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新技术在毒理学中的应用08级食品质量与安全（3）班戴黛08118065摘要：近20年来，毒理学领域发生前所未有的巨大进展，而这些进展的取得，在很大程度上得益于科学新思想的渗透和新技术的应用。
特别是细胞生物学和分子生物学理论和技术的飞速发展，给毒理学研究提供了新的思维和研究工具，改变了毒理学研究的基本格局，使毒理学研究从经典的整体器官水平向细胞和分子水平飞跃。
纵观近年来毒理学的发展历程，一些常用的分子生物学技术，如PCR技术、核酸杂交技术、DNA测序技术以及一系列突变检测技术已广泛应用于外源化合物和环境致癌物引起的DNA损伤、基因突变、加合物形成及癌基因和抑癌基因研究等方面。
特别是近年来基因差异分析技术、转基因技术、基因芯片技术等分子生物学新技术的建立和引入，大大提高了毒理学研究的整体水平。
关键字：毒理学细胞生物学分子生物学正文：“民以食为天”，饮食是人类社会生存发展的第一需要。
现在，人们已经把食品的安全性作为食用的重要原则和取舍标准。
可是，近年来，因为食品污染造成的急性食物中毒事件越来越多，随着食品的数量和种类日益丰富，如何提高食品的质量和安全性已经成为了社会公众普遍关注的问题。
毒理学就是研究外源化合物对生命机体损伤作用及机制的一门科学。
所谓外源化合物是指存在于人类生活的外界环境中，可能与机体接触并进入机体，在体内呈现一定生物学作用的化学物质。
主要有人类在食品生产、加工中使用的物质和食物本身生长中存在的物质。
外环境中的多种有害因子，包括物理因子、化学因子和生物因子等，通过不同途径作用于机体，引起机体的器官组织结构和功能的改变，而这些改变都是要通过细胞结构与功能的变化反映出来的。
因此，细胞毒理学研究是用细胞进行毒理学研究，应用体外培养模型对环境有害因子进行检测，评价其对人体可能产生的危害。
分子生物学水平上毒理学则是在毒理学发展过程中，受到分子生物学理论和技术促进而发展起来的，从分子水平上研究外源化合物与生物机体相互作用的一门学科。
《毒理学实验》课程大纲《毒理学实验》课程大纲课程代码：课程学分：2课程总学时：28适用专业：生物科学专业一、课程概述1．课程性质毒理学是利用医学实验动物学、分子生物学、遗传学、免疫学、细胞学以及病理学等相关学科的技术，从预防医学的角度，研究人类生产和生活活动中可能接触的外源化学物对机体的生物学作用，特别是损害作用及其机理，为制定防治措施和制定使用标准提供科学依据，并做出安全性评价、为科学管理提供指导的一门应用科学。
2．课程背景在环境污染和环境安全问题日趋严重的今天，毒理学已经也应该作为一门人类的生存常识课程开设了。
外源化学物几乎在时时刻刻、方方面面威胁、损害着我们的身体。
尽早尽快地了解毒理学知识，是认识、预防、治疗外源化学物损伤的前提，是做好管理和正确使用的基础，是保证环境安全和食品安全的必要条件。
3．课程价值通过本课程的学习，可使学生了解身边的有害物质及其对人体的危害方式，掌握毒理学的基础理论、基本知识和基本技能，初步熟悉毒理学的原理，概念和应用，并对毒理学的国内外新成就和发展有所了解，为学生预防身边有害物质的侵害提供方法，为政府制定防治措施和制定使用标准提供科学依据，为进一步学习有关学科打下毒理学的基础。
二、设计理念与开发思路1．设计理念毒理学是研究人类生产和生活活动中可能接触的外源化学物对人体的损害作用及其机理的科学。
本课程是为保护人类健康而设计，它可以为预防和治疗现代频发高发的人类疾病提供基本的思路和方法。
2．开发思路面向全体学生,注重素质教育；整体设计目标,体现灵活开放；突出学生主体,尊重个体差异；倡导目标驱动,强调体验实践；注重过程评价,促进学生发展；开发课程资源,拓展学用渠道。
三、课程目标（一）课程的总体目标为获得保护自己、他人乃至全人类的健康的知识和技能的需要和进一步增强和增加保护环境的意识和行动而使学生较全面地理解和掌握毒理学基本概念、基本原理和基本技能。
在学习过程中注重培养学生热爱生命、保护环境的道德理念，使学生能够认清潜伏在我们身边环境中、甚至日常生活和每天饮食中能经常伤害到我们身体的有毒有害物质，培养学生增强自我保护同时也珍爱他人，免受身边有毒有害物质伤害的能力，并注意引导和培养学生学会使用自学大纲、教科书和教学参考书，不断提高学生的动手能力、自学能力、语言表达能力和创新意识。
第十二章体外试验与生物新技术在毒理学中的应用第一节体外试验毒性试验的目的在于获取一定的数据，为社会需要的外源化学物的安全使用做出判断。
过去利用整体实验动物模型或称体内试验(in vivo test)模型所提供的资料，判断外源化学物及其制品和混合物等对人类健康是否具有损害作用。
体外试验模型(in vitro test)在上述过程中也起着重要的作用，尤其是机理研究方面。
但是，在毒理学研究中整体试验研究的观点仍占主导地位。
目前，此种观点已发生变化，因为：①全世界每年约有千种以上的新化合物作为商品进入人类的环境。
而且在现有的化合物中，还有相当数量没有进行必要的毒理学评价。
在此种情况下，利用经典的整体动物试验取得完整的毒理学资料极为困难。
解决此种问题的重要方向是体外试验。
②现有的整体动物毒性试验方法需消耗大量的时间和昂贵的经费，而体外试验则可节省时间和经费。
③动物保护主义运动的兴起，要求尽量减少动物的使用，而且应当尽量减少痛苦地处理动物。
④更重要的是由于生物技术的巨大进步，不仅表现在细胞组织及器官培养领域，而且在生物分子技术方面，也为毒性试验和研究提供了新的方法和工具。
所以体外试验在毒理学研究中所占的地位日趋重要，甚至有占主导地位的趋势。
但也需指出，体外试验的发展，并不排斥体内试验本身的重要性，两者必须相互补充、相互验证才能为毒理学研究提供坚实的科学基础。
一、概述(一) 分类毒性试验的目的是提供一些适当的资料，以便确定有关化学物的毒理学性质。
在有些情况下，是要决定一种化学物在所预期的条件下使用是否安全，如新药物开发即需要这一评价。
在有些情况下，例如新工业品或日用化学品的开发，必须决定一种新化学物的接触安全限量。
了解体外毒性试验在上述毒理学决策过程中有何意义，对于评价体外毒性试验在毒理学中的地位极有帮助。
可依据体外试验在决策过程中所起的作用将其分为3类：①筛选试验。
它仅提供决策过程的最初的资料，还需要进行更权威的试验，无论是整体还是体外试验。
第八章毒理学评价的分子生物学方法分子毒理学固然应主要着眼于生物大分子，但也应当看到这些大分子是存在于细胞膜上、细胞器内，乃至细胞间隙液中的。
它们与细胞是不可分离的。
因此，对亚细胞组分的研究也是毒理学分子生物学评价的重要组成部分。
第一节亚细胞组分的制备现代毒理学中使用最多的亚细胞组分是细胞膜、微粒体及线粒体。
现就细胞膜、微粒体及线粒体的制备方法加以介绍。
一、细胞膜的制备细胞膜指细胞外层质膜，厚度约6～10nm。
它将细胞与外环境分隔，且参与细胞的生命活动，细胞内各种细胞器也是由质膜分隔，称为细胞器膜，两者统称为生物膜。
它是常用的研究模型，用以从细胞和亚细胞水平研究外源化合物的中毒机制。
1．肝细胞膜的制备其基本原理是：首先，将肝组织在含有钙离子的低渗碳酸氢钠缓冲液中温和匀浆，使细胞膜保持较大的膜片；其次，应用低速离心使细胞膜片与细胞核一起从匀浆中分离，再利用细胞膜与细胞核之间的密度差异，用密度梯度离心将细胞膜从低速离心获得的粗核部分中分离出来。
2．红细胞膜的制备哺乳动物红细胞不含任何细胞器，故其红细胞膜是较纯净的细胞膜。
(1)红细胞血影膜常用的制备方法是在低渗条件下，红细胞膨胀，由双面盘状变成近乎球形，随后细胞内容物因胞膜破裂而释放，20 000g离心。
洗涤去除血红蛋白，即获红细胞膜。
此种膜最接近整体系统，仍保留着原有膜的生物化学和生物物理学等特性，毒理学试验常用简易模型研究外源化合物对细胞膜离子转运及相关酶类、膜脂流动性和细胞骨架结构等方面的影响，并探讨其可能的机制。
但它不能控制细胞质内的环境，在应用上有一定的局限性。
此外，低渗制备的红细胞膜虽然去除了细胞内质，但膜的封闭性差，有许多泄漏的空穴。
(2)再封血影近年发现，在一定条件下，胀破了的红细胞可以重新封闭，对K’等离子不通透，给研究红细胞膜提供了另一模式。
其制备的方法有：①向低渗胀破的红细胞加入浓盐溶液，成为等渗溶液，置于37℃温育20min，期间可缓慢地搅拌，即得一定比例的再封血影。
毒理学研究中的体外测试方法与技术引言：毒理学是研究化学物质或其他因素对生物体产生有害作用的科学，对于保护人类和环境健康具有重要意义。
在毒理学研究中，体外测试方法和技术被广泛应用，以评估各种化学物质的毒性，并为毒理学研究提供基础数据。
本文将介绍几种常用的体外测试方法和技术，并探讨其在毒理学研究中的应用。
细胞毒性测试：细胞毒性测试是体外毒性研究的重要手段之一。
通过检测化学物质对细胞的损伤程度，可以评估该化学物质的毒性。
常用的细胞毒性测试方法包括MTT法、细胞膜通透性测定法和细胞凋亡测定法。
MTT法可以评估细胞存活情况。
通过将细胞与化合物共同培养一段时间后，加入MTT试剂，可观察细胞的颜色变化。
颜色越深，细胞存活率越高。
这种方法简便易行，广泛应用于细胞毒性测试中。
细胞膜通透性测定法用来检测化合物对细胞膜的破坏程度。
通过测定细胞培养液中释放出的细胞内物质来判断细胞膜的完整性，进而评估化学物质的毒性。
这种方法操作简单，结果直观，可用于快速筛选化学物质的毒性。
细胞凋亡测定法是一种用于检测化学物质对细胞凋亡的影响。
细胞凋亡是细胞的一种正常死亡方式，与细胞毒性密切相关。
通过染色方法或流式细胞仪等技术，可以观察到细胞的凋亡状态，进而评估化学物质的毒性。
仿体毒性测试：仿体毒性测试是一种利用体外建立的人工模型来评估化学物质毒性的方法。
常见的仿体毒性测试方法包括鱼类胚胎毒性测试、人类肝细胞S9分数代谢活性测定和培养皮肤刺激性测试。
鱼类胚胎毒性测试是一种通过观察化学物质对鱼类胚胎发育的影响来评估毒性的方法。
这种方法操作简单，节约时间和成本，并且可以模拟人类对化学物质的响应。
人类肝细胞S9分数代谢活性测定是一种用来评估化学物质代谢活性的方法。
通过使用人类肝细胞S9分数提取物来模拟体内药物代谢过程，并测定草酸和特定底物之间的反应速率，可以推测该化学物质的代谢能力和毒性。
培养皮肤刺激性测试用于评估化学物质对皮肤的刺激性。
通过将化学物质与培养皮肤模型接触一段时间后，观察皮肤的变化，可以评估化学物质对皮肤的刺激性。
毒理学实验（实习）教学大纲（公共卫生实验技术-1)一、课程基本信息课程名称（中、英文）：毒理学实验Toxicologic experiment课程号（代码）：504032010课程类别：专业课，必修课学时：16学时（预防医学专业）二、教学目的及要求毒理学研究外源化合物对于机体（特别是人体）的有害作用及其机制。
毒理学作为一门实验科学是以动物实验为中心的，其研究的主要手段是动物实验，通过外源化合物对实验动物的毒性反应，向人外推，以期评估外源化合物对人的危害及危险性。
故毒理学实习要求在掌握毒理学的基本概念、基本理论的基础上，熟悉和掌握一些基础的毒理学动物实验的设计、实施、结果观察和评价等毒理学研究的基本功。
三、教学内容双线部分应重点掌握，单线部分应熟悉，其它部分应有所了解。
毒理学实习教学大纲实习一染毒方法和实验动物目的要求1.了解大小鼠习性，了解动物饲养和动物房环境的基本要求。
2.了解染毒的各种方法，掌握大小鼠灌胃方法，熟悉家兔皮肤染毒方法。
3.掌握大小鼠的正常解剖，及脏器系数的计算。
实习内容一、观看视听教材《动物实验基本操作技术》。
二、常用实验动物的习性及选择：大鼠、小鼠。
三、动物饲养与动物房：动物的管理：动物、人员和动物房；环境条件的控制：温湿度、光照、噪音、垫料，群体密度和空间限制、笼具及饲料；实验动物设施的分类：开放系统、屏蔽系统和隔离系统。
四、常用染毒方法：经呼吸道染毒、经消化道染毒（灌胃）、经皮肤及黏膜染毒和其它染毒方式五、动物处死方法：颈椎脱臼法、断头法、电击法、空气栓塞法、急性失血法等六、示教内容：1、皮肤染毒示教，对比化学脱毛法和机械剪毛法对实验结果的影响。
2、动物的捉拿和固定。
3、大鼠灌胃及解剖，脏器系数的计算及其意义。
七、学生实习：小鼠灌胃练习及解剖八、实习报告：目的要求、方法、结果、讨论实习二急性经口毒性试验目的要求1.掌握实验动物随机区组法。
2.熟悉、掌握霍恩氏法测定LD50方法及特点。
毒理学实验技术总结毒理学作为一门研究外源性化学物质对生物体损害作用的学科，其实验技术对于评估化学物质的毒性、安全性以及制定相关法规和标准具有至关重要的意义。
本文将对常见的毒理学实验技术进行总结，以期为相关研究和实践提供参考。
一、急性毒性实验急性毒性实验是测定化学物质在短时间内（通常 24 小时至 2 周）对实验动物造成的损害效应。
实验动物一般选用大鼠、小鼠等，通过经口、经皮、吸入等途径给予一定剂量的受试物，观察动物的中毒症状、死亡情况等，并计算出半数致死剂量（LD50）或半数致死浓度（LC50）。
急性毒性实验能够快速初步了解受试物的毒性强度，为后续的慢性毒性实验和风险评估提供基础数据。
二、慢性毒性实验慢性毒性实验是观察化学物质长期低剂量暴露对实验动物产生的毒性作用。
实验周期通常在数月至数年，实验动物持续接触受试物，监测动物的生长发育、生理生化指标、组织病理学变化等。
慢性毒性实验可以揭示受试物的潜在慢性危害，如致癌性、致畸性、致突变性等，对于评估化学物质的长期安全性具有重要意义。
三、遗传毒性实验遗传毒性实验用于检测化学物质对生物体遗传物质的损伤作用，包括基因突变、染色体畸变和 DNA 损伤等。
常见的实验方法有 Ames 试验、微核试验、染色体畸变分析等。
Ames 试验通过检测受试物对细菌基因突变的诱导作用来评估其遗传毒性；微核试验观察细胞中微核的形成情况，反映染色体损伤；染色体畸变分析则直接观察染色体的结构和数目异常。
遗传毒性实验有助于早期发现化学物质的潜在致癌和致畸风险。
四、生殖毒性实验生殖毒性实验旨在研究化学物质对生殖系统的影响，包括对生殖细胞的损伤、性功能障碍、胚胎发育异常等。
实验分为雄性生殖毒性实验和雌性生殖毒性实验，可通过观察动物的生育能力、受孕率、胚胎发育情况等指标来评估受试物的生殖毒性。
这类实验对于保障人类生殖健康和繁衍具有重要意义。
五、致畸实验致畸实验主要用于检测化学物质在胚胎发育期间对胎儿造成的结构畸形。
第八章毒理学评价的分子生物学方法分子毒理学固然应主要着眼于生物大分子，但也应当看到这些大分子是存在于细胞膜上、细胞器内，乃至细胞间隙液中的。
它们与细胞是不可分离的。
因此，对亚细胞组分的研究也是毒理学分子生物学评价的重要组成部分。
第一节亚细胞组分的制备现代毒理学中使用最多的亚细胞组分是细胞膜、微粒体及线粒体。
现就细胞膜、微粒体及线粒体的制备方法加以介绍。
一、细胞膜的制备细胞膜指细胞外层质膜，厚度约6～10nm。
它将细胞与外环境分隔，且参与细胞的生命活动，细胞内各种细胞器也是由质膜分隔，称为细胞器膜，两者统称为生物膜。
它是常用的研究模型，用以从细胞和亚细胞水平研究外源化合物的中毒机制。
1．肝细胞膜的制备其基本原理是：首先，将肝组织在含有钙离子的低渗碳酸氢钠缓冲液中温和匀浆，使细胞膜保持较大的膜片；其次，应用低速离心使细胞膜片与细胞核一起从匀浆中分离，再利用细胞膜与细胞核之间的密度差异，用密度梯度离心将细胞膜从低速离心获得的粗核部分中分离出来。
2．红细胞膜的制备哺乳动物红细胞不含任何细胞器，故其红细胞膜是较纯净的细胞膜。
(1)红细胞血影膜常用的制备方法是在低渗条件下，红细胞膨胀，由双面盘状变成近乎球形，随后细胞内容物因胞膜破裂而释放，20 000g离心。
洗涤去除血红蛋白，即获红细胞膜。
此种膜最接近整体系统，仍保留着原有膜的生物化学和生物物理学等特性，毒理学试验常用简易模型研究外源化合物对细胞膜离子转运及相关酶类、膜脂流动性和细胞骨架结构等方面的影响，并探讨其可能的机制。
但它不能控制细胞质内的环境，在应用上有一定的局限性。
此外，低渗制备的红细胞膜虽然去除了细胞内质，但膜的封闭性差，有许多泄漏的空穴。
(2)再封血影近年发现，在一定条件下，胀破了的红细胞可以重新封闭，对K’等离子不通透，给研究红细胞膜提供了另一模式。
其制备的方法有：①向低渗胀破的红细胞加入浓盐溶液，成为等渗溶液，置于37℃温育20min，期间可缓慢地搅拌，即得一定比例的再封血影。
②将低渗胀破的红细胞在0℃条件下，过Bio—gel A柱，柱上部的1／3pH为7．6，以利膜与血红蛋白分离，其下的2／3pH为6．0，有利于随后红细胞空泡的重新封闭，当膜从柱上流出后再用一定浓度的Kcl调节为等渗液，在37℃温育1h，即获得重新封闭的血影。
(3)封闭的红细胞膜囊泡有时为了深入研究，需要将膜的内、外层翻过来。
红细胞溶血后，在不含一价离子的碱性低离子强度介质中，膜能自发地凹陷(无Mg“存在)或外凸(有Mg“存在)，形成小囊泡，通过实验可制备封闭的红胞膜囊泡。
其特点是不受胞浆内容物的干扰，可采用匀浆，等密度梯度离心或屏障分离等技术制备胞浆面在外的翻转泡(其内、外层正好与血影膜相反)或胞浆面仍在内的正转泡(即与红细胞膜内外侧相同的囊泡)。
3．脂质体的制备脂质体是双层脂质包围一些水溶液的小滴，呈球形。
它是最常用的人工膜之一，是较为理想的生物膜模拟系统。
大脂质体制备可将适量的磷脂溶于氯仿等有机溶剂，置于旋转蒸发仪上蒸发至干，使玻璃壁上附有一层极薄的磷脂膜，然后加水溶液，并振摇，即可形成多层大脂质体。
用超声波法和微量注射法、去垢剂法可获得单层脂质体。
4．突触体膜的制备制备突触体膜的基本原理是将脑组织在预冷的蔗糖溶液中进行匀浆，再利用脑突触体膜的蛋白质与脂的比例、电荷性质、颗粒大小、形状等不同于其他的细胞器膜进行蔗糖密度梯度离心，将其分离出来。
二、微粒体的制备微粒体是内质网在细胞匀浆过程中形成的碎片，并非独立的细胞器。
由于微粒体含有代谢外源化合物的混合功能氧化酶，在毒理学研究中有着重要地位，是较常见的试验模型。
制备肝微粒体的方法有超速离心法、钙沉淀法、凝胶过滤法及等电点沉淀法。
基本步骤为：将肝组织匀浆后，2500g离心；弃去沉淀(主要是细胞核及碎片)，取上清液9000g离心；弃去沉淀(主要是线粒体)，取上清液，100 000g离心，得到的沉淀即为线粒体，上清液为胞浆。
所得微粒体用缓冲液悬浮后，贮存在一20～一70℃冰箱中。
除超速离心法制备微粒体外，用凝胶过滤、钙沉淀法和等电点沉淀法也可以制得微粒体。
三、线粒体的制备1．肝脏线粒体的制备所有操作应在低温条件下进行。
全部器械如匀浆器、烧杯、离心管等，以及缓冲液应放4℃冰箱内预冷。
2．亚线粒体颗粒的制备亚线粒体颗粒是指经特殊处理，除去线粒体外膜和基质部分后形成的小囊泡。
它含有氧化磷酸化过程所有的酶类，是观察呼吸链氧化反应、ATP酶活性及其他一些特殊反应的模型。
亚线粒体颗粒制备的原理是利用超声波作用，破坏线粒体外膜，再经超速离心获得仅有内膜的亚线粒体颗粒。
在超声处理过程中应注意保持线粒体制备物温度，不要升高，维持在4℃以下。
第二节核酸的提取与制备核酸的提取是分子生物学中很重要的基本实验技术，也是其他分子生物学分析方法的前提条件。
核酸样品的提取质量将直接关系到有关分析检测的成败。
分离纯化核酸总的原则是应保证核酸一级结构的完整性及排除其他分子的污染。
为了保证孩酸结构与功能的研究，完整的一级结构是最基本的要求，因为遗传信息全部贮存在一级结构之内。
核酸的一级结构还决定着其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。
经纯化的核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子，其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度，此外还要排除其他核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA分子，反之亦然。
为了保证分离核酸的完整性和纯度，在实验过程中应注意：①尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏。
②减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在DH4～10的条件下进行。
③减少物理因素对核酸的降解。
物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。
机械剪切力包括强力高速的溶液震荡、搅拌，使溶液快速地通过狭长的孔道，细胞突然置于低渗液中，细胞爆炸式的破裂以及DNA样品的反复冻贮。
机械剪切作用的主要危害对象是对分子质量大的线性DNA分子，如真核细胞的染色体DNA。
对分子质量小的环状DNA分子，如质粒DNA及RNA分子，威胁相对小一些。
高温，如长时间的煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的有些化学键也有破坏作用。
核酸提取过程中，常规操作温度为0～4℃，此温度环境可降低核酸酶的活性与反应速率，减少对核酸的生物降解。
④防止核酸的生物降解。
细胞内或外来的各种核酸酶消化核酸链中的磷酸二酯键，直接破环核酸的一级结构。
其中DNA酶需要金属二价离子Mg“，ca“的激活，使用金属二价离子螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸盐基本上可以抑制DNA酶的活性。
而RNA 酶不但分布广泛、吸易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱、不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害习素。
总的来说，核酸提取的主要步骤就是破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质，纯化核酸等。
核酸提取的方案，应根据具体生物材料和待提取的核酸分子的特点而定。
一、DNA的提取与制备从细胞中提取DNA要用尽可能温和的细胞破碎法，以免DNA被机械破碎。
操作时还需要有EDTA的存在，以螯合镁离子，镁离子是DNA酶降解DNA所必需的。
如果有细胞壁，要用酶进行消除，如用溶菌酶处理细菌，对于细胞膜要用去污剂溶解。
对于不同来源的细胞、组织应使用不同的裂解液，如果必须使用物理破碎，一定要尽可能地轻缓。
细胞破碎以及其后的操作都要在4cIC条件下进行，所用的玻璃器皿和溶液都要经过高压灭菌以破坏DNA酶。
上述方法只适用于细胞总DNA的提取。
不同来源的样品，处理时有不同的注意事项。
对于新鲜动物组织脏器等提取材料，由于含有较丰富的DNA酶，应迅速冷冻保存备用，以减少DNA的降解；石蜡包埋组织块中DNA应先进行脱蜡处理；培养细胞裂解之前应用相应的缓冲液进行洗涤；质粒DNA提取之前先要经过细菌培养，获得对数生长后期的细胞后进行离心集菌收集，再通过碱性裂解法、去污剂法或煮沸法等进行提取，纯化过程也可使用酚／氯仿萃取法，对于小分子DNA(小于10kb)，可用涡旋混合器以保证溶液中有机相与水相混合均匀，当纯化DNA分子介于10～30kb时，应轻微振荡，避免DNA被机械剪切，小于30kh的DNA分子纯化时应更小心。
二、RNA提取与制备RNA提取技术与上述DNA提取技术相似。
由于RNA分子相对较短，不易被剪切力损伤，因此细胞破碎可以用较强有力的方法。
RNA对RNA酶敏感，而RNA酶在自然界广泛存在，不仅各种细胞内都有RNA酶，操作者的手指上也有RNA酶，因此操作者必须带手套，并且提取液中要有较强的去污剂存在，以便快速灭活RNA酶。
接下来的去蛋白操作须特别强有力，因为RNA常常和蛋白质紧密结合在一起。
用DNA酶去除DNA，用乙醇沉淀RNA。
RNA提取要用硫氰酸胍．它既是较强的RNA酶抑制剂，又是蛋白变性剂。
制备RNA时所用物品应完全无RNA酶。
第三节基因突变分析与PCR检测一、基因突变分析基因突变(gene mutation)包括碱基置换、移码突变和片段突变(参见第五章第二节)。
基因突变是分子水平的变化，在光学显微镜下无法看见，一般是以表型(如生长、生化、形态等)的改乏为基础进行检测的，也可通过DNA测序、DNA单链构象多态分析(sscP)、基因差异分析及基因芯片检测等分子生物学方法检测DNA序列的改变来确定。
1．PCR—SSCP技术聚合酶链反应——单链构象多态性分析在能够检测单个碱基变化的技术中，单链构象多态性分析因其简单而有效已成为最常用的技术。
(1)PCR—SSCP的基本原理PCR～SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA 单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。
首先PCR扩增特定靶序列，然后将扩增产物变性为单链，在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中电泳。
此时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。
在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。
这种构象由DNA 单链的碱基顺序决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用(主要为氢键)来维持。
相同长度的DNA单链，其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。
靶DNA中如含单碱基置换或数个碱基插入、缺失等改变时因迁移率变化会出现泳动变位(mobility shift)，从而可将发生突变的DNA与正常DNA区分开。
经典的PCR—SSCP技术采用放射性同位素标记引物或核苷，再通过放射性自显影显示结果。
但由于放射性同位素的污染及半衰期的问题，限制其推广应用。
