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中药材贝母DNA不同提取方法的比较_王淼

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第12卷第6期北华大学学报（自然科学版）Vol．12No．62011年12月JOURNAL OF BEIHUA UNIVERSITY （Natural Science ）Dec．2011文章编号：1009-4822（2011）06-0662-04中药材贝母DNA 不同提取方法的比较王淼1，谭莹2，张丽华2（1．北华大学医学检验学院，吉林吉林132013；2．北华大学药学院，吉林吉林132013）摘要：目的探讨中药材贝母DNA 的不同提取方法，为中药贝母的分子生物学鉴定提供参考．方法利用苯酚法、CTAB 法、SDS 法从中药贝母中提取DNA ，通过紫外分光光度和琼脂糖凝胶电泳对所得DNA 样品含量及纯度进行检测．结果利用3种不同的方法提取，药材贝母DNA 的A 260/A 280在1．80ʃ0．23左右．结论利用3种不同DNA 提取方法，均可从贝母样本中提取得到DNA ，且CTAB 法提取贝母的DNA 含量高、纯度好．关键词：贝母；DNA 提取；中药中图分类号：Q503；R282．5文献标志码：A收稿日期：2011-09-04作者简介：王淼（1976－），女，实验师，主要从事分子生物学技术在药物质量控制上的应用研究；通信作者：张丽华（1957－），女，教授，硕士生导师，主要从事分子生物学技术在药物质量控制上的应用研究．Comparative Study of Different Extraction Methods for the Isolationof DNA from Traditional Chinese Medicine FritillariaWANG Miao 1，TAN Ying 2，ZHANG Li-hua 2（1．Medical Inspection College of Beihua University ，Jilin 132013，China ；2．Pharmaceutical College of Beihua University ，Jilin 132013，China ）Abstract ：Objective To discuss the different extraction methods for the isolation of DNA from traditionalChinese medicine fritillaria and provide the reference for the molecular biology appraisal of the traditional Chinese medicine fritillaria．MethodThe Phenol ，CTAB and SDS methods were used to isolate DNA from the traditionalChinese medicine fritillaria ，and ultraviolet spectrophotometry and agarose gel electrophoresis were used to examine DNA content and quality．Results The ratios of A 260/A 280for DNA were between 1．80ʃ0．23with three different extraction methods．ConclusionThe three methods can be used for the extraction of DNA fromfritillaria．The CTAB method is the best method for the extraction of DNA from fritillaria ，and the DNA with highest content and purity from fritillaria can be got with this method．Key words ：Fritillaria ；DNA extraction ；traditional Chinese medicine 目前，分子生物学技术已被广泛应用于中药材鉴定、提取等方面［1-3］，DNA 的提取和纯化是中药材研究的重要基础，因此，简洁有效地提取高纯度、大量的DNA 是对中药材实施分子标记、基因文库构建、基因分离及其遗传转化和鉴定的重要前提．然而多数中药材经过加工处理后，药材中的DNA可能会受到不同程度的降解，不利于保持DNA 的完整性．再者，中药材中因含有次生代谢产物很难与DNA 分开，会直接影响中药材DNA 的提取及后续研究．如何能够快捷有效地提取到高质量、合格的DNA ，一直是生物技术研究者关注的问题．同一中药材用不同方法提取的DNA 纯度和提取率也不尽相同，不同中药材用相同方法提取DNA其结果也不同［4-5］．我们参考前人的工作，从中筛选了3种方法［6-8］，并稍加改进，以中药材贝母为研究对象，对3种不同方法的提取浓度、效率等方面进行了特定的比较，从中选出最佳的提取方法，为中药材贝母的分子生物学鉴定提供参考．1材料与仪器1．1药材浓蜜贝母（F．mellea）、瓦布贝母（F．wabue nsis）、青贝（F．prezwalskii Maxim）、松贝（F．unibracteata Hsiao et K．C．Hsia）鲜品（四川省茂县科技局提供）；平贝母（F．ussuriensis）、浙贝母（F．thunbergii．Miq）、湖北贝母（F．hupehensis Hsiao et K．C．Hsia）干品（中国药品生物制品检验所提供）．1．2试药CTAB、PVP、Tris、β-巯基乙醇、EDTA、SDS、10ˑPCR buffer、游离脱氧核苷三磷酸dNTPs、Taq DNA Polymerase（1000U）、DGL2000DNA Marker（北京鼎国生物技术公司）；100bp DNA Ladder（北京天根生化科技公司）；琼脂糖（England）；其他化学试剂均为分析纯；引物由生工生物（上海）有限公司合成；无菌双蒸水（自制）．1．3仪器GL-20G-Ⅱ型变速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；WD-9403C型紫外分析仪（北京市六一仪器厂）；9700型PCR扩增仪（ABI）；JY600C型双稳定时电泳仪（北京市君意东方电泳设备有限公司）；紫外凝胶成像自动分析仪（美国Cold Spring 公司）；紫外/可见分光光度计（Pharmacia4000）．2样品DNA提取方法2．1苯酚法参考文献［9］的方法，并做适当改进．称取各种样品0．1g，充分研磨后放入10mL离心管中，加入2．5mL的缓冲溶液A（50mmol/L Tris-HCl pH8．0，10mmol/L EDTA，5mmol/Lβ-巯基乙醇，2%SDS），混匀，37ħ水浴振荡过夜．室温，10000r/min离心10min．取上清液，加等体积的水饱和酚溶液（pH8．0），反复混匀，室温下作用20min．将混合液移入另一干净的离心管中，室温，10000r/min离心10min．取上层水相，先用酚-氯仿-异戊醇（25241，体积比），再用氯仿-异戊醇（241，体积比）各抽提1次，直至无白色中间层．将上清液移入离心管，加入等体积异丙醇混匀，于－20ħ放置30min．室温，12000r/min离心5min，得DNA絮状沉淀，用70%乙醇洗2次，再加入适量TE溶解，放入0．5 1μL RNaseA37ħ水浴中反应1 2h，4ħ保存．2．2CTAB法参考文献［10］的方法，并做适当改进．取各种样品0．1g，充分研磨后转移至离心管中，加入2ˑCTAB（1．4mol/L NaCl，100mmol/L Tris pH8．0，20mmol/L EDTA pH8．0，2%PVP，2%CTAB，3%β-巯基乙醇）200μL，混匀，65ħ水浴保温1h，期间不断震荡．4ħ，12000r/min离心10min．吸取上清液，加入等体积的氯仿-异戊醇（241，体积比）抽提2 3次，10000r/min离心5min．取上清液加2/3体积的无水乙醇，混匀后－20ħ放置1h沉淀核酸．4ħ，10000r/min离心5min，弃上清，得到DNA絮状沉淀．沉淀物用80%乙醇和无水乙醇分别漂洗两次，室温晾干，放入适量的植物TE缓冲液溶解，放入0．5 1μL RNaseA37ħ水浴中反应1 2h，4ħ保存．2．3SDS法参考文献［11］的方法，并做适当改进．取各种样品0．1g，充分研磨后转移至离心管中，加入DNA提取液（25mmol/L Tris-HCl pH8．0，50mmol/L EDTA，0．5%SDS，0．2%β-巯基乙醇）0．5mL，56ħ水浴保温30min．4ħ，12000r/min离心10min．吸取上清液，加入等体积的苯酚-氯仿（11，体积比）抽提2次，12000r/min离心5min．取上清液加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，4ħ，12000r/min离心5min，弃上清液，室温晾干后，放入适量的植物TE缓冲液溶解，再加入0．5 1μL RNaseA37ħ水浴中反应1 2h，4ħ保存．2．4DNA的纯度、产率检测将利用3种方法提取得到的模板DNA适当稀释后，用紫外分光光度计测定260nm和280nm处的吸光度A260和A280，以A260/A280的比值鉴定纯度，并计算DNA的浓度（见表1）．2．5DNA琼脂糖凝胶电泳检测将利用3种方法提取得到的DNA与6ˑLoading buffer（31，体积比）溶液混匀点样于0．8%琼脂糖凝胶板上，电压90V，电泳30min，并经紫外线检测拍照（见图1 3）．3结果3．1DNA纯度及浓度检测结果用苯酚法、CTAB法、SDS法提取的中药材贝母DNA的A260/A280为1．80ʃ0．23，表明3种方法366第6期王淼，等：中药材贝母DNA不同提取方法的比较均能提取得到一定量的DNA ，且DNA 的纯度较好，见表1．表17种贝母DNA 的纯度和浓度检测结果Tab．1Results of DNA purity and concentration from seven FritillariasSample Phenol method c （A 260/A 280）/（g ·L －1）CTAB method c （A 260/A 280）/（g ·L －1）SDS methodc （A 260/A 280）/（g ·L －1）F．mellea 1．7391．5051．6511．6812．2241．145F．wabuensis 1．6741．5151．6571．7431．8121．313F．prezwalskii Maxim 1．8001．7101．5951．6621．6000．770F．unibracteata 1．7801．6201．6251．6411．0091．204F．ussuriensis 1．7061．3651．6031．7142．0090．609F．hupehensis Hsiao 1．7351．4051．6001．6932．0790．627F．thunbergii．Miq1．7581．4151．6671．6901．6001．1803．2DNA 琼脂糖凝胶电泳图谱通过比较，苯酚法、CTAB 法、SDS 法提取DNA 效果较好，片段长度大小一致，RNA 去除干净，并且没有出现DNA 大量降解的情况（见图1 3）．图1苯酚法贝母样品DNA 琼脂糖凝胶电泳图谱Fig．1Agarose gel electrophoresis of FritillariaDNA extracted with Phenolmethod图2CTAB 法贝母样品DNA 琼脂糖凝胶电泳图谱Fig．2Agarose gel electrophoresis atlas of FritillariaDNA extracted withCTAB图3SDS 法贝母样品DNA 琼脂糖凝胶电泳图谱Fig．3Agarose gel electrophoresis of FritillariaDNA extracted with SDS4讨论植物中药材不同于动物中药材，除了具有细胞壁外，还含有大量的多糖、脂质、色素和酚类等物质，同时大多数DNA 在细胞中是与蛋白质结合在一起的，给DNA 的提取和纯化带来许多困难．因此，在分离和纯化DNA 时解聚核蛋白和去除蛋白质、酚类和多糖等物质是很重要的一步，而不同中药材所含有的干扰成分及DNA 结合的蛋白质的数量、成分、牢固程度有所不同，故用不同的方法提取不同植物中药材的DNA 效果不一样．苯酚法是DNA 提取中应用较为广泛的方法，其对新鲜样品的提取效果比较好（见图1），但DNA 的质量没有改善（见表1），其原因可能是氯仿、苯酚等改变不了酚类、多糖等对DNA 质量的影响．此外，实验过程中饱和酚容易氧化，平衡时操作较为繁琐．CTAB 是一种阳离子去污剂，可以破坏植物细胞壁，以利于细胞内容物的释放．此外，CTAB 还可与DNA 结合形成复合物，有利于将DNA 与变性蛋白质及多糖分开．PVP 是一种高分子合成树脂，能络合多酚物质，防止酚类化合物氧化成醌类，避免溶液变褐而具有抗氧化作用，并且可直接通过离心或氯仿-异戊醇抽提去除．从本实验来看，CTAB 法对于许多新鲜植物DNA 的提取是较为适用的，但对干品中药材的DNA 的提取纯度相对不高（见图2）．SDS 也是去污剂，可直接裂解细胞，使其释放出核DNA ，其DNA 的质量还可以，但是产量很低，同时SDS 法存在拖尾和杂质污染现象（见图3）．通过3种不同方法对中药材贝母DNA 提取效果的比较可知：各种提取方法本身均具有不同的特点和优缺点，而这3种方法中，CTAB 法提取效率高，操作简便，所需器材和设备的要求不高，无污染，且试剂经济实惠（大多为国产试剂），最适合于中药材贝母DNA 的提取．参考文献：［1］National Pharmacopoeia Committee．Ministry of Health466北华大学学报（自然科学版）第12卷Standards for Pharmaceuticals ［S ］．Traditional Chinese Medicine Preparations Volume Sprayed ，2005：25．［2］CAI ZH ，LI Ping ，DONG T X ，et al ．Fritillaria Identifi-cation Methods in Molecular Biology Research ［J ］．Pharmaceutical University ，2000，35（4）：309-312．［3］CAO Hui ，BI PX ，SHAO P．Identification of Chinese Drug“Herbal Elephantopi ”by DNA Fingerprinting Using Random Primer PCR ［J ］．Herbs ，2005，20：643．［4］Welsh J ，Mcclelland M．Fingerprinting Genomes UsingPCR with Arbitrary Primers ［J ］．Nuel Acids Res ，2000，18：7213-7216．［5］ZHOU Zuo-bin ，GE Gang．Identify Genuine MedicinalAterials by the DNA Molecule ［J ］．Jiangxi Science ，2006，26（3）：508-510．［6］GONG B Q．Research Progress on the IdentificationMethods of Fritillaria ［J ］．Journal of Anhui Agri Sci ，2009，37（4）：1603-1604．［7］CAI PX ，Woohok-sin ，Wongman-sau ，et al ．Genotyping andSpecies Identification of Fritillariaby DNA Chips ［J ］．Acta Pharmaceutica Sinica ，2003，38（3）：185-190．［8］LU S D．Modern Molecular Biology Experiment Techno-logy ［M ］．Beijing ：Higher Education Publishing House ，2003：365．［9］内宫博文，田仲可昌，杉浦昌弘，等．植物基因工程技术［M ］．上海：上海科学技术文献出版社，2005：3．［10］Murray M G ，Thompson W F．Rapid Isolation ofMolecular Weight Plant DNA ［J ］．Nucl Acids Res ，1980，8：4321-4325．［11］Angelo Karakousis ，Peter Langridge．A High-throughputPlant DNA Extraction Method for Marker Analysis ［J ］．Plant Molecular Biology Reporter ，2003，21（1）：95．【责任编辑：陈丽华櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴】本刊声明来稿要求一式两份（一份为打印稿，另一份为电子稿）．来稿一律不退，请自留底稿．切勿一稿多投，来稿在六个月内未接到录用通知可自行处理．为适应我国信息化建设的需要，扩大作者学术交流的渠道，本刊所刊文章的全文通过《中国期刊网（CNKI ）》、《万方数据-中国数字化期刊群》和《中文科技期刊数据库》入网．作者著作权使用费与本刊稿酬一次性给付．如作者不同意将文章编入光盘及上网，请在来稿时声明，本刊将做适当处理．566第6期王淼，等：中药材贝母DNA 不同提取方法的比较。

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海洋贝类基因组DNA的提取改进及ITS2扩增

海洋贝类基因组DNA的提取改进及ITS2扩增

海洋贝类基因组DNA的提取改进及ITS2扩增张波;孟学平【摘要】目前已报道的常见的基因组DNA提取方法有经典酚醇法、盐析法、碘化钾法、煮沸法等,其中酚醇法根据其裂解液的不同又有CTAB、SDS、ROSE等具体方法,本试验对经典的CTAB法进行了改进,从酒精保存的西施舌组织中提取得到质量高的基因组DNA,以此为模板扩增ITS2效果很好.【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2008(000)001【总页数】3页(P59-61)【关键词】海洋贝类;基因组DNA;CTAB法提取;ITS2扩增【作者】张波;孟学平【作者单位】淮海工学院海洋学院/江苏省海洋生物技术重点建设实验室,江苏连云港,222005;淮海工学院海洋学院/江苏省海洋生物技术重点建设实验室,江苏连云港,222005【正文语种】中文【中图分类】Q7;S961.6目前提取基因组DNA的方法很多，有经典酚醇法、盐析法、碘化钾法、煮沸法等，其中酚醇法根据其裂解液的不同又可分为CTAB、SDS、ROSE等具体方法。

提取的关键步骤就是将基因组DNA和蛋白质等杂质分离，以减少其他物质对后续操作中DNA的影响。

本试验所采用的材料为海产双壳贝西施舌，其粗蛋白质(质量分数为鲜质量的11.18%)[1]和多糖含量比较高。

本试验结合目前报道的一些提取基因组DNA的方法，重点对CTAB法进行了改进，旨在为后续操作提供高质量的海洋贝类基因组DNA。

1 材料与方法1.1 试验材料用于本试验的西施舌采自广西北海，将其斧足剪成小块(1～2 cm)浸泡在无水乙醇中，于4 ℃保存。

1.2 主要仪器及试剂主要仪器：TGL-16M高速台式冷冻离心机(最高转速16 000 r/min)；Cycle Bio-RAD PCR仪；UNIV.HOODII-SN76S102996 凝胶成像系统；UV-754型紫外可见分光光度计。

主要试剂：CTAB裂解液(100 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0,1.4 mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，2% CTAB)；酚∶氯仿∶异戊醇(25 ∶24 ∶1)混合液；TE缓冲液(10 mmol/L Tris·Cl，1 mmol/L EDTA,pH值8.0)；5×TBE缓冲液(54 g Tris 碱，27.5 g硼酸，20 ml 0.5 mol/L EDTA,pH值8.0)；Taq DNA聚合酶，购自金思特科技有限公司；Mg2+、10×Buffer和dNTPs，购自上海生工生物工程有限公司。

浙贝母基因组DNA的提取与分析

浙贝母基因组DNA的提取与分析

附表不同产地女贞子中水溶性活性成分和齐墩果酸的含量mg/g编号产地齐墩果酸对羟基苯乙醇-B-D-葡萄糖甙特女贞甙1上海9.17 6.780.882浙江7.68 6.110.683江苏10.797.56 1.044安徽8.83 6.240.775河北15.169.17 1.186福建13.167.430.872讨论2.1女贞子中齐墩果酸含量较高,对羟基苯乙醇-B-D-葡萄糖甙含量也相当高,其生理活性已经得到初步证实。

特女贞甙含量也是可观的,它是近来分离得到的新的裂环环烯醚萜甙,初步的药理试验表明,它在体外可与亚适量的Con A协同增加小鼠脾淋巴细胞的转化(详细数据另文发表)。

因此,同时测定女贞子中这3种成分的含量可用于全面评价女贞子的质量。

2.2曾采用索氏法、超声法和水浴回流提取法,设计了四因素3水平正交试验研究不同提取法和提取条件(溶剂、提取时间、提取次数)对齐墩果酸、对羟基苯乙醇-B-D-葡萄糖甙和特女贞甙提取率的影响,以提取液中待测成分的含量最大,且残渣中检测不出而方法相对简便为最佳条件。

结果显示,当提取齐墩果酸时,以索氏提取法,氯仿,提取1次2h为最佳提取条件;而提取对羟基苯乙醇-B-D-葡萄糖甙和特女贞甙时,则以索氏法经氯仿提取后,再以甲醇-水(7B3)提取1次2h为最佳。

2.3在测定方法中,将生药置索氏提取器中用氯仿处理是很关键的一步,通过这一步骤将女贞子的脂溶性和水溶性化学成分分开,分别进样分析以避免相互之间的干扰,并可缩短分析时间。

2.4曾试过1次进样后,以梯度洗脱来同时测定齐墩果酸、对羟基苯乙醇-B-D-葡萄糖甙和特女贞甙的含量,但结果不理想。

现采用的方法是1次提取(分步提取)后2次进样,色谱峰满意,操作也较为简便。

3参考文献1赵瑛等.中医药学报,1990;(6):472冯作化等.中国免疫学杂志,1986;2(2):883孙燕等.中华微生物和免疫学杂志,1983;3(4):2114菊地正雄等.药学杂志(日),1983;103:3605石力夫等.药学学报,1995;30(12):9356Inouye H et al.Tetrah edron,1972:28:42317菊地正雄等.药学杂志(日),1985;105:1428石力夫等.药学学报,1997;32(6):4421997-05-21收稿浙贝母基因组DNA的提取与分析高文远李志亮肖培根(中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所北京100094)傅荣昭(中国科学院遗传研究所北京100101)摘要对浙贝母叶片、鲜鳞片和干鳞片的基因组DNA,采用两种方法进行了提取。

中药材贝母DNA不同提取方法的比较_王淼

中药材贝母DNA不同提取方法的比较_王淼

第12卷第6期北华大学学报（自然科学版）Vol．12No．62011年12月JOURNAL OF BEIHUA UNIVERSITY （Natural Science ）Dec．2011文章编号：1009-4822（2011）06-0662-04中药材贝母DNA 不同提取方法的比较王淼1，谭莹2，张丽华2（1．北华大学医学检验学院，吉林吉林132013；2．北华大学药学院，吉林吉林132013）摘要：目的探讨中药材贝母DNA 的不同提取方法，为中药贝母的分子生物学鉴定提供参考．方法利用苯酚法、CTAB 法、SDS 法从中药贝母中提取DNA ，通过紫外分光光度和琼脂糖凝胶电泳对所得DNA 样品含量及纯度进行检测．结果利用3种不同的方法提取，药材贝母DNA 的A 260/A 280在1．80ʃ0．23左右．结论利用3种不同DNA 提取方法，均可从贝母样本中提取得到DNA ，且CTAB 法提取贝母的DNA 含量高、纯度好．关键词：贝母；DNA 提取；中药中图分类号：Q503；R282．5文献标志码：A收稿日期：2011-09-04作者简介：王淼（1976－），女，实验师，主要从事分子生物学技术在药物质量控制上的应用研究；通信作者：张丽华（1957－），女，教授，硕士生导师，主要从事分子生物学技术在药物质量控制上的应用研究．Comparative Study of Different Extraction Methods for the Isolationof DNA from Traditional Chinese Medicine FritillariaWANG Miao 1，TAN Ying 2，ZHANG Li-hua 2（1．Medical Inspection College of Beihua University ，Jilin 132013，China ；2．Pharmaceutical College of Beihua University ，Jilin 132013，China ）Abstract ：Objective To discuss the different extraction methods for the isolation of DNA from traditionalChinese medicine fritillaria and provide the reference for the molecular biology appraisal of the traditional Chinese medicine fritillaria．MethodThe Phenol ，CTAB and SDS methods were used to isolate DNA from the traditionalChinese medicine fritillaria ，and ultraviolet spectrophotometry and agarose gel electrophoresis were used to examine DNA content and quality．Results The ratios of A 260/A 280for DNA were between 1．80ʃ0．23with three different extraction methods．ConclusionThe three methods can be used for the extraction of DNA fromfritillaria．The CTAB method is the best method for the extraction of DNA from fritillaria ，and the DNA with highest content and purity from fritillaria can be got with this method．Key words ：Fritillaria ；DNA extraction ；traditional Chinese medicine 目前，分子生物学技术已被广泛应用于中药材鉴定、提取等方面［1-3］，DNA 的提取和纯化是中药材研究的重要基础，因此，简洁有效地提取高纯度、大量的DNA 是对中药材实施分子标记、基因文库构建、基因分离及其遗传转化和鉴定的重要前提．然而多数中药材经过加工处理后，药材中的DNA可能会受到不同程度的降解，不利于保持DNA 的完整性．再者，中药材中因含有次生代谢产物很难与DNA 分开，会直接影响中药材DNA 的提取及后续研究．如何能够快捷有效地提取到高质量、合格的DNA ，一直是生物技术研究者关注的问题．同一中药材用不同方法提取的DNA 纯度和提取率也不尽相同，不同中药材用相同方法提取DNA其结果也不同［4-5］．我们参考前人的工作，从中筛选了3种方法［6-8］，并稍加改进，以中药材贝母为研究对象，对3种不同方法的提取浓度、效率等方面进行了特定的比较，从中选出最佳的提取方法，为中药材贝母的分子生物学鉴定提供参考．1材料与仪器1．1药材浓蜜贝母（F．mellea）、瓦布贝母（F．wabue nsis）、青贝（F．prezwalskii Maxim）、松贝（F．unibracteata Hsiao et K．C．Hsia）鲜品（四川省茂县科技局提供）；平贝母（F．ussuriensis）、浙贝母（F．thunbergii．Miq）、湖北贝母（F．hupehensis Hsiao et K．C．Hsia）干品（中国药品生物制品检验所提供）．1．2试药CTAB、PVP、Tris、β-巯基乙醇、EDTA、SDS、10ˑPCR buffer、游离脱氧核苷三磷酸dNTPs、Taq DNA Polymerase（1000U）、DGL2000DNA Marker（北京鼎国生物技术公司）；100bp DNA Ladder（北京天根生化科技公司）；琼脂糖（England）；其他化学试剂均为分析纯；引物由生工生物（上海）有限公司合成；无菌双蒸水（自制）．1．3仪器GL-20G-Ⅱ型变速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；WD-9403C型紫外分析仪（北京市六一仪器厂）；9700型PCR扩增仪（ABI）；JY600C型双稳定时电泳仪（北京市君意东方电泳设备有限公司）；紫外凝胶成像自动分析仪（美国Cold Spring 公司）；紫外/可见分光光度计（Pharmacia4000）．2样品DNA提取方法2．1苯酚法参考文献［9］的方法，并做适当改进．称取各种样品0．1g，充分研磨后放入10mL离心管中，加入2．5mL的缓冲溶液A（50mmol/L Tris-HCl pH8．0，10mmol/L EDTA，5mmol/Lβ-巯基乙醇，2%SDS），混匀，37ħ水浴振荡过夜．室温，10000r/min离心10min．取上清液，加等体积的水饱和酚溶液（pH8．0），反复混匀，室温下作用20min．将混合液移入另一干净的离心管中，室温，10000r/min离心10min．取上层水相，先用酚-氯仿-异戊醇（25241，体积比），再用氯仿-异戊醇（241，体积比）各抽提1次，直至无白色中间层．将上清液移入离心管，加入等体积异丙醇混匀，于－20ħ放置30min．室温，12000r/min离心5min，得DNA絮状沉淀，用70%乙醇洗2次，再加入适量TE溶解，放入0．5 1μL RNaseA37ħ水浴中反应1 2h，4ħ保存．2．2CTAB法参考文献［10］的方法，并做适当改进．取各种样品0．1g，充分研磨后转移至离心管中，加入2ˑCTAB（1．4mol/L NaCl，100mmol/L Tris pH8．0，20mmol/L EDTA pH8．0，2%PVP，2%CTAB，3%β-巯基乙醇）200μL，混匀，65ħ水浴保温1h，期间不断震荡．4ħ，12000r/min离心10min．吸取上清液，加入等体积的氯仿-异戊醇（241，体积比）抽提2 3次，10000r/min离心5min．取上清液加2/3体积的无水乙醇，混匀后－20ħ放置1h沉淀核酸．4ħ，10000r/min离心5min，弃上清，得到DNA絮状沉淀．沉淀物用80%乙醇和无水乙醇分别漂洗两次，室温晾干，放入适量的植物TE缓冲液溶解，放入0．5 1μL RNaseA37ħ水浴中反应1 2h，4ħ保存．2．3SDS法参考文献［11］的方法，并做适当改进．取各种样品0．1g，充分研磨后转移至离心管中，加入DNA提取液（25mmol/L Tris-HCl pH8．0，50mmol/L EDTA，0．5%SDS，0．2%β-巯基乙醇）0．5mL，56ħ水浴保温30min．4ħ，12000r/min离心10min．吸取上清液，加入等体积的苯酚-氯仿（11，体积比）抽提2次，12000r/min离心5min．取上清液加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，4ħ，12000r/min离心5min，弃上清液，室温晾干后，放入适量的植物TE缓冲液溶解，再加入0．5 1μL RNaseA37ħ水浴中反应1 2h，4ħ保存．2．4DNA的纯度、产率检测将利用3种方法提取得到的模板DNA适当稀释后，用紫外分光光度计测定260nm和280nm处的吸光度A260和A280，以A260/A280的比值鉴定纯度，并计算DNA的浓度（见表1）．2．5DNA琼脂糖凝胶电泳检测将利用3种方法提取得到的DNA与6ˑLoading buffer（31，体积比）溶液混匀点样于0．8%琼脂糖凝胶板上，电压90V，电泳30min，并经紫外线检测拍照（见图1 3）．3结果3．1DNA纯度及浓度检测结果用苯酚法、CTAB法、SDS法提取的中药材贝母DNA的A260/A280为1．80ʃ0．23，表明3种方法366第6期王淼，等：中药材贝母DNA不同提取方法的比较均能提取得到一定量的DNA ，且DNA 的纯度较好，见表1．表17种贝母DNA 的纯度和浓度检测结果Tab．1Results of DNA purity and concentration from seven FritillariasSample Phenol method c （A 260/A 280）/（g ·L －1）CTAB method c （A 260/A 280）/（g ·L －1）SDS methodc （A 260/A 280）/（g ·L －1）F．mellea 1．7391．5051．6511．6812．2241．145F．wabuensis 1．6741．5151．6571．7431．8121．313F．prezwalskii Maxim 1．8001．7101．5951．6621．6000．770F．unibracteata 1．7801．6201．6251．6411．0091．204F．ussuriensis 1．7061．3651．6031．7142．0090．609F．hupehensis Hsiao 1．7351．4051．6001．6932．0790．627F．thunbergii．Miq1．7581．4151．6671．6901．6001．1803．2DNA 琼脂糖凝胶电泳图谱通过比较，苯酚法、CTAB 法、SDS 法提取DNA 效果较好，片段长度大小一致，RNA 去除干净，并且没有出现DNA 大量降解的情况（见图1 3）．图1苯酚法贝母样品DNA 琼脂糖凝胶电泳图谱Fig．1Agarose gel electrophoresis of FritillariaDNA extracted with Phenolmethod图2CTAB 法贝母样品DNA 琼脂糖凝胶电泳图谱Fig．2Agarose gel electrophoresis atlas of FritillariaDNA extracted withCTAB图3SDS 法贝母样品DNA 琼脂糖凝胶电泳图谱Fig．3Agarose gel electrophoresis of FritillariaDNA extracted with SDS4讨论植物中药材不同于动物中药材，除了具有细胞壁外，还含有大量的多糖、脂质、色素和酚类等物质，同时大多数DNA 在细胞中是与蛋白质结合在一起的，给DNA 的提取和纯化带来许多困难．因此，在分离和纯化DNA 时解聚核蛋白和去除蛋白质、酚类和多糖等物质是很重要的一步，而不同中药材所含有的干扰成分及DNA 结合的蛋白质的数量、成分、牢固程度有所不同，故用不同的方法提取不同植物中药材的DNA 效果不一样．苯酚法是DNA 提取中应用较为广泛的方法，其对新鲜样品的提取效果比较好（见图1），但DNA 的质量没有改善（见表1），其原因可能是氯仿、苯酚等改变不了酚类、多糖等对DNA 质量的影响．此外，实验过程中饱和酚容易氧化，平衡时操作较为繁琐．CTAB 是一种阳离子去污剂，可以破坏植物细胞壁，以利于细胞内容物的释放．此外，CTAB 还可与DNA 结合形成复合物，有利于将DNA 与变性蛋白质及多糖分开．PVP 是一种高分子合成树脂，能络合多酚物质，防止酚类化合物氧化成醌类，避免溶液变褐而具有抗氧化作用，并且可直接通过离心或氯仿-异戊醇抽提去除．从本实验来看，CTAB 法对于许多新鲜植物DNA 的提取是较为适用的，但对干品中药材的DNA 的提取纯度相对不高（见图2）．SDS 也是去污剂，可直接裂解细胞，使其释放出核DNA ，其DNA 的质量还可以，但是产量很低，同时SDS 法存在拖尾和杂质污染现象（见图3）．通过3种不同方法对中药材贝母DNA 提取效果的比较可知：各种提取方法本身均具有不同的特点和优缺点，而这3种方法中，CTAB 法提取效率高，操作简便，所需器材和设备的要求不高，无污染，且试剂经济实惠（大多为国产试剂），最适合于中药材贝母DNA 的提取．参考文献：［1］National Pharmacopoeia Committee．Ministry of Health466北华大学学报（自然科学版）第12卷Standards for Pharmaceuticals ［S ］．Traditional Chinese Medicine Preparations Volume Sprayed ，2005：25．［2］CAI ZH ，LI Ping ，DONG T X ，et al ．Fritillaria Identifi-cation Methods in Molecular Biology Research ［J ］．Pharmaceutical University ，2000，35（4）：309-312．［3］CAO Hui ，BI PX ，SHAO P．Identification of Chinese Drug“Herbal Elephantopi ”by DNA Fingerprinting Using Random Primer PCR ［J ］．Herbs ，2005，20：643．［4］Welsh J ，Mcclelland M．Fingerprinting Genomes UsingPCR with Arbitrary Primers ［J ］．Nuel Acids Res ，2000，18：7213-7216．［5］ZHOU Zuo-bin ，GE Gang．Identify Genuine MedicinalAterials by the DNA Molecule ［J ］．Jiangxi Science ，2006，26（3）：508-510．［6］GONG B Q．Research Progress on the IdentificationMethods of Fritillaria ［J ］．Journal of Anhui Agri Sci ，2009，37（4）：1603-1604．［7］CAI PX ，Woohok-sin ，Wongman-sau ，et al ．Genotyping andSpecies Identification of Fritillariaby DNA Chips ［J ］．Acta Pharmaceutica Sinica ，2003，38（3）：185-190．［8］LU S D．Modern Molecular Biology Experiment Techno-logy ［M ］．Beijing ：Higher Education Publishing House ，2003：365．［9］内宫博文，田仲可昌，杉浦昌弘，等．植物基因工程技术［M ］．上海：上海科学技术文献出版社，2005：3．［10］Murray M G ，Thompson W F．Rapid Isolation ofMolecular Weight Plant DNA ［J ］．Nucl Acids Res ，1980，8：4321-4325．［11］Angelo Karakousis ，Peter Langridge．A High-throughputPlant DNA Extraction Method for Marker Analysis ［J ］．Plant Molecular Biology Reporter ，2003，21（1）：95．【责任编辑：陈丽华櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴】本刊声明来稿要求一式两份（一份为打印稿，另一份为电子稿）．来稿一律不退，请自留底稿．切勿一稿多投，来稿在六个月内未接到录用通知可自行处理．为适应我国信息化建设的需要，扩大作者学术交流的渠道，本刊所刊文章的全文通过《中国期刊网（CNKI ）》、《万方数据-中国数字化期刊群》和《中文科技期刊数据库》入网．作者著作权使用费与本刊稿酬一次性给付．如作者不同意将文章编入光盘及上网，请在来稿时声明，本刊将做适当处理．566第6期王淼，等：中药材贝母DNA 不同提取方法的比较。

一种提取高质量贝类基因组DNA的简易方法

一种提取高质量贝类基因组DNA的简易方法

一种提取高质量贝类基因组DNA的简易方法彭敏;蒋伟明;陈秀荔;杨春玲;李咏梅【摘要】以企鹅珍珠贝(Pteria penguin)闭壳肌为样品,利用高盐+十二烷基硫酸钠(SDS)除去蛋白和多糖,用低盐+十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)进一步纯化DNA,建立一种贝类基因组DNA简便、安全、经济的提取方法.改进后的SDS-CTAB法提取的DNA纯度较高,无蛋白质和RNA污染;酶切和AFLP实验验证表明,所提取DNA可满足酶切分析和分子标记等实验的要求.【期刊名称】《广东海洋大学学报》【年(卷),期】2010(030)006【总页数】4页(P78-81)【关键词】企鹅珍珠贝;DNA抽提;SDS-CTAB法【作者】彭敏;蒋伟明;陈秀荔;杨春玲;李咏梅【作者单位】广西水产研究所,广西,南宁,530021;广西水产研究所,广西,南宁,530021;广西水产研究所,广西,南宁,530021;广西水产研究所,广西,南宁,530021;广西水产研究所,广西,南宁,530021【正文语种】中文【中图分类】Q-33+Q75企鹅珍珠贝（Pteria penguin）为大型珍珠贝类，因其可培育粒大质优的附壳珍珠和圆形珍珠而备受关注，近几年成为北部湾地区新兴养殖品种[1-3]。

为更好开发和利用企鹅珍珠贝，学界从DNA 水平研究了其遗传多样性，为品质改良和养殖提供依据。

DNA 是RAPD、AFLP、微卫星等分子标记技术的基本材料，因而提取高质量DNA至关重要[4-5]。

在提取过程中，由于海洋贝类中多糖和蛋白含量很高，不易获得高纯度、完整的基因组DNA，常规的酚／氯仿抽提法操作繁琐，且酚和氯仿有毒，实验危险性大。

而采用海洋动物组织基因组DNA 提取试剂盒抽提DNA，费用较高，且获得量少。

而一些无毒抽提法（如高盐法等）提取的基因组DNA 适用于一般PCR 技术，但涉及DNA 酶消化等实验所提取的DNA 仍需进一步纯化，这些提取方法对富含多糖组织效果不佳[6]。