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2010.012010.01的目的基因克隆进表达载体(fuse phage)，与噬菌体的外壳蛋白基因融合表达，使得一个噬菌体上含有一种序列的肽。
与有机合成法相比较，该方法有其独特的优越性：它可将特定分子的基因型和其表型统一在同一个病毒颗粒内，并且将选择能力和扩增能力联系在一起，即通过与配体的结合从数量众多的多样性群体中选择出表达有相应配体的噬菌体颗粒，再通过感染大肠杆菌使选择出的噬菌体颗粒得到扩增。
其不足在于肽库的容量及短肽的大小受到了限制，且只能表达L 型天然氨基酸形成的短肽。
3噬菌体肽库的筛选技术如何从噬菌体肽库中筛选到特异的重组噬菌体是肽库技术的关键。
经典的方法有两种：①将纯抗体包被在固相介质上，如酶标板、免疫试管或亲和层析柱，然后加入待筛选的噬菌体，洗去非亲和性的噬菌体，回收高亲和性的噬菌体；②将抗体与生物素基因相连，再将其固定在包被有Streptavidin 的磁珠上对噬菌体进行筛选。
3.1宿主菌直接洗脱经典筛选过程中，一般利用pH 的变化来洗脱与目标分子结合的噬菌体，这可能对噬菌体造成伤害。
利用噬菌体与宿主之间的亲和性可以直接用宿主菌来洗脱，以避免对筛选的影响，并且将洗脱和感染合并到一步[7]。
3.2双层膜筛选系统获得重组噬菌体蛋白的方法是将筛选出的特异噬菌体转入不含校正基因的菌株，将外源蛋白以可溶性蛋白的形式表达出来。
通过细胞膜间隙最终进入培养基质中。
针对这种情况，Skerra 等[8]建立了双层膜筛选系统。
第一层膜为亲水性多孔膜，这种膜对蛋白质的结合能力小，孔径能让蛋白质分子自由通过，但细胞不能通过；第二层膜为疏水膜，膜表面包被目标蛋白(抗原或抗体)，两种膜分别覆盖在固体培养基上。
细胞在第一层膜上培养一段时间后，将这层膜转移到第二层膜上培养，分泌的可溶性蛋白透过第一层膜，与第二层膜上的目标蛋白结合，然后再用已知的抗原或抗体筛选。
这种方法避免了蛋白常遇到的细胞碎片的干扰，提高了筛选效率。
噬菌体展示技术筛选脑靶向功能肽及其修饰纳米粒的脑内递药研究一、概述在生物医学领域中，脑靶向递药系统一直是研究的热点和难点。
由于血脑屏障的存在，许多药物难以有效进入大脑，从而限制了其在中枢神经系统疾病治疗中的应用。
开发新型的脑靶向递药技术，对于提高药物在脑部的浓度和疗效，降低副作用具有重要意义。
噬菌体展示技术以其独特的优势在药物研发和生物医学领域得到广泛应用。
该技术通过将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面。
利用噬菌体展示技术，我们可以筛选到与特定靶标具有高亲和力的多肽或蛋白，为药物研发和疾病治疗提供新的候选分子。
本研究旨在利用噬菌体展示技术筛选具有脑靶向功能的多肽，并将其修饰到纳米粒表面，构建新型的脑靶向递药系统。
通过优化筛选条件和方式，我们成功获得了多个具有脑靶向功能的多肽序列，并通过实验验证了其脑靶向性。
我们还将这些多肽以共价连接的方式修饰到聚乙二醇聚乳酸羟基乙酸共聚物（PEGPLGA）纳米粒表面，以提高药物的稳定性和脑部递送效率。
本研究不仅为脑靶向递药系统的开发提供了新的思路和方法，还为中枢神经系统疾病的治疗提供了新的候选药物和递送策略。
通过进一步的研究和优化，我们相信这种新型的脑靶向递药系统将在未来为更多的患者带来福音。
1. 介绍脑靶向药物递送的重要性与挑战脑靶向药物递送是神经科学领域的一个关键研究方向，对于治疗脑部疾病具有重要意义。
由于血脑屏障的存在，许多药物难以有效穿透并进入脑组织，这使得脑内疾病的治疗面临着巨大的挑战。
开发高效的脑靶向药物递送系统成为当前研究的热点和难点。
脑靶向药物递送的重要性主要体现在以下几个方面：对于脑部疾病如阿尔茨海默病、帕金森病、脑肿瘤等，有效的药物递送能够显著提高治疗效果，改善患者的生存质量。
脑靶向递送系统能够实现药物的精准定位，减少对其他组织器官的副作用。
噬菌体展示实验步骤及总结噬菌体展示技术（Phage Display）是一种利用噬菌体（phage）作为载体表达、展示外源蛋白质或肽段的技术。
该技术可以通过体外筛选方式寻找与特定生物分子相互作用的肽段或蛋白质，并在医学、农业、环境科学等多个领域应用广泛。
本文将介绍噬菌体展示实验的步骤及总结。
一、噬菌体展示实验步骤1.分离噬菌体基因组首先需要从所需噬菌体中提取其基因组DNA，进行适当的酶切、纯化、修饰和扩增等操作，以获得高质量的DNA样品。
2.插入外源DNA将需要展示的外源肽段或蛋白质基因克隆到噬菌体基因组中的特定区域（通常是其Capsid蛋白的的N末端），使其与噬菌体基因组融合。
插入操作可采用PCR扩增、克隆或基因合成等方法进行。
3.包装噬菌体将重组噬菌体基因组与一定的病毒包装反应液混合，经过一定的反应时间，使其封装成噬菌体颗粒。
包装操作可在细菌宿主中进行，也可采用体外装配法，将噬菌体基因组与其他组件（例如，在非细菌宿主中回收的Capsid蛋白）进行反应，实现噬菌体的包装。
4.筛选目标配体将噬菌体颗粒通过筛选池，如固体支持物、细胞表面或溶液相应用目标体分别进行生物学或化学实验等。
通过筛选，得到与目标体有特异性、较高亲合力的噬菌体颗粒。
随后将噬菌体提取、扩增等操作，得到一系列具体的孤儿噬菌体（orphan phage）或配体噬菌体。
5.注意事项在实验过程中需注意的一些问题：（1）噬菌体的主要结构是头部和尾部，根据实验需要可对其进行不同的修饰（例如添加标签、调整展示方向等），以增加其展示效率和特异性等。
（2）外源蛋白的表达量、保持稳定性通常受到噬菌体载体、连接方式、插入位置、转化水平等因素的影响，实验中需对其进行合理设计。
（3）噬菌体筛选应选择样品的适当浓度、筛选反应时间等，以保证准确、高效地获得目标配体。
二、噬菌体展示实验总结噬菌体展示技术是一种非常有前景的生物技术，逐渐成为体外筛选的重要手段之一。
噬菌体在基因工程技术领域中的应用研究进展噬菌体（phage）是一类寄生于细菌体内的病毒，它们以细菌为宿主，通过感染细菌并进行复制繁殖来完成自己的生命周期。
噬菌体在基因工程技术领域中具有广泛的应用前景。
不仅可以用于基因传递和基因治疗，还可以在基因工程中作为模型组织来研究基因功能和调控。
本文将重点探讨噬菌体在基因工程技术领域中的应用研究进展。
噬菌体在基因工程中的一项重要应用是基因传递。
噬菌体可以作为载体传递外源基因到细菌中，实现基因的插入、表达和产物的生产。
常见的噬菌体载体有T7、lambda和M13等。
通过对这些噬菌体载体进行修饰，可以构建目标基因的克隆，实现目标基因的表达和功能分析。
此外，噬菌体还可以被用于将外源基因传递到其他生物中，如植物、动物细胞和真核微生物等。
这些应用丰富了基因工程技术在不同领域的研究内容，并促进了基因工程技术的快速发展。
另一个噬菌体在基因工程中的应用是基因治疗。
基因治疗是利用基因工程技术来修复或替代患者体内缺陷基因的一种新型治疗方法。
噬菌体可以通过转导获得的基因带入人体细胞，使其表达函数性蛋白质，以治疗基因缺陷带来的疾病。
噬菌体可以作为基因传递载体，将目标基因传递到人体细胞中，使其发挥治疗作用。
这种基因治疗方法具有靶向性、高效性和安全性等优势，且可以应用于众多遗传病的治疗，为基因工程技术开辟了新的研究和应用领域。
此外，噬菌体还可以在基因工程中作为模型组织来研究基因功能和调控。
通过研究噬菌体的基因组、基因调控和其与细菌宿主的相互作用，可以深入了解细菌感染和噬菌体复制的机理。
噬菌体的复制过程中涉及的调控因子和蛋白质可以为其他生物的基因调控研究提供参考。
此外，噬菌体还被广泛应用于基因工程中的分子生物学研究，如DNA测序、PCR扩增和基因克隆等。
通过对噬菌体的研究，可以不断优化和改进基因工程技术，以满足不同研究领域的需求。
噬菌体在基因工程技术领域中的应用受到了广泛关注，然而也面临着一些挑战。
噬菌体在基因工程技术领域中的应用研究进展引言：近年来，基因工程技术的不断发展和突破为人们解决了许多生物学上的难题。
其中，噬菌体作为一种具有特殊生物学特性的病毒，被广泛应用于基因工程技术的领域。
本文将以噬菌体在基因工程技术中的应用研究进展为主题，对噬菌体的特点、应用及未来的发展进行综述。
一、噬菌体的特点噬菌体是一种寄生性病毒，可以侵染并感染革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
与其他病毒相比，噬菌体具有以下几个特点：1. 寄生性：噬菌体需要依赖宿主细菌的代谢过程进行复制。
2. 简单结构：噬菌体一般由头、颈和尾部组成。
头部存储基因组，颈部连接头部和尾部，尾部用于将噬菌体注入宿主细菌。
3. 宿主范围广泛：噬菌体可以感染多种不同种类的细菌，包括耐药菌株。
二、基因工程技术中的噬菌体应用1. 噬菌体展示技术噬菌体展示技术是一种利用噬菌体颗粒表面展示外源蛋白质的方法。
这种技术可以将外源蛋白质与噬菌体表面蛋白进行融合，从而使得外源蛋白质能够在噬菌体表面展示。
噬菌体展示技术被广泛应用于抗原呈递、抗体库构建和新药筛选等领域，对于研究蛋白质结构与功能具有重要意义。
2. 噬菌体基因库构建噬菌体基因库是指将大量的外源DNA片段插入噬菌体的基因组中，形成一个具有多样性的基因库。
通过筛选和分离，可以从中获得对应所需特定功能的基因或蛋白质。
噬菌体基因库构建被广泛应用于药物发现、基因功能研究和酶工程等领域，加速了基因工程技术的发展。
3. 噬菌体介导的基因传递噬菌体可以作为基因传递的载体，将外源基因导入宿主细菌中，从而实现遗传物质的传递与表达。
这种方式在基因工程技术中具有重要的应用，例如基因修饰、基因治疗和基因工程生物的制备等。
三、噬菌体在基因工程技术中的应用进展1. 军用应用噬菌体在军事领域的应用已经取得了一些进展。
例如，利用噬菌体展示技术，可以设计出具有特定功能的蛋白质，用于生物传感器和生物武器检测。
另外，噬菌体还可以用于疫苗的开发，提高军队在传染病防控中的能力。
噬菌体展示技术研究进展刘倩,赵玉军(沈阳农业大学畜牧兽医学院,辽宁沈阳110161)摘要噬菌体表面展示技术是一种将外源蛋白或抗体可变区与噬菌体表面特定蛋白质融合并展示于其表面,构建蛋白质或抗体库,并从中筛选特异蛋白质或抗体的基因工程技术。
介绍这一技术的原理、相关展示系统以及在蛋白质相互作用的研究,抗体及疫苗的制备、多肽药物的研制等方面的应用潜力和独特的优点。
关键词噬菌体;噬菌展示技术;融合蛋白中图分类号Q939.48文献标识码A文章编号1005-7021(2007)06-0096-04R ecent D evel op m ent of Phage D isp l ay Techni queLIU Q ian,Z HAO Yu-j u n(Colle g e of A ni ma lH u sband ry and Ve t erinary M e d ici ne,S he nyang Ag ri cult ura l Un iversit y,S he nyang110161,China)A bstrac t P hage disp l ay is a g enetic eng i neer i ng techn i que tha t comb i nes the exogenous pro te i n o r a lternati v e seg-m ent of anti body w it h the spec ific surface pro tei n of phage to f o r m peptide or anti body li braries fo r screen i ng the speci-f ic prote i ns or anti bodies.T his paper i ntroduced the princ i p l e and the re l ative syste m s of phag es d i splay techn i que. T h i s technique has unique advantag es and g rea t potenti a ls in the m any fi e l ds such as research o f prote i n i nteracti on and deve l op m ents o f anti bod i es,vaccine and drugs.K eywords Phag e d isplay technique;Pr i nc i ple;A pp licati on1985年噬菌体展示技术由Sm it h[1]建立。
它通过将编码外源多肽或蛋白质的基因与噬菌体外壳蛋白基因融合,从而使表达的多肽或蛋白质以融合蛋白形式展现在噬菌体表面。
这项技术最大的优点是直接将基因型和表型,分子结合活性与噬菌体的可扩增性联系在一起,通过配体的特异性亲和力,将所需的多肽或蛋白质筛选出来。
近20a噬菌体展示技术的研究进展非常迅速,在蛋白质间相互作用研究,抗体和疫苗的制备,多肽药物的研制,疾病的诊断技术等方面得到了广泛应用。
1噬菌体展示技术的原理概述1.1原理噬菌体展示技术是将目的基因与编码噬菌体衣壳蛋白基因相连接,并插人到噬菌体表达载体上,使多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面,被展示的多肽可保持相对独立的空间结构和生物学活性。
将展示文库(即噬菌体展示肽库和噬菌体展示抗体库)作为流动相,将与预选择的融合蛋白有特异亲和力的靶物质固定在一个固相载体上,洗去不能与固定相特异结合的蛋白,而将特异结合的蛋白洗脱下来,再进一步扩增,进入下一轮淘筛。
噬菌体展示技术的操作路线便是通过PCR 方法获得目的基因,如抗体全套可变区基因,将扩增产物通过酶切连接反应重组到噬菌体载体,并通过与噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白,把目的基因如Fab段,单链抗体Sc Fv表达在噬菌体表面,然后通过淘筛筛选出特异性蛋白,最后通过大肠杆菌表达系统表达出特异性蛋白。
噬菌体展示技术的一个重要构成是噬菌体载体,有许多种噬菌体可以作为载体运用于噬菌体展示:丝状噬菌体、收稿日期:2007-05-08作者简介:刘倩女,在读硕士。
研究方向为动物传染病学。
96微生物学杂志2007年11月第27卷第6期J OURNAL OF M I CROB I OLOGY N ov.2007V o.l27N o.6K噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体。
1.2丝状噬菌体系统丝状噬菌体M13为单链DNA病毒,呈细杆状,有5种表面蛋白:PÓ、PÖ、P×、PØ、PÙ,每一种蛋白都可以用于外源蛋白的展示,然而PÓ、PØ是运用最广泛的表面蛋白。
PØ是由基因Ø编码的丝状噬茵体主要表面蛋白,将噬菌体基因组包裹于其中。
每个噬菌体颗粒有2700~ 3000个拷贝数的PØ蛋白。
将外源基因与PØ的N端附近融合可表达超过100个拷贝数的五或六肽。
PÓ是由基因Ó编码的次要表面蛋白,位于噬菌体颗粒的尾部。
每个噬菌体颗粒都有1 ~5个拷贝PÓ蛋白,PÓ有2个位点可供外源序列插入,即N端和近N端可屈伸臂区内。
当蛋白质融合到PÓ的N端时,噬菌体仍有感染性,但若融合到后一位点则会切去N端而丧失感染性。
PØ和PÓ展示系统的主要区别在于PØ拷贝数高,成千上万的蛋白能与其融合展示,但与其融合展示的蛋白较小,因为较大的多聚蛋白会造成空间障碍,影响噬菌体装配,使其失去感染力。
PÓ虽然只有1~5个拷贝,但对外源蛋白的大小没有严格限制,较大蛋白能在其表面展示。
1.3K噬菌体系统K噬菌体的基因组呈线形双链DNA,有2个结构单位,即头部和尾部分别由D蛋白和PV蛋白装配而成。
D蛋白的相对分子质量为11000,缺少D蛋白的突变体可以装配成一种较野生型短18%的颗粒。
外源蛋白和D蛋白融合后不会干扰噬菌体的装配,展示的外源蛋白在空间上是可以接近的。
PV蛋白构成了K噬菌体的尾部管状部分,该管状结构由32个盘状结构组成,每个盘又由6个PV亚基组成,因此每个K噬菌体有192个PV的拷贝。
PV蛋白c端的折叠结构域(非功能区)可供外源序列插入或替换。
目前,用PV系统已成功展示了具有活性的B-半乳糖苷酶和Bauhinia Purpurea凝集素。
该系统展示的外源蛋白质的拷贝数为平均1个分子/噬菌体,这表明外源蛋白质或多肽可能干扰了K噬菌体的尾部装配。
1.4T4噬菌体展示系统T4噬菌体基因组DNA为双链线形,呈环状排列。
T4噬菌体表面展示是利用噬菌体衣壳的外表面包被着2种非必需外壳蛋白SOC和HOC,将外源多肽或蛋白分别与T4噬菌体SOC位点的c末端和HOC位点的N末端融合而展示于T4噬菌体的表面。
SOC位点展示通过一个重组载体将融合有外源序列的SOC融合基因同源整合入缺失SOC的T4基因组中,选择恢复溶菌酶生长不依赖性的噬菌体,即可将外源肽或蛋白质展示于噬菌体表面。
HOC位点展示则通过体外包装实现。
将目的基因连接于hoc基因的C端,构建hoc 融合基因表达载体,并在I PTG的诱导下表达HOC融合蛋白。
在与HOC蛋白缺失的T4噬菌体突变株共感染时,将HOC融合蛋白包装到T4噬菌体衣壳表面的HOC位点,实现外源蛋白在T4噬菌体的HOC位点的展示。
另外可以构建双展示噬菌体。
将SOC与外源蛋白的融合基因整合入噬菌体基因组中,再取已经整合了外源基因的噬菌体按HOC位点展示的方法进行HOC位点体外包装,就可实现SOC、HOC双位点的同时展示。
1.5T7噬菌体展示技术T7噬菌体是感染大肠杆菌的小型烈性噬菌体,基因组为线性双链DNA,长39936bp。
其衣壳蛋白包括主要头蛋白P10A,次要头蛋白P10B,颈圈蛋白P8,尾蛋白P11、P12和尾丝蛋白P17。
一般在P10B的C端插入外源基因,进行融合蛋白展示。
T7噬菌体生长非常迅速,在固体培养基上形成噬菌斑只需3h,在菌液中从感染到裂解只需1~2h,而且T7噬菌体极为稳定,能在各种严酷的条件下不被破坏,如高pH值、高盐、变性剂。
T7展示系统可以高拷贝量(415/噬菌体)展示50个氨基酸的多肽,以低拷贝量[(0.1~1)/噬菌体]或以中拷贝量[(5~15)/噬菌体]展示1200个氨基酸的多肽或蛋白质。
2噬菌体展示技术的应用2.1蛋白质间相互作用研究由于研究技术手段的有限,阻碍对许多功能性蛋白质的研究,但噬菌体展示技术的出现却对蛋白质的结构,它们之间的相互作用,以及与它们相关基因的相互作用的研究提供了更可靠的方法。
许多分子的生物活性都受到翻译后修饰作用的影响,酪氨酸硫化便是影响蛋白与蛋白间结合976期刘倩等:噬菌体展示技术研究进展的重要因素。
由于在分泌蛋白和膜蛋白上的酪氨酸硫酸盐导致免疫系统耐受翻译后修饰(PTM s),运用免疫接种法产生能识别硫化酪氨酸抗体的方法不可行。
JohnW.Kehoe等运用丝状噬菌体展示筛选出特异识别(PT M s)的Sc FV片段,为了解酪氨酸硫化在蛋白质与蛋白质相互作用上提供了更可行的方法[2]。
另外噬菌体展示肽库是一种用来决定蛋白酶共有基序(作用底物)的有效方法。
已经成功地运用于间质金属蛋白酶11(MM P11)、人腺体激肽释放酶2(hk2)、鼠肥大细胞蛋白酶(r M CP-5)、革兰阴性菌外膜蛋白酶T(OmpT)[3]等酶的作用底物和动力学分析。
H ills R[4]等在噬菌体肽库上筛选出含7个氨基酸的基序,该基序能特异性识别ADAMTS-4(带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整连蛋白金属蛋白酶),并且发现m atr ilin-3是ADAMTS-4的新的作用底物。
2.2抗体和疫苗的制备噬菌体抗体库是由噬菌体展示技术发展而形成的重要分支。
噬菌体抗体库的构建过程是用通用引物从免疫或未免疫的机体扩增抗体全套可变区基因(抗体可变区的重链和轻链基因),并将这些基因分别克隆到噬菌体载体中通过与噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白,把Fab或ScFv表达在噬菌体表面,组成噬菌体抗体库,库中每一个噬菌体在其表面可表达一种特异性抗体(Fab或ScFv)。
由于噬菌体抗体库能够模拟天然抗体库,得到机体正常状态下不易产生的自身抗体,抗体工程菌比杂交瘤细胞更适应于大规模工业化生产等优势,噬菌体展示技术已被广泛地运用于抗体的制备。
国内最成功的运用是在病毒性肝炎的诊治方面。
有人利用纯化的重组肝炎病毒蛋白作为固相化基质支持物,对于半合成的人源化sc Fv文库进行筛选,获得了乙型肝炎病毒(H B V)、丙型肝炎病毒(H CV)、戊型肝炎病毒(H E V)等的各种抗原的人源化sc Fv,这些肝炎病毒scFv具有重要的应用前景[5]。
