纳米金放大法荧光检测乙肝病毒HBV-DNA
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纳米金放大法荧光检测乙肝病毒HBV-DNA
牛淑妍;娄晓飞;渠丽景
【摘 要】利用纳米金放大的方法,将修饰荧光团的信号DNA连接在纳米金表面,纳米金通过HBV-DNA与磁珠连接,1,4-二硫苏糖醇(DTT)可以替代信号DNA连接在纳米金表面,将荧光素标记的信号DNA释放于溶液中,测定溶液的荧光强度可以得到HBV-DNA的浓度.通过条件优化实验确定了最佳实验条件:生物素与亲和素最佳结合时间为25 min,DNA的最佳杂交时间为15 min.测定HBV-DNA的线性范围为3.0×10-13～1.2×10-12 mol·L-1,线性相关系数r=0.991 4,检测限为2.18×10-14 mol·L-1 (S/N=3).%Using a highly ultrasensitive fluorescence-detection
method based on gold nan-oparticles and magnetic beads assisted by
dithiothreitol (DTT) could detect the target DNA. The detection of HBV-DNA was achieved by monitoring fluorescence signals obtained from the
adsorbed thiolated oligonucleotides modified with fluorophore which were
liberated from the gold nanoparticle surface. The best reaction conditions
were obtained through the study on the effect of different reaction time
on the system's fluorescent intensity. The optimal reaction time of biotin
and streptavidin was 25 min. 15 min was chosen as the hybridization time
of capture probes and target DNA. In the system of fluorescence
spectroscopy based on gold nanoparticles, the HBV-DNA could be
quantified in the range of 3. 0 × 10-13-1. 2 × 10-12 mol ? L-1 and the
detection limit was 2. 18 × 10-14 mol ? L-1(S/N = 3).
【期刊名称】《青岛科技大学学报（自然科学版）》 【年(卷),期】2012(033)001
【总页数】5页(P42-46)
【关键词】HBV-DNA;纳米金;荧光光谱
【作 者】牛淑妍;娄晓飞;渠丽景
【作者单位】青岛科技大学化学与分子工程学院,山东青岛266042;青岛科技大学化学与分子工程学院,山东青岛266042;青岛科技大学化学与分子工程学院,山东青岛266042
【正文语种】中 文
【中图分类】O657.32
金纳米颗粒在涉及诸如材料科学的多类型组装、单颗粒行为、尺寸相关的电、光、磁特性、催化作用和生物应用等方面具有其独特的性质。在涉及纳米颗粒进行疾病的基因诊断方面，利用胶体金、磁性纳米颗粒或半导体纳晶（量子点）的研究已有大量的文献报道［1-6］。
Elghanian等［7］使用双探针夹心杂交、纳米颗粒放大、显色技术检测了合成靶DNA，但检测临床标本的效果如何尚有待验证。Wang等［8］制备Au纳米颗粒HBV－DNA基因探针，在玻片上目视化检测HBV－DNA的PCR产物，不需特殊仪器，结果易于观察，但自主制备过程十分繁琐，其检测敏感性有必要进一步提高。
本研究利用纳米金信号放大的方法检测HBV－DNA的浓度，方法简单，提高了检测的灵敏度。
1 实验部分 1.1 仪器与试剂
荧光分光光度计，F－4500型，日本日立公司，仪器参数为：扫速为1
200nm·min－1，激发和发射狭缝都为5.0nm；电热恒温水箱，H H.W21.420型，天津市泰斯特仪器有限公司；紫外分光光度计，Cary 50型，美国瓦里安技术中国有限公司；透射电子显微镜，Jeol JEM－2000X型，日本JEOL公司；振荡器，巩义市英峪仪器厂。
包覆亲和素的磁珠（粒径3～4μm，浓度为10g·L－1），天津倍思乐色谱技术；Tween 20（AR），北京索莱宝科技有限公司；1，4－二硫苏糖醇（DTT），美国Sigma公司；氯金酸，烟台三和化学试剂有限公司；三（2－羧乙基）磷酸盐（TCEP，98%），英国Alfa Aesar公司；柠檬酸三钠，天津市博迪化工有限公司；10g·L－1的HAuCl4的制备：将1g HAuCl4溶于100mL的蒸馏水中，4℃条件下储存。缓冲溶液的配制：HAc－NaAc缓冲溶液（0.1mol·L－1 HAc－NaAc，pH 5.2）；Tris－HAc缓冲溶液（0.1mol·L－1 NaCl，10mmol·L－1 Tris－HAc，pH 8.2）；储存缓冲溶液（300 mmol·L－1 NaCl，25mmol·L－1 Tris－HAc，pH 8.2）；磁珠洗液（100mmol·L－1 Tris－HCl，0.1%（体积分数）Tween 20和1mol·L－1 NaCl，pH 8.0）；杂交缓冲溶液（20mmol·L－1 Tris－HCl，20
mmol· L－1 EDTA，150mmol· L－1 NaCl，0.05% （体积分数）Tween 20，pH 7.4）；Tris－HCl缓冲溶液（25mmol·L－1 Tris－HCl，0.3 mol·L－1 NaCl，pH 8.2）。实验所有用水均为二次蒸馏水。
人工合成的寡核苷酸（北京赛百盛有限公司）序列如下：
探针DNA：5′－TGTCCTGGCTATCGCTGGATGGACAT－3′－生物素；
目标DNA（HBV－DNA）：5′－ATCCAGCGATAGCCAGGACAAGTT
GGAGGACAAGAGGTTGGTGAGTG－3′；
三碱基错配目标 DNA：5′－ATCCTGCGAAA GCCTGGACAAGTTGGAGGACAAGAGGTTGGTGAGTG－3′；
连接 DNA：3′－TCTCCAACCACTCAC－T8－SH－5′；
信号 DNA：5′－FAM－T6－TAGCATGCGTTATA GATGATATAT－T6－SH－3′。
1.2 实验原理
图1 纳米金放大法荧光检测DNA实验原理图Fig.1 The working principle of
gold nanoparticles amplification assay for fluorescence detection
实验原理见图1。连接DNA和信号DNA通过巯基连接在纳米金表面，探针DNA通过生物素连接在包覆亲和素的磁珠上。加入目标DNA和连接DNA的纳米金后，探针DNA双链被打开，并与目标DNA发生杂交反应，纳米金表面的连接DNA与目标DNA部分杂交。这样使得磁珠和纳米金通过DNA的杂交反应连接在一起。将连接好的磁珠和纳米金复合物放入DTT溶液中，DTT可取代信号DNA连接在纳米金表面，使得荧光素标记的信号DNA脱离纳米金表面而被释放到溶液中，溶液中信号DNA的量与溶液中目标DNA的浓度呈线性关系，测定溶液的荧光强度可以得到目标DNA的浓度。
1.3 实验方法
1.3.1 纳米金的合成
用王水洗涤纳米金合成过程中用到的器皿。向三口烧瓶中加入150mL 1.0mmol·L－1的HAuCl4溶液，搅拌条件下加热。煮沸，立即加入15mL 38.8mmol·L－1的柠檬酸三钠溶液，继续加热搅拌，溶液的颜色由浅黄逐渐变为深红色，继续加热搅拌15min，在搅拌条件下冷却至室温，放入棕色瓶中4℃储存。
1.3.2 纳米金上连接DNA
将5.0×10－10 mol的连接DNA和2.0×10－9 mol信号 DNA 加入到4.0μL
HAc－NaAc缓冲溶液中，混合均匀，加入1.5μL 10mmol·L－1 TCEP活化1h，反应结束后向上述溶液加入1mL制备好的纳米金，在室温条件下轻微振荡过夜。加入Tris－HAc缓冲溶液，室温孵育24h。将修饰好的AuNPs在15 000r·min－1条件下离心30min，洗涤红色沉淀物1次，然后将红色沉淀物分散在1mL储存缓冲溶液中，即得到连接DNA和信号DNA修饰好的AuNPs溶液，该溶液于4℃下保存待用。
1.3.3 磁珠和纳米金的连接
取10μL包覆亲和素的磁珠放入样品管中，加入200μL磁珠洗液洗涤2次，然后向样品管中加入200μL磁珠洗液和15μL 2.1×10－6 mol·L－1生物素修饰的探针DNA，在20℃条件下反应25min。反应完毕后用200μL杂交缓冲溶液洗涤2次，然后加入200μL杂交缓冲溶液和10μL 2.2×10－6 mol·L－1目标 DNA 溶液，37℃反应15min，加入10μL修饰DNA的纳米金，室温反应1h。
1.3.4 DTT和纳米金表面DNA的替换反应
上述反应液经过磁分离后，用200μL Tris－HCl缓冲溶液洗2次，加入配制好的DTT溶液（最终浓度为12mmol·L－1）和600μL Tris－HCl缓冲溶液，室温反应20h，磁分离后，在激发波长为470nm的条件下，记录500～550nm范围内清液的荧光强度。
2 结果与讨论
2.1 纳米金透射电镜和紫外光谱表征
将制备好的纳米金用高分辨透射电子显微镜进行分析，见图2。由图2可以看出，纳米金的平均尺寸约13nm，并且尺寸分布较均匀，分散性较好。
图2 纳米金的透射电镜图Fig.2 TEM image of gold nanoparticles
图3为连接DNA前后纳米金的紫外吸收光谱图。从图3曲线a可以看出，在520nm左右出现了纳米金的紫外吸收峰；图3曲线b是在纳米金上修饰了DNA后的紫外吸收光谱图，在260nm左右出现了DNA的紫外吸收峰，说明DNA成功的连接在了纳米金的表面。 图3 连接DNA前后纳米金的紫外吸收光谱图Fig.3 UV－Vis spectrum of gold
nanoparticles and gold nanoparticles linked with DNAa.纳米金；b.连接DNA的纳米金。
2.2 生物素与亲和素结合时间的优化
在固定磁珠、各种洗液及DNA溶液量的条件下，考察了生物素与亲和素结合时间对体系荧光强度的影响，结果见图4。由图4可以看出，随着两者结合时间的增加，体系荧光强度呈现先增加后减小的趋势。当生物素与亲和素结合时间为25min时，体系荧光强度最强，因此选择生物素与亲和素结合时间为25min。
图4 生物素与亲和素结合时间对体系荧光强度的影响Fig.4 Effect of reaction
time of biotin and streptavidin on the system’s fluorescent intensity
2.3 探针DNA和目标DNA杂交时间的选择
在固定磁珠、各种洗液及DNA溶液量、温度等条件下，考察了DNA杂交时间对体系荧光强度的影响，结果见图5。由图5可以看出，随着杂交时间的延长，体系荧光强度呈现先增加后减小的趋势。当杂交反应时间为15min时，体系荧光强度最强，因此选择DNA杂交时间为15min。
