下载文档原格式
糖基转移酶合成相关糖苷类化合物研究进展赵千婧;程瑶;王佳;孙新晓;申晓林;袁其朋【摘要】许多天然产物是中药中的活性成份,拥有良好的药理活性.通过糖基化反应后形成的糖苷类化合物可以提高天然产物的稳定性、水溶性和生物利用度,因而受到越来越多的关注.糖苷类化合物一般通过化学合成和植物提取的方式获得,近年来利用糖基转移酶合成糖苷类化合物成为了一个研究热点.糖基转移酶是通过天然产物合成糖苷类化合物的关键酶,作为一类庞大的基因家族酶,通常来源于植物和微生物.本文将阐述利用糖基转移酶合成糖苷类化合物的研究进展,为糖基转移酶合成糖苷类化合物工业化提供参考和方向.【期刊名称】《北京化工大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(045)005【总页数】8页(P92-99)【关键词】糖苷类化合物;糖基转移酶;天然产物;糖基化反应【作者】赵千婧;程瑶;王佳;孙新晓;申晓林;袁其朋【作者单位】北京化工大学化工资源有效利用国家重点实验室,北京 100029;北京化工大学化工资源有效利用国家重点实验室,北京 100029;北京化工大学化工资源有效利用国家重点实验室,北京 100029;北京化工大学化工资源有效利用国家重点实验室,北京 100029;北京化工大学化工资源有效利用国家重点实验室,北京100029;北京化工大学化工资源有效利用国家重点实验室,北京 100029【正文语种】中文【中图分类】Q812引言天然产物，特别是植物的次级代谢产物，由于具有抗疟疾、抗凝血、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老和消炎等一系列生物活性，常被用于药品、营养品和化妆品等的生产[1-4]。
在中草药中，存在许多具有良好药理活性的天然产物，如红豆杉中的紫杉醇[5]，黄花蒿茎叶中的青蒿素[6]和红景天中的红景天苷[7]。
然而，纯天然产物实际的人体利用效果并不显著，主要原因是天然产物特殊的化学结构使其稳定性、水溶性不高，进而导致生物利用率较低。
为了有效解决这一问题，目前多利用糖基化、甲基化、羟基化和异戊烯化反应来提高天然产物结构的复杂性和多样性。
多糖的化学修饰及抗氧化性变化的研究进展王世越，柯钦豪，周宏福，郑敏*（湖北科技学院，湖北咸宁437100）摘要：多糖是一类广泛存在于自然界的天然大分子物质，包含抗氧化性在内的多种生物活性。
多糖生物活性与其结构密切相关，通过改变多糖的结构和抗氧化性，对研究多糖的构效关系具有重要意义。
本文通过 概述常用的化学修饰方法,综述了各种化学修饰的原理、操作方法以及对抗氧化性的影响，为多糖类药物的进 一步研究提供依据。
关键词：多糖;化学修饰;抗氧化性中图分类号:0629.12文献标识码:A文章编号：2095-4646（2021）02-0170-04开放科学（资源服务）标识码（OSID）:DOI：10.16751/ki.20954646.2021.02.0170多糖是一类广泛存在于自然界的天然大分子物质,至今大量学者已通过实验证实多糖具有良好的抗氧化活性、抗肿瘤活性、抗病毒活性、免疫活性调节等生物活性⑴。
通过化学手段对天然多糖进行定向的结构修饰，可以增强多糖生物活性。
多糖的结构修饰可以通过化学、生物、物理方法进行实现，目前应用最广的为化学方法。
化学修饰可通过改变多糖的分子量以及取代基种类、位置、数目，以实现改变多糖的生物活性⑵。
目前，对多糖进行化学修饰的化学方法主要为与金属离子络合、硫酸化、磺酰化、乙酰化、烷基化、硒化、竣甲基化、磷酸化、苯甲酰化等。
本文将对以上方法的原理、操作及产物的抗氧化性等方面进行综述。
1与金属离子络合多糖的金属络合物是当前天然产物研究领域的热门方向，主要的研究热点集中于与钙、铁、铜等金属离子络合物研究。
多糖与金属离子络合的常见方法是将多糖调配为适当浓度溶液，加入NaOH溶液调节pH（制备多糖铁的配合物需在多糖溶液中先加入N^COs和柠檬酸钠），再加入提供相应配位离子的化合物,水浴加热数小时后即可得到相应的金属配合物⑶。
王元凤等⑶使用粗老绿茶多糖ATPS制得多糖的钙、铁络合物:ATPS-Ca（H）、ATPS-Fe（皿）,发现茶多糖与两种离子的配位方式不同和配位能力的大小不同:ATPS-Ca（H）清除自由基的能力相比于ATPS减弱,ATPS-Fe（皿）清除自由基的能力与ATPS相近。
糖基化修饰对生物分子功能的影响研究糖基化修饰是指将糖基分子与其他生物分子（如蛋白质、脂质、核酸等）结合形成新的复合物，从而改变其结构和性质的化学修饰过程。
在生物体内，糖基化修饰是一种广泛发生的生物过程，对生物体的生长、发育、免疫、代谢等方面具有重要作用。
本文就糖基化修饰对生物分子功能的影响进行了简要介绍和探讨。
1. 糖基化修饰对蛋白质的影响蛋白质是细胞内最为关键的功能分子之一，其结构和生物活性通常受到糖基化修饰的影响。
在蛋白质糖基化修饰中，糖基分子可以与蛋白质上的氨基酸残基发生糖基化反应（如N-糖基化、O-糖基化等），也可以与蛋白质上的糖基分子发生相互作用（如糖蛋白、糖肽等）。
一般来说，蛋白质糖基化修饰能够调节蛋白质的生物活性、稳定性、亲水性和溶解度等性质，同时也可以调节蛋白质与其他生物分子的相互作用。
例如，蛋白质的糖基化修饰可以改变其抗体识别的特性，影响免疫介导的过程；在神经细胞的分化和生长发育中，N-糖基化修饰也被证明是必须的。
一般来说，蛋白质糖基化修饰在生物体内的作用是多样的，需要进一步进行深入研究。
2. 糖基化修饰对脂质的影响脂质是生物体内最丰富的有机物之一，是细胞膜组成的主要成分之一。
随着对脂质代谢和功能的研究，越来越多的证据表明，脂质也能够通过糖基化修饰影响其功能。
例如，脂质N-糖基化可以影响其在细胞膜内的转运和信号传导，同时也可以影响脂质代谢和酶的活性等方面。
总体来说，已经有多项研究表明，糖基化修饰在脂质代谢和功能中的作用值得进一步研究。
3. 糖基化修饰对核酸的影响核酸是生物体内的两种核酸（DNA和RNA）的总称，是信息传递的载体，对生物体的生长、发育和遗传特性等方面具有极为重要的作用。
最近的研究证明，核酸上的糖基化修饰也能够影响其结构和功能。
例如，RNA的糖基化修饰已经被证明能够影响RNA的稳定性、转录抑制和翻译反应等方面；DNA上的糖基化修饰则会影响DNA复制和修复、真核生物的基因表达和底物识别等等。
花青素糖基化、甲基化修饰的研究现状一、概述花青素是一种广泛存在于植物中的天然色素，具有丰富的生物活性和抗氧化作用。
近年来花青素的研究引起了科学家们的高度关注，特别是在糖基化和甲基化修饰方面取得了显著的进展。
本文将对花青素糖基化和甲基化修饰的研究现状进行综述，以期为花青素的功能性研究提供理论依据和实验指导。
糖基化是生物体内蛋白质和多肽的重要修饰方式，通过与糖分子结合，可以影响蛋白质的结构、功能和稳定性。
花青素作为一种天然色素，其结构和功能与其糖基化修饰密切相关。
研究表明花青素的糖基化修饰主要包括羟基化、酰基化、酰胺化等类型，这些修饰方式会影响花青素的抗氧化活性、细胞信号传导途径以及生物学功能。
此外花青素的糖基化修饰还受到多种酶的影响，如糖基转移酶、磷酸化酶等，这些酶的调控对于花青素的糖基化修饰具有重要意义。
甲基化是生物体内DNA的一种重要修饰方式，通过添加甲基基团(CH,可以改变DNA的碱基序列和结构。
甲基化的DNA可以影响基因的表达水平、转录后修饰等生物学过程。
近年来研究发现花青素也可以通过甲基化修饰影响基因的表达，从而调控花青素相关的生物学功能。
例如花青素甲基化修饰可以影响植物对环境胁迫的反应，提高植物的抗逆性和适应性。
此外花青素甲基化修饰还可以影响植物生长发育、开花时间等生理过程。
花青素糖基化和甲基化修饰的研究现状为深入了解花青素的功能机制提供了重要的理论基础和实验依据。
随着研究的不断深入，相信未来会有更多关于花青素糖基化和甲基化修饰的新发现和技术应用。
1. 背景介绍：花青素是一种天然的色素，具有多种生物活性和保健功能花青素(Anthocyanin)是一类广泛存在于植物中的水溶性色素，包括红、蓝、紫等颜色。
它们在自然界中分布广泛，如水果、蔬菜、茶叶、葡萄酒等。
花青素不仅具有美丽的颜色，还具有多种生物活性和保健功能，因此受到了广泛关注。
近年来花青素的研究已经成为了生命科学领域的热点之一。
花青素的主要存在形式是糖苷配基，这些配基可以与蛋白质、多糖等大分子结合。
天然多糖是构成生命的四大基本物质之一，同时具备抗肿瘤、抗氧化、促进免疫调节、抗病毒、抗炎等生物活性，但由于多糖的活性直接受结构的影响，例如水溶性差或因活性较弱而难以达到应用要求。
因此需要对天然多糖进行结构修饰，增强其生物活性[1]。
多糖结构修饰可以通过化学、物理及生物学方法，目前应用范围最广的为化学修饰方法。
多糖的化学修饰方法主要有硫酸化、乙酰化、羧甲基化、磷酸化、硒化等。
本文对多糖化学修饰方法具体操作及产物活性变化等方面进行综述，为多糖类产品开发提供参考和借鉴。
1硫酸化修饰日本学者[2]于1988年成功将硫酸基团引入部分均多糖后发现产物表现出抗T-淋巴细胞病毒活性，为多糖的硫酸化结构修饰奠定了理论基础。
常见的硫酸化修饰方法有氯磺酸-吡啶法、浓硫酸法、氨基磺酸法等。
1.1氯磺酸-吡啶法氯磺酸-吡啶法是针对吡喃型多糖的一种硫酸化修饰方法，使氯磺酸与吡啶预先反应生成吡啶———SO32-复合物，碱性条件下以SO3取代糖羟基上的H，得到产物[3]。
在柴胡多糖[4]硫酸化修饰过程中，调节氯磺酸与吡啶的体积比分别为1∶2、1∶4和1∶8，得到3种不同取代度和硫含量的柴胡多糖的硫酸酯。
张琳[5]采用氯磺酸－吡啶法，制得款冬花硫酸酯化多糖，显著提高了清除羟自由基的能力。
刘捷优化了皱木瓜多糖硫酸酯的工艺，经Sephadex G-100凝胶色谱法分离纯化产物后，取代度为2.53，酯化产物具有更强的清除超氧阴离子自由基的能力。
1.2浓硫酸法浓硫酸法是用浓硫酸与正丁醇预先反应生成磺化试剂，冰浴条件下对多糖硫酸化。
向装有体积比为3∶1的浓硫酸和正丁醇试剂的三角瓶中缓慢加入硫酸铵（NH4）2SO4，持续搅拌后冰浴至0℃后，加入待修饰的多糖样品，持续反应一段时间后，体系用稀NaOH溶液中和、将上清液浓缩后，纯水透析24h，透析液经冷冻干燥后即得硫酸酯化产物[7]。
五味子叶多糖经硫酸化修饰后[8]，可得取代度为0.4597的产物。
黄酮类化合物的糖基化修饰
胥鑫萌;童天娇;刘伟;刘军海
【期刊名称】《皮革与化工》
【年(卷),期】2022(39)3
【摘要】黄酮类化合物结构复杂、溶解性低、稳定性差等缺陷对其进一步应用产生了阻碍,而糖基化修饰可有效调控其理化性质,进而扩大其在食品、药品等领域的需求。
综述了近年来黄酮类化合物糖基化修饰的研究进展,主要讨论了修饰以后修饰物生物活性的变化,分析了其中存在的问题,并提出了解决思路和今后的发展趋势,以期为黄酮类化合物在医学上的开发与应用提供理论参考。
【总页数】5页(P30-34)
【作者】胥鑫萌;童天娇;刘伟;刘军海
【作者单位】陕西理工大学化学与环境科学学院
【正文语种】中文
【中图分类】R284
【相关文献】
1.芦蒿秸秆黄酮类化合物对晚期蛋白质糖基化终末产物形成的抑制作用
2.黄酮类化合物的结构修饰及生物活性研究进展
3.黄酮类化合物结构修饰研究进展
4.黄酮类化合物的酶法去糖基化修饰研究
5.糖基化黄酮类化合物与肠道菌群的相互作用影响机体健康的研究进展
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
生物技术中的糖化修饰研究糖化修饰是生物技术中一项重要的研究领域，它涉及到生物分子的生化反应、糖类代谢、蛋白质结构、信号传递等多个方面。
糖化修饰因其广泛存在于生物分子中，可以被用来研究分子的结构和功能，同时也是疾病发生和治疗研究的关键过程之一。
本文将从糖化修饰的定义、研究方法和应用等角度来探讨生物技术中的糖化修饰研究。
一、糖化修饰的定义和分类糖化修饰是指糖类团与生物分子(如蛋白质、核酸、脂质等)的化学结合过程，通常是由糖辅酶类分子催化完成的。
根据糖类分子与生物分子的结合方式和位置不同，糖化修饰可以分为四类，分别是O-糖基化、N-糖基化、S-糖基化和C-糖基化。
其中，O-糖基化是最常见的一种修饰方式，其包括N-乙酰氨基半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸等糖基团。
N-糖基化是指糖基团与氨基酸的氨基结合，这种修饰方式常见于胞外蛋白质的修饰过程。
S-糖基化是指糖基团与半胱氨酸的硫基结合。
C-糖基化是指糖基团与胆固醇等脂质分子的结合。
二、糖化修饰的研究方法糖化修饰的研究方法主要包括质谱分析、核磁共振、分子生物学等多种技术手段。
其中，质谱分析是研究糖化修饰的常用手段之一，它可以快速准确地确定糖基团的类型和位置。
利用质谱分析技术，可以分析出糖基化蛋白质的完整分子量、哪些氨基酸被糖化等信息。
除质谱分析外，核磁共振技术也可以用来研究糖化修饰的结构与功能。
核磁共振技术可以定量分析糖基团的类型和位置，同时可以研究不同糖基团在生物分子中的3D结构和相互作用。
在分子生物学方面，可以利用分子克隆技术来制备大量的目的蛋白质，并进行糖化修饰相关的结构和功能研究。
三、糖化修饰在生物技术中的应用糖化修饰在生物技术中有着广泛的应用，主要体现在以下几个方面。
1. 蛋白质药物的研究和开发蛋白质药物是治疗癌症、糖尿病、风湿性关节炎等诸多疾病的重要药物之一，其开发与糖化修饰密切相关。
糖化修饰可以调节蛋白质分子的药代动力学、稳定性和免疫原性，从而提高药物的疗效和安全性。
蛋白质糖基化修饰在结直肠癌中的研究进展
刘晓凡;顾冬英
【期刊名称】《中国肿瘤临床》
【年(卷),期】2024(51)3
【摘要】结直肠癌作为中国最常见的恶性肿瘤之一,涉及多种复杂的病理生理过程。
随着糖组学的深入研究,揭露了蛋白质糖基化修饰与结直肠癌的发生、进展、转移
及多药耐药的密切关系,糖基化的改变作为重要的生物标志物,为早期诊断及干预治
疗提供了新的靶点。
本文综述了蛋白质糖基化修饰在结直肠癌中最新研究进展,希
望可以通过靶向相关糖基化修饰位点,改善患者预后及耐药性。
【总页数】5页(P133-137)
【作者】刘晓凡;顾冬英
【作者单位】南京医科大学附属南京医院
【正文语种】中文
【中图分类】R73
【相关文献】
1.结直肠癌组织中泛素化修饰蛋白的蛋白质组学分析
2.蛋白质糖基化修饰在自身免疫反应中的研究进展
3.蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰在妇科肿瘤中的研究进展
4.H3K36me3及其表观遗传修饰蛋白质SETD2和KDM4B在结直肠癌中的临床病理意义
5.组蛋白乳酸化修饰在结直肠癌发展中作用的研究进展
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
生物技术进展２０１９年㊀第９卷㊀第３期㊀２４６~２５２ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１进展评述Ｒｅｖｉｅｗｓ㊀收稿日期:２０１８￣１１￣１９ꎻ接受日期:２０１９￣０１￣２４㊀基金项目:安徽省教育厅质量工程项目(２０１６ＳＸＺＸ０２７ꎻ２０１６ＳＪＪＤ０５４)ꎻ亳州学院校企合作技术创新平台项目(２０１６ＸＱＺＸ０２)ꎻ亳州学院院级教学质量工程项目(２０１６ＳＦＺＸ０１ꎻ２０１６ＸＱＨＺ０２)ꎻ安徽省高等学校自然科学研究项目重点项目(ＫＪ２０１６Ａ４９０)ꎻ安徽省科技重大专项(180****1163)资助ꎮ㊀作者简介:张小倩ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为中药次生代谢调控机制研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:132****9796＠１６３.ｃｏｍꎮ∗通讯作者:安凤霞ꎬ副研究员ꎬ博士ꎬ研究方向为药用植物组织培养及其次生代谢调控机制研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ａｎ＿ｆｅｎｇｘｉａ＠１６３.ｃｏｍꎮ蛋白Ｎ￣糖基化分析方法研究进展张小倩ꎬ㊀张腾腾ꎬ㊀闫㊀攀ꎬ㊀杨毕超ꎬ㊀安凤霞∗亳州学院中药学院ꎬ安徽亳州２３６８００摘㊀要:糖基化是真核细胞最常见的蛋白转译后修饰方式之一ꎬＮ￣糖基化作为糖蛋白中最主要的糖基化类型ꎬ在许多生命活动中起重要作用ꎬ对糖蛋白Ｎ￣糖链的定性及定量研究具有重要意义ꎮ常规Ｎ￣糖基化分析策略多是将其从肽链上酶切游离后再分析ꎬ但Ｎ￣糖链为多羟基醛类化合物ꎬ经典反相色谱与紫外检测方式对其分离分析较困难ꎮ针对这种情况ꎬ科学家多是通过柱前衍生法使糖链带上紫外或荧光基团ꎬ增加检测灵敏度ꎮ对近年来科学家分离分析游离Ｎ￣糖链的方法做了归纳与总结ꎬ其中毛细管电泳㊁高效液相色谱以及质谱联用技术在Ｎ￣糖链的分离分析上有着巨大优势ꎬ对糖蛋白上Ｎ￣糖的定性定量㊁结构表征具有重要意义ꎮ与此同时应进一步发展稳定可靠的Ｎ￣糖释放㊁富集方法ꎬ并结合现代高效的分析手段ꎬ以及有针对性的Ｎ￣糖解析措施ꎬ以期为Ｎ￣糖基化高通量㊁高准确性的分析提供依据ꎮ关键词:Ｎ￣糖基化ꎻ高效液相色谱法ꎻ毛细管电泳法ꎻ质谱ＤＯＩ:１０.１９５８６/ｊ.２０９５￣２３４１.２０１８.０１２１ＡｄｖａｎｃｅｓｏｎｔｈｅＡｎａｌｙｓｉｓＭｅｔｈｏｄｓｏｆＮ￣ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎＺＨＡＮＧＸｉａｏｑｉａｎꎬＺＨＡＮＧＴｅｎｇｔｅｎｇꎬＹＡＮＰａｎꎬＹＡＮＧＢｉｃｈａｏꎬＡＮＦｅｎｇｘｉａ∗ＳｃｈｏｏｌｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＢｏｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＡｎｈｕｉＢｏｚｈｏｕ２３６８００ꎬＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ:Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｃｏｍｍｏｎｆｏｒｍｓｏｆｐｏｓｔ￣ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ.ＡｓｔｈｅｍａｉｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｔｙｐｅｏｆｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓꎬＮ￣ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｐｌａｙｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｍａｎｙｌｉｆｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ.ＩｔｈａｓｐｏｓｉｔｉｖｅｐｒａｃｔｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｆｏｒｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｆＮ￣ｇｌｙｃａｎｓ.ＴｈｅｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｓｔｒａｔｅｇｙｏｆＮ￣ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｉｓｔｏｓｅｐａｒａｔｅｔｈｅＮ￣ｇｌｙｃａｎｓｆｒｏｍｔｈｅｐｅｐｔｉｄｅｃｈａｉｎｂｙｅｎｚｙｍａｔｉｃｄｉｇｅｓｔｉｏｎ.ＢｕｔｉｔｉｓｄｉｆｆｉｃｕｌｔｔｏｓｅｐａｒａｔｅａｎｄａｎａｌｙｚｅｔｈｅＮ￣ｇｌｙｃａｎｓｂｙｃｌａｓｓｉｃａｌｒｅｖｅｒｓｅｄ￣ｐｈａｓｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎꎬｂｅｃａｕｓｅｏｆｔｈｅＮ￣ｇｌｙｃａｎｓｉｓａｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｄｅｈｙｄｅｃｏｍｐｏｕｎｄ.Ｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｔｈｉｓｓｉｔｕａｔｉｏｎꎬｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓｍｏｓｔｌｙｕｓｅｐｒｅ￣ｃｏｌｕｍｎｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎｔｏｍａｋｅｔｈｅｓｕｇａｒｃｈａｉｎｓｗｉｔｈｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｏｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｇｒｏｕｐｓꎬｓｏａｓｔｏｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｉｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎ.ＩｎｔｈｉｓｐａｐｅｒꎬｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｆｏｒｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｖｅＮ￣ｇｌｙｃａｎｓｗｅｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ.ＡｍｏｎｇｔｈｅｍꎬＣＥꎬＨＰＬＣａｎｄＭＳｈａｖｅｇｒｅａｔａｄｖａｎｔａｇｅｓｉｎｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆＮ￣ｇｌｙｃａｎｓꎬｗｈｉｃｈａｒｅｏｆｇｒｅａｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｆｏｒｔｈｅｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅꎬｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＮ￣ｇｌｙｃａｎｓｉｎｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ.ＭｅａｎｗｈｉｌｅꎬｓｔａｂｌｅａｎｄｒｅｌｉａｂｌｅｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒＮ￣ｇｌｙｃａｎｓｒｅｌｅａｓｅａｎｄｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｓｈｏｕｌｄｂｅｆｕｒｔｈｅｒｄｅｖｅｌｏｐｅｄꎬｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｍｏｄｅｒｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔａｎａｌｙｔｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｔａｒｇｅｔｅｄｍｅａｓｕｒｅｓｆｏｒＮ￣ｇｌｙｃａｎｓａｎａｌｙｓｉｓꎬｗｈｉｃｈｗａｓｅｘｐｅｃｔｅｄｔｏｐｒｏｖｉｄｅａｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＮ￣ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｈｉｇｈｆｌｕｘａｎｄａｃｃｕｒａｃｙ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｓꎻｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙꎻｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓꎻｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ㊀㊀糖基化(ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ)是真核细胞最常见的蛋白转译后修饰方式之一ꎬ对蛋白质生物学功能的发挥起着至关重要的作用ꎬ如蛋白质折叠㊁细胞识别㊁癌细胞转移㊁薄膜保护作用㊁血型决定系统㊁物质转运等[１~３]ꎮ不仅如此ꎬ以重组蛋白质为基础研制的药品(例如单克隆抗体)成为当下社会快速发展的制药方向ꎬ许多新型药物都是糖蛋白ꎬ包括一些癌症标志物和疫苗等ꎮ自从１９８６年市. All Rights Reserved.场引入了第一个治疗型的单克隆抗体之后ꎬ治疗型蛋白药物的市场飞速增长ꎮ２０１７年ꎬ仅Ｈｕｍｉｒａ一种单抗药物全球销售额就已高达１８４亿美元[４]ꎮ据不完全估计ꎬ人类蛋白中有５０％以上都发生了糖基化修饰ꎬ生物制药中最亮眼的单克隆抗体１００％都是糖蛋白药物ꎬ因此针对蛋白糖基化的研究愈发重要[５]ꎮ生物体中最常见的糖蛋白是Ｎ￣糖苷键型糖蛋白ꎬ即寡聚糖与肽链上的天冬酰胺(ａｓｐａｒａｇｉｎｅꎬＡｓｎ)侧链的酰胺氮连接而修饰的蛋白[６]ꎮＮ￣糖链在整个糖蛋白中只占很小的一部分ꎬ但是对整个糖蛋白的性质影响巨大ꎮ关于Ｎ￣糖基化的研究通常可以从三个方面考量:①研究整体糖蛋白的糖链ꎻ②糖蛋白经过酶切后ꎬ糖肽水平的研究ꎻ③经过化学手段或酶切释放寡糖链ꎬ对游离Ｎ￣糖的研究ꎬ其中对酶切游离后Ｎ￣糖链的研究也是最简单㊁高效的方法[７ꎬ８]ꎮ目前ꎬＮ￣糖链主要是用肽Ｎ￣糖苷酶Ｆ(ＰＮＧａｓｅＦ)酶解[９]ꎬ得到游离的Ｎ￣糖链ꎬ再结合毛细管电泳(ｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓꎬＣＥ)㊁高效液相色谱(ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏ￣ｍａｔｏｇｒａｐｈｙꎬＨＰＬＣ)和质谱(ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｕｍꎬＭＳ)等技术对其进行分析ꎮ但由于游离Ｎ￣糖链为多羟基醛类化合物ꎬ本身没有发色基团ꎬ紫外检测器几乎无法检测ꎬ且质谱响应也较差ꎬ常规电喷雾离子源(ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙｉｏｎｉｚａｔｉｏｎꎬＥＳＩ)正负离子模式下灵敏度都不高ꎬ这也造成常规高效的检测方法如ＣＥ㊁ＨＰＬＣ及液质联用(ＬＣ￣ＭＳ)等对其分析困难ꎮ针对这种情况ꎬ科学家多是通过柱前衍生法使糖链带上紫外或荧光基团ꎬ增加其检测的灵敏度[１０]ꎬ常规Ｎ￣糖基化分析流程见图１ꎮ糖基化作为蛋白翻译后修饰的重要步骤ꎬ其异常表达与疾病的发生发展㊁生理状态的变化之间具有很高的关联性ꎬ例如在炎症反应㊁恶性疾病㊁衰老等[１１]不同的病理㊁生理条件下ꎬ糖链的结构和表达量都会发生变化ꎮ不仅如此ꎬ大量研究表明ꎬ单抗药物的Ｎ￣糖基化修饰对其稳定性㊁清除率㊁免疫原性㊁抗体依赖细胞毒性(ａｎｔｉｂｏｄｙ￣ｄｅ￣ｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙꎬＡＤＣＣ)及补体依赖细胞毒性(ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙꎬＣＤＣ)等都有一定的影响[１２]ꎮ例如ꎬ缺少核心岩藻糖的糖型能够增强对ＦｃγＲⅢａ受体的亲和力ꎬ从而提高ＡＤＣＣ[１３]ꎻ而高水平的唾液酸化的糖型则会减少对ＦｃγＲⅢａ受体的亲和力ꎬ从而降低ＡＤＣＣ[１４]ꎮ因此ꎬ对糖蛋白中Ｎ￣糖基化修饰的研究具有重要意义ꎬ基于上述理念ꎬ本文对近年来科学家分离分析游离Ｎ￣糖链的方法做了归纳与总结ꎬ这其中ＣＥ㊁ＨＰＬＣ以及ＭＳ联用技术在Ｎ￣糖链的分离分析上有着巨大优势ꎬ对糖蛋白上Ｎ￣糖的定性定量分析㊁结构表征具有重要意义ꎮ图１㊀Ｎ￣糖链分析流程图Ｆｉｇ.１㊀ＡｎａｌｙｓｉｓｆｌｏｗｃｈａｒｔｏｆＮ￣ｇｌｙｃａｎｓ.７４２张小倩ꎬ等:蛋白Ｎ￣糖基化分析方法研究进展. All Rights Reserved.１㊀Ｎ￣糖链的释放所谓Ｎ￣糖链的释放就是将Ｎ￣糖链从糖蛋白上切下来ꎬ其主要是通过酶解或化学方法将Ｎ￣糖链和糖基化的多肽分开ꎬ然后再对释放的Ｎ￣糖链单独分析ꎬ从而获得待检测样本中的糖链表达和变化情况ꎬ这样有目的性的对Ｎ￣糖链进行分离分析可以大大提高分析效果[１５ꎬ１６]ꎮ酶切释放主要依赖于ＰＮＧａｓｅＡ/Ｆ/Ｈ＋和糖苷内切酶(ｅｎｄｏ￣β￣Ｎ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅꎬＥｎｄｏ)Ｆ/ＨꎮＰＮＧａｓｅ可特异性识别并水解连接Ｎ￣糖链的Ａｓｎ残基侧链的氨基与羰基间的酰胺键[１７]ꎮ其中ꎬＰＮＧａｓｅＦ是一种具有普适性的肽Ｎ￣糖苷酶ꎬ已被广泛应用于释放糖蛋白的Ｎ￣糖链ꎮ例如ꎬＫｏｚａｋ等[１８]采用ＰＮＧａｓｅＦ酶切人免疫球蛋白Ｇ(ＩｇＧ)中的Ｎ￣糖链ꎬ然后用２￣氨基苯甲酰胺(２￣ＡＢ)衍生ꎬ１９个Ｎ￣糖链被稳定释放并检测ꎮ为了进一步分析β￣伴大豆球蛋白(β￣ｃｏｎｇｌｙｃｉｎｉｎ)糖肽的肽链序列和糖链结构ꎬ李玲梅等[１９]结合使用ＰＮＧａｓｅＦ与ＥｎｄｏＨ两种酶切技术鉴定糖基化位点ꎮＰＮＧａｓｅＦ可以特异性酶切Ａｓｎ与糖链之间的糖肽键ꎬ而ＥｎｄｏＨ可以特异性酶切糖链五糖核心结构中２个Ｎ￣乙酰葡萄糖胺(Ｎ￣ＧｌｃＮＡｃ)残基之间的糖苷键ꎬ这２种方法酶解同一种糖肽所得肽段在分子量上相差２０２Ｄａꎬ这一特点可用于精确鉴定糖基化位点ꎮ酶解后的Ｎ￣糖链与肽段经ＭＳ分析ꎬ发现ＰＮＧａｓｅＦ酶解所得肽链共有１６个质谱峰ꎬＥｎｄｏＨ酶解所得肽链共有１４个质谱峰ꎬ对ＥｎｄｏＨ与ＰＮＧａｓｅＦ酶解后所得肽链进行比较发现ꎬ２个样品均有９条肽链ꎬ每条肽链都含有１个糖基化位点ꎬ而且每种ＥｎｄｏＨ水解产物的分子量均比相应的ＰＮＧａｓｅＦ水解产物大２０２Ｄａꎮ最后通过数据库检索对分析结果进行验证ꎬ发现β￣ｃｏｎｇｌｙｃｉｎｉｎ上含有５个糖基化位点ꎬ分别为α亚基１９９位和４５５位的Ａｓｎꎬαᶄ亚基２１５位和４８９位的Ａｓｎ以及β亚基３２６位的Ａｓｎꎮ针对研究目的不同ꎬ也有学者采用其他不同的酶来切割Ｎ￣糖链ꎬ比如ꎬ徐莎等[２０]为了简化被切下来的Ｎ￣糖链的衍生过程ꎬ使用非特异性酶链酶蛋白酶Ｅ(ｐｒｏｎａｓｅＥ)对牛胰核糖核酸酶Ｂ(ｒｉｂｏＢ)和鸡白蛋白(ｃｈｉｃｋｅｎａｌｂｕｍｉｎ)进行酶切ꎬ得到只带一个天冬氨酸的闭环Ｎ￣糖链ꎬ这样由于引入了天然的￣ＮＨ２活性基团ꎬ再以９￣氯甲酸芴甲酯(Ｆｍｏｃ￣Ｃｌ)对其衍生ꎬ可以省略Ｎ￣糖链进一步分析前必须先衍生成糖胺的步骤ꎬ进而提高了整个实验过程的稳定性ꎮ不管采用何种酶切与衍生手段ꎬ最终都是为了提供一个高灵敏度的检测ꎬ便于后面的分析ꎬ但真正关键的地方在于Ｎ￣糖链的分离与分析ꎮＮ￣糖链是一类极性很强的化合物ꎬ在反相色谱(ｒｅｖｅｒｓｅｄｐｈａｓｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙꎬＲＰＬＣ)中基本没有保留ꎬ实验多采用亲水色谱(ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙꎬＨＩＬＩＣ)来对其分析ꎬ再结合荧光检测㊁ＭＳ等对其检测[２１]ꎮ酶解释放Ｎ￣糖链具有高效㊁快速㊁专一的特点ꎬ但成本高昂ꎬ近年来化学法释放Ｎ￣糖链因其较低的成本与广谱性ꎬ也得到了一定的发展ꎮＮ￣糖链的化学释放主要依赖于肼㊁次氯酸钠和氨水等化学试剂ꎮ肼解反应能在９５ħ反应４ｈ的条件下释放Ｎ￣糖链ꎬ但它需要严格的无水肼条件ꎬ并且反应伴有严重的脱乙酰基副反应[２２]ꎮ次氯酸钠是通过氧化来释放Ｎ￣糖链ꎬ此方法虽然能大规模释放Ｎ￣糖链ꎬ但会使Ｎ￣糖链还原末端的Ｎ￣Ｇｌｃ￣ＮＡｃ丢失[２３]ꎮ针对上述情况ꎬ袁江北等[２４]开发了一种简单㊁经济㊁快速的非特异性释放Ｎ￣糖链的方法ꎬ实验采用ＮａＯＨ体系对Ｎ￣糖链进行完整的释放ꎬ糖蛋白样品置于５０ħ㊁０.５ｍｏｌ/ＬＮａＯＨ溶液中反应１６ｈꎮＭＳ分析结果表明该方法具有通用性好㊁释放效率高㊁无副反应的优点ꎬＮ￣糖链的释放效率能达到ＰＮＧａｓｅＦ酶的９０％以上ꎬ并且通过此方法得到的Ｎ￣糖链都是还原性寡糖ꎬ可以标记荧光试剂ꎬ目前已成功的用此方法对ＲｉｂｏＢ㊁鸡白蛋白㊁人胎球蛋白和人血浆的Ｎ￣糖链进行了解析ꎮ２㊀Ｎ￣糖链的分离分析方法２.１㊀电泳法ＣＥ以毛细管为分离通道㊁以高压直流电场驱动带电荷样品移动实现分离ꎬ具有分离效率高㊁样品消耗少等优点ꎬ在复杂糖链结构表征中具有很大的应用潜力[２５]ꎮ硫酸化㊁唾液酸化的糖链自身带有负电荷ꎬ可用电泳法分离纯化ꎬ中性糖链通过与８￣氨基芘￣１ꎬ３ꎬ６￣三磺酸(ＡＰＴＳ)等作用形成带电荷且具有荧光基团的复合物ꎬ然后电泳分离[２６]ꎮ王文波等[２７]采用ＣＥ对原研抗ＣＤ２０人８４２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.鼠嵌合单抗和４个生物类似药的Ｎ￣糖谱进行分析ꎬ比较它们之间的差异性ꎮ实验首先使用ＰＮＧａｓｅＦ对单抗Ｆｃ上的Ｎ￣糖链进行酶切释放ꎬ然后用ＡＰＴＳ标记ꎻ毛细管电泳使用ＢｅｃｋｍａｎＮ￣ＣＨＯ涂层毛细管ꎬ以分离胶为电泳缓冲液ꎬ在３０ｋＶ电压下分离ꎬ最后使用激光诱导荧光检测器(ＬＩＦ)检测ꎬ最终原研抗ＣＤ２０单抗中６种Ｎ￣糖链被分离检测到ꎮ整个分离过程在２０ｍｉｎ就可以完成ꎬ且经过ＡＰＴＳ衍生的Ｎ￣糖在ＬＩＦ检测器下灵敏度可以达到ａｍｏｌ级别ꎮ电泳技术不仅可以对糖蛋白糖链进行一定的分离纯化ꎬ还可以给出其相关的结构信息ꎮ荧光辅助糖电泳(ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ￣ａｓｓｉｓｔｅｄｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓꎬＦＡＣＥ)㊁ＣＥ等是糖链分离纯化㊁结构解析的常用工具ꎬ糖链在荧光标记后进行的聚丙烯酰胺凝胶电泳(ＰＡＧＥ)电泳即ＦＡＣＥꎬ通过外切糖苷酶阵列法(ｒｅａｇｅｎｔａｒｒａｙａｎａｌｙｓｅｓｍｅｔｈｏｄꎬＲＡＡＭ)和标准糖链的比对可以给出目标糖蛋白糖链的结构信息ꎮＣＥ可快速分离分析微量糖链ꎬ且不同缓冲体系中标准糖链的ＣＥ行为构建的糖谱ꎬ可以用于相关未知糖链的结构鉴定ꎮＫａｒｇｅｒ等[２８]报道了基于ＣＥ￣ＬＩＦ检测的糖链检测方法ꎬ实现了７ｍｉｎ内ＩｇＧ中１２种糖链异构体的高效分离ꎬ并将该方法成功应用于单抗类药物糖型表征ꎬ为抗体类药物的质量控制提供了简单㊁快速㊁灵敏的分析方法ꎮ李凤等[２９]使用自制的聚乙烯醇中性涂层柱ꎬ乙酸铵缓冲体系ꎬ建立了寡聚葡萄糖的分析方法ꎬ通过拟合多项式分布曲线发现葡聚糖的聚合度值(ｇｌｕｃｏｓｅｕｎｉｔｓꎬＧｕｓ)与各组分电泳迁移时间相关性良好ꎬ相关系数(Ｒ２)为０.９９ꎮ然后采用此方法对５μＬ人血清中Ｎ￣糖链进行分析ꎬ初步分离得到了１７个Ｎ￣糖链组分ꎬ并建立指纹图谱ꎬ为探索血清蛋白的糖基化变化提供了分析方法ꎮＰＡＧＥ胶上酶解法可同时分析糖蛋白糖链结构和糖基化位点ꎬ适用于不易纯化或量少的样品ꎬ是糖组学糖蛋白糖链结构研究的有力工具ꎮＲｕｄｄ等[３０]利用ＰＡＧＥ将待分析糖蛋白分离后ꎬ切割感兴趣的条带并用ＰＮＧａｓｅＦ酶解释放糖链ꎬ再对糖链进行标记㊁分析ꎮ２.２ 液相色谱法ＨＰＬＣ在分析化学㊁有机化学以及生物化学等领域应用很广泛[３１]ꎮＮ￣糖链作为一类极性化合物ꎬ易溶于水㊁甲醇等极性溶剂ꎬ特别适合ＨＰＬＣ的分析ꎮ但是由于Ｎ￣糖类化合物极性较强ꎬ在经典的ＲＰＬＣ上几乎无法保留ꎬ大都会被一起洗脱出来ꎬ并不适用于分离ꎬ即使是经过一些弱极性集团衍生过的Ｎ￣糖也没有较好的保留ꎮ基于这种情况ꎬ科学家发明了ＨＩＬＩＣ用于这种强极性化合物的分析ꎬ它与正相色谱(ｎｏｒｍａｌｐｈａｓｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙꎬＮＰＬＣ)的保留机理相似ꎬ但却可以使用ＲＰＬＣ的流动相ꎬ使整个分离条件更温和ꎬ且有利于后续样品检测的顺利进行ꎮＨｅｎｒｙ等[３２]采用超高效液相色谱(ｕｌｔｒａｐｅｒ￣ｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙꎬＵＰＬＣ)分离曲妥珠单抗上的Ｎ￣糖链ꎬ并采用ＦＬＲ与ＭＳ表征被分离的Ｎ￣糖ꎮ实验通过ＰＮＧａｓｅＦ酶将单抗中的Ｎ￣连寡糖释放出来ꎬ游离的寡糖先用２￣ＡＢ进行标记ꎬ然后在ＨＩＬＩＣ模式下进行分离并使用ＦＬＲ和串联四极杆飞行时间质谱(ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ￣ｔｉｍｅｏｆｆｌｉｇｈｔｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙꎬＱＴｏｆ)进行检测ꎮ对比３个批号曲妥珠单抗的Ｎ￣糖的ＨＰＬＣ￣ＦＬＲ分析结果ꎬ被标记的Ｎ￣糖均得到较好的分离ꎬ１７个糖型在３５ｍｉｎ内完成分离ꎬ各峰之间都实现了基线分离ꎬ结合ＦＬＲ可以很好地用于各糖型的定量ꎬ且整个分析结果表现了出了很好的重现性ꎮ王文波等[３３]利用ＵＰＬＣ串联单四极杆检测器(ＱＤａ)对抗ＣＤ２０人鼠嵌合单抗的Ｎ￣糖谱进行定性和定量分析ꎮＣＤ２０单抗的Ｎ￣糖链经ＰＮＧａｓｅＦ酶切释放后用ＲａｐｉＦｌｕｏｒＭＳ试剂进行标记ꎬ通过ＱＤａ对Ｎ￣糖进行糖型鉴别㊁ＦＬＲ进行定量检测ꎮＵＰＬＣ条件采用酰胺色谱柱㊁乙腈－乙酸铵流动相体系ꎬ在荧光检测器下检测到１５种Ｎ￣糖类型ꎬ在３５ｍｉｎ内实现基线分离ꎬ并对其进行定量ꎬ再结合ＱＤａ质谱检测器定性ꎬ很好的实现了抗ＣＤ２０人鼠嵌合单抗中Ｎ￣糖的表征情况ꎮＨＰＬＣ因其高效稳定的分离能力在Ｎ￣糖的分析中非常重要ꎬ经过ＨＰＬＣ的分离后ꎬ结合高灵敏度ＦＬＲ检测的数据可以实现对Ｎ￣糖的定量分析ꎬ同时ＭＳ又能帮助确认Ｎ￣糖的结构信息ꎮ铁偲等[３４]为了满足ＩｇＧ药物Ｎ￣糖分析的实际需要ꎬ建立了稳定㊁灵敏的ＩｇＧ药物Ｎ￣糖的分析方法ꎬ采用全新的肼基衍生化试剂对游离Ｎ￣糖进行衍生化ꎬ并对衍生化后的Ｎ￣糖进行ＬＣ￣ＭＳ分析ꎮ实验同样采用酰胺色谱柱ꎬ乙腈－碳酸氢铵流动相体９４２张小倩ꎬ等:蛋白Ｎ￣糖基化分析方法研究进展. All Rights Reserved.系ꎮ１４个类型的Ｎ￣糖被检测到ꎬ其中麦芽五糖在３０ｎｇ/ｍＬ的低浓度下仍然实现了检测ꎮ整个分析方法高效快速ꎬ而且具有极高的灵敏度ꎮ２.３㊀质谱ＥＳＩ和基质辅助激光解析(ｍａｔｒｉｘ￣ａｓｓｉｓｔｅｄｌａｓｅｒｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎｉｏｎｉｚａｔｉｏｎꎬＭＡＬＤＩ)是目前用于糖链电离的两种主要方法ꎬ并且在糖链离子化方面具有很强的互补性ꎮ此外ꎬ通过与多种高性能质量分析器(三重四极杆㊁时间飞行㊁离子阱㊁傅里叶变换离子回旋共振等)串联后ꎬ可以实现串联质谱(ＭＳ/ＭＳ)或多级质谱(ＭＳｎ)分析ꎬ从而获得更多的糖结构信息ꎮ２.３.１㊀电喷雾电离质谱㊀电喷雾电离质谱(ｅｌｅｃ￣ｔｒｏｓｐｒａｙｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙꎬＥＳＩ￣ＭＳ)使溶液中的被分析化合物在电喷雾针里带电㊁雾化后形成带电荷的分子离子峰ꎬ离子再经过质量分析器分析获得分子量相关信息ꎮＥＳＩ￣ＭＳ根据样品的性质可以产生多电荷离子ꎬ使得其质量检测范围成倍增加ꎬ并且能够获得比单电荷母离子更多的结构信息ꎬ对于大分子化合物的分子具有独特优势ꎮ但是对于ＥＳＩ￣ＭＳ而言ꎬ样品的制备是十分复杂的ꎬ主要是因为其容易受到样品添加剂和缓冲盐的影响[３５]ꎮ因此ꎬ其常常需要与ＨＰＬＣ㊁ＣＥ等技术进行联用ꎬ结合ＨＰＬＣ与ＣＥ的分离能力对组分更为复杂的样品进行分离分析ꎮ例如Ｓｅｔｈｉ等[３６]通过使用ＰＮＧａｓｅＦ酶对３种不同表型的结肠癌细胞中的糖蛋白进行酶解ꎬ得到的游离Ｎ￣糖采用ＬＣ￣ＥＳＩ￣ＭＳ/ＭＳ在负离子模式下进行分析ꎬ结果发现３种表型的结肠癌细胞中的甘露糖均有较高的表达(７０％~９０％)ꎬ同时揭示了二天线α￣２ꎬ３￣唾液酸Ｎ￣糖结构对于肿瘤细胞分型的影响ꎮＮ￣糖链结构复杂ꎬ不同单糖之间具有多种连接方式ꎬ而一级质谱数据只能提供Ｎ￣糖的质量数ꎬ对其链接方式较难确定ꎬ串联质谱丰富的数据可以判断㊁确定糖链的线性结构ꎮ如潘丽英等[３７]使用ＥＳＩ￣ＭＳ/ＭＳ分析人肝癌细胞ＨｅｐＧ２和正常肝细胞Ｌ０２中Ｎ￣糖的差异ꎬ被ＰＮＧａｓｅＦ酶酶切下的游离Ｎ￣糖链经过串联四极杆质谱分析后ꎬ通过分析母离子与碎片离子ꎬ２６种Ｎ￣糖链被检测并确认ꎬ通过比较发现ꎬＨｅｐＧ２的大多数高甘露糖型糖链㊁唾液酸化糖链和岩藻糖基化糖链的数量较Ｌ０２都明显升高ꎮ对于糖链结构的完全解析ꎬ则需要多级质谱的数据来确定单糖的组成㊁序列㊁糖链的连接方式㊁糖链拓扑结构等信息ꎮ在多级质谱模式下ꎬ可以选择特定的母离子ꎬ使用气体进行碰撞ꎬ依次产生子离子碎片ꎮ通过分析单糖与单糖之间的裂解信息ꎬ可以确定糖链序列ꎬ分析单糖的环内裂解信息ꎬ可以确定糖链的分支情况ꎮ在确定碎片结构后ꎬ将所有的碎片信息重组ꎬ可以获得完整的糖链结构信息ꎮＲｅｉｎｈｏｌｄ团队[３８~４０]就应用多级质谱对糖链进行测序ꎬ并提供了三种分析的策略和算法ꎬ对糖链的连接位点㊁单体㊁空间构型等信息进行了推测与判断ꎮ２.３.２㊀基质辅助激光解析电离质谱㊀ＭＡＬＤＩ￣ＭＳ是一种直接气化并离子化非挥发性样品的质谱离子化方式ꎬ整个电离过程可在极短的时间内完成ꎬ且不产生热分解ꎮ而且这种温和的电离方式只产生单电荷分子离子ꎬ产生的数据简单ꎬ在糖组学分析中具有重要意义[４１]ꎮ对Ｎ￣糖链结构分析时ꎬ酸性末端如唾液酸常在高能量的碰撞中丢失ꎬＭＡＬＤＩ因其温和的电离方式可以得到准确的分子离子峰ꎮＭＡＬＤＩ离子源常用Ｔｏｆ进行检测ꎬ这种组合成的质谱被称为基质辅助激光解析飞行时间质谱(ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ)ꎬ主要用于完全甲基化的糖链分析[４２]ꎮＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ具有灵敏度高㊁分子质量检测精确度高㊁检测速度快㊁成本低等特点ꎮ基于这些特征ꎬＣａｎｉｓ等[４３]先用凝胶色谱和亲和色谱对血清中的血管性血友病因子(ｖＷＦ)进行纯化ꎬ并对酶解游离出的Ｎ￣糖进行了正负离子两种模式的ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ分析ꎬ分析了３００个人血管性血友病因子携带的Ｎ￣糖谱ꎬ同时也证明了Ｈ抗原不受Ｎ￣糖基化位点的影响ꎮ此外ꎬＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ也是用于大规模体外诊断和生物标志物研究的有力工具ꎬＨｏｌｓｔ等[４４]应用ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ对２５种不同的结肠直肠癌细胞系的Ｎ￣糖谱进行了大规模研究ꎬ发现了α￣２ꎬ３和α￣２ꎬ６连接的唾液酸糖肽在不同细胞膜蛋白的改变ꎬ并证明了高甘露糖型Ｎ￣糖不仅存在于细胞内前体上ꎬ也存在于细胞膜上ꎮ３㊀展望蛋白质的糖基化作为调控蛋白质功能的重要因素之一ꎬ糖基化位点的改变或者糖链结构的改０５２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.变都会引起蛋白质功能的改变ꎮ无论是基于病变机理对糖基化的研究ꎬ还是糖蛋白药物质量稳定性中关于糖基化的研究都至关重要ꎮＨＰＬＣ㊁ＣＥ与ＭＳ都是Ｎ￣糖分析的有力手段ꎬＨＰＬＣ与ＣＥ用于不同糖型的分离ꎬ高效稳定ꎬ且使用性非常广ꎬ基本的Ｎ￣糖都可以通过二者来分离ꎬ同时由于二者分析机理的差异性ꎬ又可以互补使用ꎮＦＬＲ与ＭＳ作为Ｎ￣糖分析时常用的检测方式ꎬ具有非常高的灵敏度ꎬ尤其是经过衍生后的Ｎ￣糖被检出的灵敏度更是大大增加ꎮＮ￣糖基化作为糖蛋白中最主要的糖基化类型ꎬ对其的定量定性分析既重要又困难ꎮ糖复合物中糖类分子的异常表达ꎬ重组糖蛋白生产时ꎬ生物合成共价寡糖出错都是非常致命的问题ꎮ而且Ｎ￣糖链在整个糖蛋白中占比非常少ꎬ准确㊁可重复的将其富集出来有较大的难度ꎬ在Ｎ￣糖链的分离与解析时ꎬ因空间立体结构差异较大ꎬ同样也存在非常大的困难ꎮ应该着重发展更稳定可靠的Ｎ￣糖释放㊁富集方法ꎬ再结合现代高效分析手段ꎬ以及有针对性的Ｎ￣糖解析措施ꎬ为Ｎ￣糖基化高通量㊁高准确性的分析提供依据ꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀ＯｈｔｓｕｂｏＫꎬＭａｒｔｈＪＤ.Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｉｎｃｅｌｌｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｈｅａｌｔｈａｎｄｄｉｓｅａｓｅ[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２００６ꎬ１２６(５):８５５－８６７. [２]㊀严钦ꎬ俞慧清ꎬ成国祥.蛋白糖基化与免疫研究进展[Ｊ].现代免疫学ꎬ２００８ꎬ２８(２):１６５－１６８.[３]㊀吕若芸ꎬ王辉ꎬ陈忱ꎬ等.Ｎ￣糖链切除对重组抗狂犬病毒单克隆抗体中和活性的影响[Ｊ].生物技术进展ꎬ２０１６ꎬ６(０４):２７７－２８２.[４]㊀风云.２０１７年全球药物销售额ＴＯＰ１００出炉修美乐１８４亿美元卫冕[ＥＢ/ＯＬ].ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ.ｃｏｍ.ｃｎ/ｎｅｗｓ/２０１８０３０７/２４１２３６.ｓｈｔｍｌꎬ２０１８.[５]㊀ＡｐｗｅｉｌｅｒＲꎬＨｅｒｍｊａｋｏｂＨꎬＳｈａｒｏｎＮ.Ｏｎｔｈｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｐｒｏ￣ｔｅｉｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎꎬａｓｄｅｄｕｃｅｄｆｒｏｍａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＳｗｉｓｓ￣ｐｒｏｔｄａｔａｂａｓｅ[Ｊ].Ｂｉｏｃｈｉｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ａｃｔａꎬ１９９９ꎬ１４７３(１):４－８. [６]㊀张斌ꎬ刘晓志ꎬ周敬华ꎬ等.抗体药物糖化检测方法及其生物学功能研究进展[Ｊ].生物技术进展ꎬ２０１８ꎬ８(１):２８－３３.[７]㊀ＩｌｅａｎａＲｏｄｒｉｇｕｅｚＬꎬＲｏｃｈａＳＬＧＡꎬＤａꎬｅｔａｌ..Ｕｓｉｎｇｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｎｅｇｌｅｃｔｅｄｇｌｙｃａｎｍｏｉｅｔｉｅｓｏｆｔｈｅａｎ￣ｔｉｏｐｈｉｄｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓＤＭ４３ａｎｄＤＭ６４[Ｊ].Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓꎬ２０１２ꎬ１２(１７):２７５３－２７６５.[８]㊀朱伯婧ꎬ智渊ꎬ孙士生.Ｎ￣连接完整糖肽的质谱分析策略和研究方法[Ｊ].生物化学与生物物理进展ꎬ２０１７ꎬ４４(１０):８２１－８２９.[９]㊀ＬｅｅＪＹꎬＰａｒｋＴＨ.Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｉｎｖｉｔｒｏｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｕｓｉｎｇｐｅｐ￣ｔｉｄｅ￣Ｎ￣ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅＦ[Ｊ].ＥｎｚｙｍｅＭｉｃｒｏｂ.Ｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２００２ꎬ３０(６):７１６－７２０.[１０]㊀ＫｅｓｅｒＴꎬＰａｖｉｃ'ＴꎬＬａｕｃＧ.Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆ２￣ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅꎬｐｒｏｃａｉｎａｍｉｄｅａｎｄｆｌｕｏｒ￣ＭＳａｓｄｅｒｉｖａｔｉｚｉｎｇａｇｅｎｔｓｆｏｒｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔＨＩＬＩＣ￣ＵＰＬＣ￣ＦＬＲ￣ＭＳＮ￣ｇｌｙｃａｎａｎａｌｙｓｉｓ[Ｊ].Ａｎａｌｙｔ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.ꎬ２０１８ꎬｄｏｉ:１０.１０１６/ｊ.ａｂ.２０１５.０６.００６. [１１]㊀ＡｎｔｈｏｎｙＲＭꎬＲａｖｅｔｃｈＪＶ.ＡｎｏｖｅｌｒｏｌｅｆｏｒｔｈｅｉｇｇＦｃｇｌｙｃａｎ:Ｔｈｅａｎｔｉ￣ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｓｉａｌｙｌａｔｅｄＩＧｇＦｃｓ[Ｊ].Ｊ.Ｃｌｉｎ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.ꎬ２０１０ꎬ３０(１):９－１４.[１２]㊀ＡｌａｉｎＢꎬＥｌｓａＷＲꎬＤａｎｉｅｌＡꎬｅｔａｌ..Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒ￣ａｐｅｕｔｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓ[Ｊ].Ａｎａｌ.Ｃｈｅｍ.ꎬ２０１３ꎬ８５(２):７１５－７３６.[１３]㊀ＳｈａｎＣꎬＱｕａｒｍｂｙＶꎬＧａｏＸꎬｅｔａｌ..ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｆｕｃｏｓｅｒｅｄｕｃｉｎｇｅｆｆｅｃｔｓｉｎａｈｕｍａｎｉｚｅｄａｎｔｉｂｏｄｙｏｎＦｃｒｅｃｅｐｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇａｎｄａｎｔｉｂｏｄｙ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙａｃ￣ｔｉｖｉｔｉｅｓ[Ｊ].ｍＡｂｓꎬ２０１２ꎬ４(３):３２６－３４０.[１４]㊀ＳｃａｌｌｏｎＢＪꎬＴａｍＳＨꎬＭｃｃａｒｔｈｙＳＧꎬｅｔａｌ..ＨｉｇｈｅｒｌｅｖｅｌｓｏｆｓｉａｌｙｌａｔｅｄＦｃｇｌｙｃａｎｓｉｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧｍｏｌｅｃｕｌｅｓｃａｎａｄ￣ｖｅｒｓｅｌｙｉｍｐａｃｔｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ[Ｊ].Ｍｏｌ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.ꎬ２００７ꎬ４４(７):１５２４－１５３４.[１５]㊀ＤｒａｋｅＰꎬＳｃｈｉｌｌｉｎｇＢꎬＧｉｂｓｏｎＢꎬｅｔａｌ..ＥｌｕｃｉｄａｔｉｏｎｏｆＮ￣ｇｌｙ￣ｃｏｓｉｔｅｓｗｉｔｈｉｎｈｕｍａｎｐｌａｓｍａｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓｆｏｒｃａｎｃｅｒｂｉｏｍａｒｋｅｒｄｉｓｃｏｖｅｒｙ[Ｊ].ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ.Ｂｉｏｌ.ꎬ２０１３ꎬ９５１(９５１):３０７. [１６]㊀ＺｈａｎｇＹꎬＰｅｎｇＹꎬＹａｎｇＬꎬｅｔａｌ..Ａｄｖａｎｃｅｓｉｎｓａｍｐｌｅｐｒｅｐａ￣ｒａｔｉｏｎｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒＭｓ￣ｂａｓｅｄｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＮ￣ｇｌｙ￣ｃｏｍｉｃｓ[Ｊ].ＴｒＡＣＴｒｅｎｄｓＡｎａｌｙｔ.Ｃｈｅｍ.ꎬ２０１８ꎬ９９:３４－４６. [１７]㊀何金霞ꎬ贾晓晨ꎬ王文霞ꎬ等.植物Ｎ￣糖链检测技术研究进展[Ｊ].生物技术进展ꎬ２０１８ꎬ８(６):５００－５０８.[１８]㊀ＫｏｚａｋＲＰꎬＴｏｒｔｏｓａＣＢꎬＦｅｒｎａｎｄｅｓＤＬꎬｅｔａｌ..Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｐｒｏｃａｉｎａｍｉｄｅａｎｄ２￣ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅｌａｂｅｌｉｎｇｆｏｒｐｒｏｆｉｌｉｎｇａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｇｌｙｃａｎｓｂｙｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｗｉｔｈｆｌｕｏｒｅｓ￣ｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｃｏｕｐｌｅｄｔｏｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ￣ｍａｓｓｓｐｅｃ￣ｔｒｏｍｅｔｒｙ[Ｊ].Ａｎａｌｙｔ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.ꎬ２０１５ꎬ４８６:３８－４０. [１９]㊀李玲梅ꎬ王承健ꎬ韩健利ꎬ等.β￣伴大豆球蛋白的Ｎ￣糖基化位点及其Ｎ￣糖链的质谱分析[Ｊ].高等学校化学学报ꎬ２０１８ꎬ３９(０３):４２７－４３４.[２０]㊀徐莎ꎬ张萍ꎬ黄琳娟ꎬ等.ＰｒｏｎａｓｅＥ酶解释放糖蛋白Ｎ￣糖链的方法及荧光标记衍生物的ＬＣ￣ＭＳ分析[Ｊ].高等学校化学学报ꎬ２０１０ꎬ３１(１０):１９９２－１９９８.[２１]㊀刘艳玲ꎬ刘晓志ꎬ赵伟ꎬ等.糖蛋白药物的多糖结构解析进展[Ｊ].生物技术进展ꎬ２０１６ꎬ６(４):２４４－２４８.[２２]㊀ＰａｔｅｌＴꎬＢｒｕｃｅＪꎬＭｅｒｒｙＡꎬｅｔａｌ..ＵｓｅｏｆｈｙｄｒａｚｉｎｅｔｏｒｅｌｅａｓｅｉｎｉｎｔａｃｔａｎｄｕｎｒｅｄｕｃｅｄｆｏｒｍｂｏｔｈＮ￣ａｎｄＯ￣ｌｉｎｋｅｄｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａ￣ｒｉｄｅｓｆｒｏｍｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ１９９３ꎬ３２(２):６７９－６９３.[２３]㊀ＳｏｎｇＸꎬＨｏｎｇＪꎬＹｉＬꎬｅｔａｌ..Ｏｘｉｄａｔｉｖｅｒｅｌｅａｓｅｏｆｎａｔｕｒａｌｇｌｙ￣ｃａｎｓｆｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｌｙｃｏｍｉｃｓ[Ｊ].Ｎａｔ.Ｍｅｔｈｏｄｓꎬ２０１６ꎬ１３(６):５２８－５３４.[２４]㊀袁江北.糖蛋白的Ｎ￣糖链的化学法释放新方法研究[Ｄ].西安:西北大学ꎬ硕士学位论文ꎬ２０１４.[２５]㊀ＳｃｈｌｅｃｈｔＪꎬＪｏｏßＫꎬＮｅｕｓüßＣ.Ｔｗｏ￣ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃ￣ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ￣ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ(ＣＥ￣ＣＥ￣ＭＳ):ＣｏｕｐｌｉｎｇＭＳ￣ｉｎ￣ｔｅｒｆｅｒｉｎｇｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｍｉｇｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｗｉｔｈｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍ￣ｅｔｒｙ[Ｊ].Ａｎａｌｙｔ.Ｂｉｏａｎａｌｙｔ.Ｃｈｅｍ.ꎬ２０１８ꎬ４１０(２５):６３５３－６３５９.[２６]㊀ＧｕｔｔｍａｎＡ.ＣａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｉｎｔｈｅＮ￣ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎａ￣ｎａｌｙｓｉｓｏｆｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓＡｎａｌｙｔ.Ｃｈｅｍ.ꎬ１５２张小倩ꎬ等:蛋白Ｎ￣糖基化分析方法研究进展. All Rights Reserved.２０１３ꎬ４８(１):１３２－１４３.[２７]㊀王文波ꎬ王兰ꎬ王馨ꎬ等.抗ＣＤ２０人鼠嵌合单抗Ｎ￣糖的毛细管电泳分析[Ｊ].中国新药杂志ꎬ２０１５(２０):２３１２－２３１６.[２８]㊀ＺｏｌｔａｎＳꎬＡｎｄｒáｓＧꎬＪｏｎａｔｈａｎＢꎬｅｔａｌ..Ｒａｐｉｄｈｉｇｈ￣ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙＮ￣ｇｌｙｃａｎｓｂｙｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ[Ｊ].Ａｎａｌｙｔ.Ｃｈｅｍ.ꎬ２０１１ꎬ８３(１３):５３２９.[２９]㊀李凤ꎬ管月清ꎬ张艳梅ꎬ等.中药多糖及人血清中糖蛋白Ｎ￣糖链的毛细管电泳指纹图谱研究[Ｊ].分析测试学报ꎬ２０１７ꎬ３６(１２):１５１６－１５２１.[３０]㊀ＲｕｄｄＰＭꎬＣｏｌｏｍｉｎａｓＣꎬＲｏｙｌｅＬꎬｅｔａｌ..Ａｈｉｇｈ￣ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｂａｓｅｄｓｔｒａｔｅｇｙｆｏｒｒａｐｉｄꎬｓｅｎｓｉｔｉｖｅｓｅ￣ｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆＮ￣ｌｉｎｋｅｄｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｔｏｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｐｈａｔｅｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＧｅｌｂａｎｄｓ[Ｊ].Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓꎬ２０１５ꎬ１(２):２８５－２９４.[３１]㊀ＢｉａｎｃｏＡꎬＢｕｉａｒｅｌｌｉＦꎬＣａｒｔｏｎｉＧꎬｅｔａｌ..ＡｎａｌｙｓｉｓｂｙＨＰＬＣ￣ＭＳ/ＭＳｏｆｂｉｏｐｈｅｎｏｌｉｃｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｉｎｏｌｉｖｅｓａｎｄｏｉｌｓ[Ｊ].Ａｎａｌｙｔ.Ｌｅｔｔ.ꎬ２００１ꎬ３４(６):１０３３－１０５１.[３２]㊀陈熙ꎬ孙庆龙ꎬ宋兰坤.液质联用(ＬＣ/ＭＳ)技术在单克隆抗体(曲妥珠单抗)结构表征上的应用[Ｊ].中国新药杂志ꎬ２０１４(４):４１８－４２６.[３３]㊀王文波ꎬ于传飞ꎬ张峰ꎬ等.超高效液相色谱串联Ｑｄａ质谱法检测单抗Ｎ￣糖的研究[Ｊ].中国药学杂志ꎬ２０１８ꎬ５３(３):２２３－２２７.[３４]㊀铁偲ꎬ胡婷ꎬ张金兰.基于超滤反应器的蛋白质Ｎ￣糖基化快速分析方法[Ｊ].药学学报ꎬ２０１５(６):７５５－７５９. [３５]㊀ＺａｉａＪ.Ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙａｎｄｔｈｅｅｍｅｒｇｉｎｇｆｉｅｌｄｏｆｇｌｙｃｏｍｉｃｓ[Ｊ].Ｃｈｅｍ.Ｂｉｏｌ.ꎬ２００８ꎬ１５(９):８８１－８９２.[３６]㊀ＳｅｔｈｉＭＫꎬＭｏｒｔｅｎＴＡꎬＳｍｉｔｈＪＴꎬｅｔａｌ..ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＮ￣ｇｌｙ￣ｃａｎｐｒｏｆｉｌｉｎｇｏｆｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅｓｒｅｖｅａｌｓｕｎｉｑｕｅｂｉｓｅｃ￣ｔｉｎｇｇｌｃｎａｃａｎｄＡ￣２ꎬ３￣ｌｉｎｋｅｄｓｉａｌｉｃａｃｉｄｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓａｒｅａｓｓｏ￣ｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆｔｈｅｍｏｒｅｍｅｔａｓｔａｔｉｃ/ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅｃｅｌｌｌｉｎｅｓ[Ｊ].Ｊ.Ｐｒｏｔ.Ｒｅｓ.ꎬ２０１５ꎬ１３(１):２７７－２８８.[３７]㊀潘丽英ꎬ王承健ꎬ袁江北ꎬ等.基于电喷雾电离质谱的人肝癌细胞ＨｅｐＧ２与正常肝细胞Ｌ０２的Ｎ￣糖链的定性定量比较[Ｊ].高等学校化学学报ꎬ２０１４ꎬ３５(２):２３７－２４３. [３８]㊀ＬａｐａｄｕｌａＡＪꎬＨａｔｃｈｅｒＰＪꎬＨａｎｎｅｍａｎＡＪꎬｅｔａｌ..Ｃｏｎｇｒｕｅｎｔｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ.３.Ｏｓｃａｒ:ＡｎａｌｇｏｒｉｔｈｍｆｏｒａｓｓｉｇｎｉｎｇｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｔｏｐｏｌｏｇｙｆｒｏｍＭＳｎｄａｔａ[Ｊ].Ａｎａｌｙｔ.Ｃｈｅｍ.ꎬ２００５ꎬ７７(１９):６２７１－６２７９.[３９]㊀ＨａｉｌｏｎｇＺꎬＳｕｄｄｈａｍＳꎬＲｅｉｎｈｏｌｄＶＮ.Ｃｏｎｇｒｕｅｎｔｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ.２.Ｆｒａｇｌｉｂ:ＡｎＭＳｎｓｐｅｃｔｒａｌｌｉｂｒａｒｙ[Ｊ].Ａｎａｌｙｔ.Ｃｈｅｍ.ꎬ２００５ꎬ７７(１９):６２６３－６２７０. [４０]㊀ＤａｖｉｄＡꎬＳｕｄｄｈａｍＳꎬＡｎｄｙＨꎬｅｔａｌ..Ｃｏｎｇｒｕｅｎｔｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ.１.ＭｉｎｉｎｇｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｄｅｔａｉｌｓｂｙＭＳｎ[Ｊ].Ａｎａｌｙｔ.Ｃｈｅｍ.ꎬ２００５ꎬ７７(１９):６２５０－６２６２. [４１]㊀ＨａｒｖｅｙＤＪ.Ｍａｔｒｉｘ￣ａｓｓｉｓｔｅｄｌａｓｅｒｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ/ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｏｆｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓａｎｄｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ[Ｊ].Ｉｎｔ.Ｊ.ＭａｓｓＳｐｅｃｔ.ꎬ２００３ꎬ２２６(１):１－３５.[４２]㊀ＷａｄａＹꎬＡｚａｄｉＰꎬＣｏｓｔｅｌｌｏＣＥꎬｅｔａｌ..Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｐｒｏｆｉｌｉｎｇｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｇｌｙｃａｎｓ ＨｕｐｏＨｕｍａｎＤｉｓｅａｓｅｇｌｙｃｏｍｉｃｓ/ｐｒｏｔｅｏｍｅｉｎｉｔｉａｔｉｖｅｍｕｌｔｉ￣ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌｓｔｕｄｙ[Ｊ].Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２００７ꎬ１７(４):４１１－４２２.[４３]㊀ＫｅｖｉｎＣꎬＭｃｋｉｎｎｏｎＴＡＪꎬＡｇａｔａＮꎬｅｔａｌ..ＭａｐｐｉｎｇｔｈｅＮ￣ｇｌｙｃｏｍｅｏｆｈｕｍａｎｖｏｎｗｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒ[Ｊ].Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｊ.ꎬ２０１２ꎬ４４７(２):２１７－２２８.[４４]㊀ＨｏｌｓｔＳꎬＤｅｕｓｓＡＪꎬＶａｎＰｅｌｔＧＷꎬｅｔａｌ..Ｎ￣ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｐｒｏｆｉｌｉｎｇｏｆｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅｓｒｅｖｅａｌｓａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆｆｕ￣ｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｃａｕｄａｌｔｙｐｅｈｏｍｅｂｏｘ１(ＣＤＸ１)/ｖｉｌｌｉｎｍｒｎａｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].Ｍｏｌ.Ｃｅｌｌ.Ｐｒｏｔ.ꎬ２０１６ꎬ１５(１):１２４.２５２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.。
