9272电热恒温培养箱(上海精宏试验设备有限公司)、SW-CF-ICM洁净操作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、ME11数码显微镜(广州市明美科技有限公司)、YXQ LS 50SII立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、YZ280A手提式不锈钢蒸汽消毒器(上海三申医疗器械有限公司)11.1.3试验试剂葡萄糖、硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸铁、氯化钠、蔗糖、琼脂、氯霉素、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、醋酸钠、可溶性淀粉、硝酸钾,以上试剂均为国产分析纯11.1.4培养基配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)(培养霉菌用):称20g去皮的马铃薯,切成玉米[收稿日期]2012-05-11[作者简介]陈妍(1987)),女,辽宁人,硕士研究生,主要从事动物营养与饲料科学方面的研究1粒大小,加1000m L水煮沸20min,然后用双层滤布过滤,取滤液补足水分之后加15~20g琼脂,加热融化再加20g,趁热分装于三角瓶并在121e灭菌20m in1另外,用少量乙醇溶解0.1g氯霉素,加入1000mL灭菌后的培养基中1麦氏培养基(培养酵母菌用):葡萄糖1.0g,氯化钾1.8g,酵母膏2.5g,醋酸钠8.2g,琼脂18g,蒸馏水1000mL,pH自然,121e条件下高压灭菌1牛肉膏蛋白胨培养基(培养细菌用):牛肉膏3.0g,蛋白胨10.0g,氯化钠l5.0g,琼脂16.0g,蒸馏水1000mL,pH7.2~7.4,0.1M Pa,121e条件下灭菌20min1高氏1号培养基(培养放线菌用):可溶性淀粉20g,硝酸钾1.0g,氯化钠0.5g,琼脂20g,磷酸氢二钾0.5g,硫酸镁0.5g,硫酸亚铁0.01g,蒸馏水1000mL,pH7.2~7.4,0.1MPa,121e条件下灭菌20min11.2方法1.2.1霉变干枣中菌种的分离培养称取10g已霉变的干枣,用无菌水冲洗后,去核,在无菌的条件下粉碎,加入无菌水90m L,震荡30min,混匀,制成悬液备用1采用涂布平板法对样品悬液中的微生物进行分离1将霉变干枣悬液10倍级进行稀释,稀释度为10-1、10-2及10-3,用无菌吸管取不同稀释度的1mL样液注入到加有PDA培养基、蛋白胨培养基和查氏培养基的无菌培养皿,涂布,每个稀释度做三个重复1PDA培养基、麦氏培养基和高氏1号培养基在28e的恒温培养箱分别培养3d、5d和7d1牛肉膏蛋白胨培养基在37e恒温条件下培养3d11.2.2菌种纯化1.2.2.1细菌纯化培养待培养基上的菌落长势旺盛时,用无菌接种环取少许菌落以平板划线法接种,37e恒温培养箱中培养3d,挑取典型的菌落分别镜检1镜检后,挑取不同形态的菌落转接到牛肉膏蛋白胨培养基上,继续培养,三次后得到纯菌落11.2.2.2霉菌纯化培养待菌落在平板培养皿上生长进入旺盛期时,挑取少量孢子作平板划线,28e 培养1经2~3次平板划线后得到初步纯化的霉菌1从培养36h的划线平板上选取单菌落,用无菌小刀挖出并移植到PDA平板培养基上,在28e,相对湿度为80%的条件下培养3d,得到纯培养菌落1 1.2.3菌种的保存以及初步鉴定1.2.3.1菌种的保存经过分离纯化得到的纯菌落,用斜面培养基保存,即在无菌条件下,将长有单菌落的平板培养基选出,用无菌接种针挑取少量孢子,接种在斜面培养基上,在28e条件下培养2~3d 后,将已有明显菌落的斜面培养基用牛皮纸、线绳包扎好,放入4e的冰箱里进行储存11.2.3.2菌种初步鉴定1)培养特征的观察将PDA培养基、麦氏培养基和高氏1号培养基培养物放入到28e恒温培养箱,分别培养3d、5d 和7d1牛肉膏蛋白胨培养基在37e恒温条件下培养3~4d1每12h观察生长情况12)形态特征观察用肉眼或者放大镜观察细菌菌落生长速度及菌落正面颜色、形状、直径、表面结构;培养基颜色变化及气味1观察霉菌菌落生长速率,菌落颜色、形状、直径;菌丝的高矮、紧密度;孢子的颜色、形状;培养基颜色变化、气味13)镜检¹细菌镜检革兰氏染色法:涂片固定后用草酸铵结晶紫染色1min,用自来水冲洗干净,加碘液覆盖涂面染约1 min,水洗,用吸水纸吸去水分,加95%酒精脱色20s后水洗,吸去水分,蕃红染色液复染2min后,自来水冲洗,干燥后镜检[6]1每个菌种重复以上操作三次1º霉菌镜检在载玻片上滴加1滴生理盐水,用解剖针从霉菌菌落边缘处挑取少量已产生孢子的霉菌菌丝,先置于50%的乙醇中浸几秒,以洗去脱落的孢子,用解剖针将菌丝分散开,盖上盖玻片镜检[7]1每个菌种重复以上操作三次1用低倍镜或中倍显微镜检查1对于细菌观察革兰氏染色阴阳性,细菌细胞形状以及相互间连接方式,有无芽胞、鞭毛、荚膜1对于霉菌观察基内菌丝的特点、颜色,是否分节,成熟子实器官的特性及排列,成熟的子实器官或子实体的颜色、大小和形状14)不同温度下霉菌的生长情况将分离纯化的霉菌菌种分别接种于PDA培养基,分别在28e、32e、37e、42e和45e温度条件下培养3d,每个菌种3个重复,观察和记录各菌种的生长情况12结果2.1四种培养基上菌落的分布霉变干枣悬液10倍级稀释后,采用涂布法,分别接种于PDA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、麦氏培养基和高氏1号培养基培养,每个稀释度3个重复1菌落在培养基上的分布如表1所示1由表1可知,麦氏培养基和高氏1号培养基无菌落生长,霉变干枣悬浮液中可能存在的微生物类型为细菌和霉菌,没有放线菌和酵母1表1不同培养基生长菌落数培养基接种数生长菌落的培养基数P DA培养基96牛肉膏蛋白胨培养基97麦氏培养基90高氏1号培养基902.2分离菌株的形态特征2.2.1细菌的形态特征将牛肉膏蛋白胨培养基上不同形态的细菌菌落纯化培养,最终得到2株菌株(B1和B2),其形态特征和革兰氏染色镜检结果见图1~2所示1图1B1菌菌落形态及显微形态B1菌在牛肉膏蛋白胨培养基上起初生长速度较快,之后不再生长1菌落为黄色,形状为圆形凸起,类似小米粒,直径1~2mm,单个菌落厚,表面湿润且有光泽1培养基颜色为淡黄色,有臭味;革兰氏染色阳性,无芽胞、鞭毛,无荚膜1图2B2菌菌落形态及显微形态B2菌在牛肉膏蛋白胨培养基上起初生长速度慢,72h后不再生长1菌落为乳白色,不透明,表面湿润光滑,略有隆起,菌落较大且紧致,边缘不整齐呈放射状1培养基颜色无变化,有臭味,革兰氏阳性,球菌,双联或四联出现,有的能形成短链,能运动12.2.2霉菌形态特征将PDA培养基上生长的各种不同形态的菌落分别接种,纯化培养,第3次纯化时,每隔12h观察菌落形态,并进行镜检,最后得到M1、M2和M3共3株菌株,菌落形态特征和镜检结果见图3~5所示1图3M1菌菌落形态特征及细胞形态M1菌在PDA培养基上培养初期边缘为白色、中间呈绿色,培养中期为深绿色,后期为褐色,呈绒毛状,直径约为0.9cm1菌丝矮、稠密1孢子的颜色为绿色,呈球形或近球形1培养基颜色为其本色,有霉味,靠中心处有裂纹,无蔓延性1分生孢子梗顶端不膨大,无顶囊,孢子穗形状如扫帚1图4M2菌菌落形态特征及细胞形态M2菌在PDA培养基上始终为白色,呈稠密的棉絮状,直径0.6cm1菌丝高、菌丝稠密1孢子的颜色为白色,球形或椭圆形1培养基的颜色为淡黄色1有蔓延性,菌落在接种处向外生长1图5M3菌菌落形态特征及细胞形态M3菌在PDA培养基上正面初期为白色,培养24h后表面开始生长黑色孢子,呈疏松至稠密的絮状,直径为1.4cm1有蔓延性,菌落在接种处向外蔓延1分生孢子梗顶端膨大,类似蘑菇状,气生菌丝发达,菌丝有隔,巨大顶囊呈椭圆形12.3不同培养温度对霉菌生长的影响分离的3种霉菌分别在28~45e5个不同温度条件下培养,M1和M2菌在28e生长良好,32e 次于28e,37~45e温度下生长停止;M3菌在28e和32e时有很好的生长,高于42e生长停止(表2)1表2不同温度下霉菌的生长情况温度M1M2M328e生长良好生长良好生长良好32e生长一般生长一般生长良好37e不生长不生长生长一般42e不生长不生长不生长45e不生长不生长不生长3讨论本试验采用微生物传统培养方法,从霉变干枣悬浮液中分离、纯化得到2株细菌和3株霉菌共5个菌株,综合其培养特性、菌落形态观察和显微镜检结果,参照文献[8~11]并结合前人研究结果,初步鉴定得出分离的B1细菌为葡萄球菌属(Staphylococcus),该菌在空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中均有分布,食品受污染的机会很多1B2属于微球菌属(M icrococcus Cohn),常从食品和空气中分离到[12]1M1为青霉菌(Penicillium),通常分布于柑桔类水果,蔬菜、粮食、肉类、皮革和食物上[13]1M2为白曲霉(Asp. candidus Link),M3为米曲霉(Asp.oryzae),主要分布在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处,是我国传统上酿造食品酱和酱油的生产菌种[14]1对分离纯化的3种霉菌在不同温度条件下培养,发现M1(青霉菌)和M2(白曲霉)最适生长温度在28e~32e范围内,而M3(米曲霉)生长的最适温度范围较宽为28e~37e1由此可见,干枣宜在低温条件长期储藏,以减少霉菌的污染1参考文献:[1]高新一等.枣树高产栽培新技术[M].北京:金盾出版社,2005141[2]周俊义等.枣高效栽培教材[M].北京:金盾出版社,2005131[3]曲泽洲,王永蕙.中国果树志#枣卷[M].北京:国林业出版社,1993151[4]刘孟军1枣属植物分类学研究进展[J].园艺学报,1999,5(4):302-3081[5]赵斌,何绍江.微生物学试验[M].北京:科学出版社,2002138-431[6]黄秀梨,夏立秋等.微生物学试验指导[M].北京:高等教育出版社,1996139-601[7]沈萍,范秀容,李广武.微生物学试验(三版)[M].北京:高等教育出版社,19961119-1201[8]东秀珠,蔡妙英等.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,20011289-2941[9]沈萍,陈向东等.微生物学[M].北京:高等教育出版社,2006151[10]Brian 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bacteria and3strains mold.M orpholog y and m icroscopy analysis w hich primarily appraised bacteria for staph aureus (Staphylococcus)and micro of(Micrococcus Cohn),mold for Penicillium,Asp.Candidus Link and m Asp. Oryzae.and found that Penicillium and Asp.Candidus Link is the most grow th temperature28e32e, and Asp.Oryzae meters for28e37e.[Key words]M ildew dry Jujube;Mildew bacteria;Separation and purification;Initiative identification(上接第43页)Research on Information Processing of KnowledgeBase Construction for Tibetan Function WordsTsering Samdru,Do Lha(China M inor ities Information T echnolog y Institute N orthwest U niversity for Nationalities,L anahou730030,China)[Abstract]The research on function words is the basic part of language know ledge basical research.This ar-ticle through the/trinity0thought,according to traditional function,multi category,half g rammatica-l ization,the investig ation of function w ords usage rules in the real corpus,and try to construct function w ords know ledge base facing machine.This aim is that modern T ibetan function w ords can serve higher fields for sy ntactic analysis and current m achine translation.[Key words]T ibetan;Function words;Know ledge base。