辛酸—硫酸铵沉淀法提取免疫球蛋白G

IgG的分离与提纯-硫酸铵沉淀法以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物，包括血清的全部成分。

但是同抗原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白组分。

通常用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋白必须高度纯化并具有特异性，不应含有非抗体的血清蛋白。

因此，为了浓缩和提高抗体的效价，或为制备免疫球蛋白特异性抗体时，通常也需要分离和纯化免疫球蛋白。

γ球蛋白（IgG）是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全部免疫球蛋白的75％，因此，抗体的分离纯化主要是分离纯化IgG。

纯化IgG小量几十ml的话，用protein A或protein G就可以，疏水柱等也可以纯化；大量的话，上百ml，可以使用streamline protein A。

之前根据载量估计一下需要的柱子体积。

实验室中常用硫酸铵沉淀后过DEAE 纤维素柱，比较简便可获较纯的抗体。

下面以此方法为例介绍IgG的分离与提纯。

材料与试剂配制1. 动物血清2. 硫酸铵饱和溶液硫酸铵800g~850gH2O 1 000ml加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。

注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。

如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。

3. 0.01Mol/L pH7.4PB液A液：0.10Mol/L NaH2PO4液NaH2PO4·2H2O 15.60g加H2O至1 000.mlB液：0.10Mol/L Na2HPO4液Na2HPO4·12H2O 35.80g加H2O至1 000ml取A液19ml，B液81ml加水至1 000ml即可。

4. 1％BaCl2溶液5. 纳氏液HgI 115.00gKI 80.00g加H2O至500.00ml溶化后过滤，然后再加20％NaOH500.00ml，混合即可。

辛酸-硫酸铵沉淀法原理简介：辛酸-硫酸铵法分两步进行。

第一步用辛酸沉淀杂蛋白，辛酸为短链脂肪酸，在酸性条件下可沉淀血清或者腹水中的白蛋白或者其他非lg蛋白质；第二步利用硫酸铵盐析将lg沉淀下来。

实验流程：血清或者腹水↓辛酸沉淀（室温）↓→沉淀（白蛋白和其他非lg蛋白质）上清液（lgG）↓硫酸铵沉淀（4度）↓→上清液沉淀↓溶解沉淀↓透析（4度）实验操作：原料：待纯化的血清（-20度长期保存，实验前4度融化暂存）器材：磁力搅拌器、冷冻离心机、低温冰柜、医用纱布、50ml离心管、透析袋、透析夹。

试剂：1.乙酸-乙酸钠缓冲液：60mmol/L,pH4.02.10×磷酸盐-NaCl缓冲液（PBS）：100mmol/LPBS，pH7.4。

称NaCl 80g、Na2HPO412H2O 29g、KCl 2g、KH2PO42g,加蒸馏水溶解，加入100mmol/LEDTA20ml，用去离子水定容至1000ml。

3.硫酸铵4.辛酸实验步骤：（一）辛酸沉淀除杂蛋白1.抗血清用6倍(2-4倍)体积乙酸-乙酸钠缓冲液稀释（确保终PH为4.5）（PH4.5-4.8）2.室温下边搅拌边缓慢滴加辛酸（血清体积的1%）（25ul/33ul辛酸：1ml血清稀释液），滴加完后继续搅拌30min3.离心（10000r/min，30min），收集上清液，弃去沉淀4.上清液用三层纱布过滤（二）硫酸铵沉淀得免疫球蛋白5.按1/10经过滤的上清液体积加入10×PBS，用5mol/L NaOH调至PH7.46.上清液4度预冷，加等体积的过饱和硫酸铵溶液(4度按277g/L硫酸铵粉末)，边加边搅拌，加完后继续搅拌2小时以上或者4度过夜7.离心（8000r/min、20min），弃去上清液，收集沉淀8.沉淀用少量生理盐水（也可用试剂2）（原血清体积的1/10）复溶，50倍体积透析到PBS中，透析后加入0.9‰ NaN3硫酸铵溶液能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷而使之沉淀下来（称为盐析）。

IgG的分离与提纯：硫酸铵沉淀法以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物，包括血清的全部成分。

但是同抗原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白组分。

通常用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋白必须高度纯化并具有特异性，不应含有非抗体的血清蛋白。

因此，为了浓缩和提高抗体的效价，或为制备免疫球蛋白特异性抗体时，通常也需要分离和纯化免疫球蛋白。

γ球蛋白（IgG）是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全部免疫球蛋白的75%，因此，抗体的分离纯化主要是分离纯化IgG。

纯化IgG小量几十ml的话，用protein A或protein G就可以，疏水柱等也可以纯化；大量的话，上百ml，可以使用streamline protein A。

之前根据载量估计一下需要的柱子体积。

实验室中常用硫酸铵沉淀后过DEAE 纤维素柱，比较简便可获较纯的抗体。

下面以此方法为例介绍IgG的分离与提纯。

一、材料与试剂配制1、动物血清2、硫酸铵饱和溶液硫酸铵800g~850gH2O 1 000ml加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。

注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。

如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。

3、0.01Mol/L pH7.4PB液A液：0.10Mol/L NaH2PO4液NaH2PO4·2H2O 15.60g加H2O至1000.mlB液：0.10Mol/L Na2HPO4液Na2HPO4·12H2O 35.80g加H2O至1 000ml取A液19ml，B液81ml加水至1000ml即可。

4、1%BaCl2溶液5、纳氏液HgI 115.00gKI 80.00g加H2O至500.00ml溶化后过滤，然后再加20%NaOH500.00ml，混合即可。

6、0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液7、洗脱液0.03Mol/L的NaCl液。

辛酸-硫酸铵沉淀法原理简介：辛酸-硫酸铵法分两步进行。

第一步用辛酸沉淀杂蛋白，辛酸为短链脂肪酸，在酸性条件下可沉淀血清或者腹水中的白蛋白或者其他非 lg 蛋白质；第二步利用硫酸铵盐析将 lg 沉淀下来。

实验流程：血清或者腹水辛酸沉淀（室温）J 一沉淀（白蛋白和其他非lg蛋白质）上清液（ lgG）硫酸铵沉淀（ 4 度）J -上清液沉淀溶解沉淀透析（ 4 度）实验操作：原料：待纯化的血清（ -20度长期保存，实验前 4 度融化暂存）器材：磁力搅拌器、冷冻离心机、低温冰柜、医用纱布、 50ml 离心管、透析袋、透析夹。

试剂： 1. 乙酸- 乙酸钠缓冲液： 60mmol/L,pH4.02.10 X磷酸盐-NaCl 缓冲液（PBS： 100mmol/LPBS pH7.4。

称 NaCI 80g、NQHP02HO29g、KCI 2g、KHPO2g,加蒸馏水溶解，加入 100mmol/LEDTA 20ml，用去离子水定容至1000ml。

3.硫酸铵4.辛酸实验步骤：（一：辛酸沉淀除杂蛋白1.抗血清用6倍（2-4倍）体积乙酸-乙酸钠缓冲液稀释（确保终 PH为4.5）（PH4.5-4.8 ：2.室温下边搅拌边缓慢滴加辛酸（血清体积的 1% ：（25ul/33ul 辛酸： 1ml血清稀释液：，滴加完后继续搅拌 30min3.离心（10000r/min， 30min），收集上清液，弃去沉淀4.上清液用三层纱布过滤（二：硫酸铵沉淀得免疫球蛋白5.按1/10经过滤的上清液体积加入10X PBS用5mol/L NaOH调至PH7.46.上清液 4度预冷，加等体积的过饱和硫酸铵溶液（4 度按 277g/L 硫酸铵粉末），边加边搅拌，加完后继续搅拌 2 小时以上或者 4 度过夜7.离心（8000r/min、20min）,弃去上清液，收集沉淀8.沉淀用少量生理盐水（也可用试剂 2）（原血清体积的 1/10 ）复溶，50倍体积透析到PBS中，透析后加入0.9 %。

免疫球蛋白的提取方法根据猪血中含有的各种蛋白质的分子大小、电荷多少、溶解度以及免疫学特征等,从血液中提取免疫球蛋白,常用的有盐析法、有机溶剂沉淀法、有机聚合物沉淀法、变性沉淀法等。

免疫球蛋白的提取盐析法盐析法是分离蛋白质的重要方法之一,是利用抗体与杂质之间对盐浓度敏感程度的差异性进行的。

选择一定浓度范围的盐溶液使部分杂质呈“盐析”状态,抗体成分呈“盐溶”溶解状态。

离心去除盐析沉淀状态的杂蛋白,得到的上清液再选择一定浓度范围的盐溶液使抗体成分呈盐析状态,离心得到的沉淀物即为纯化的目标抗体。

目前常用的盐析法有饱和硫酸铵分步盐析法、辛酸沉淀法、氯化铁沉淀法、多聚磷酸盐盐析法等。

饱和硫酸铵分步盐析硫酸铵是盐析法最常用的无机盐,主要原因是它溶解度大,随温度变化小,对蛋白质有保护作用,高浓度时可抑制微生物和蛋白酶的活性,价格也不贵。

免疫球蛋白的饱和硫酸铵分步盐析法操作简单,对设备和操作条件要求不高,便于工业化生产。

其具体步骤为:取一定量血浆,加生理盐水稀释,边搅拌边缓慢加入饱和硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度20%,4℃静置1h,4000r/min离心10min,弃沉淀,上清液中继续加入饱和硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度50%,浓氨水调pH值至7.0,4℃静置2h,4000r/min离心20m弃上清,将沉淀溶于生理盐水,超滤除盐浓缩,滤液中无S2- 4为止,即得IgG粗提物。

免疫球蛋白的辛酸沉淀法辛酸沉淀法提取IgG时,对设备和操作条件要求较高,在离心时,转速为10000 r/min,普通离心机达不到要求。

在调节溶液pH值时,要控制得当,pH值稍低或稍高对IgG的得率和纯度都有很大影响,这些都限制了它的广泛应用。

其具体步骤为:取一定量0.1mol调pH值至4.5;室温下边搅拌边缓慢加入辛酸(按辛酸25 μl/mL血清混合液添加),继续搅拌30min 后,10000r/min离心30min,弃沉淀,留上清液,上清液用多层纱布过滤,留滤液,然后将滤液装入透析袋中析48h,每8～10h换一次透析液,最后超滤浓缩即得1gG粗提液。

辛酸硫酸铵法提取IgG
（1）动物血清用3倍体积的乙酸乙酸钠缓冲液稀释，0.1mol/LNaHO调PH至4.5.
（2）4℃搅拌并缓慢加入辛酸（每升血清稀释液加入25ml辛酸）加完后继续搅拌30min，后静置2小时然后12000r/min 离心30min，取上清并且测量体积。

按1/10体积加入10×PBS，并用5mol/L的NaHO调至7.4.
（3）上清置于4℃冷遇10min，在4℃条件下按277g/L缓慢加入硫酸铵粉末（终浓度达到45%饱和度）边加边搅拌，加完后继续搅拌30min，后静置1.5小时。

（4）10000r/min离心20min弃上清，收集沉淀。

（5）沉淀用原血清体积的1/10的PBS溶解，装入透析袋放入100倍体积的透析液中，透析过夜。

（6）透析后的抗体溶液在50—55度水浴20min, 12000r/min离心20min取上清液放置-20℃保存。

免疫球蛋白IgG的提取-3五、蛋白质的盐析法向蛋白质溶液中加入不同浓度的中性盐，可以把不同的蛋白质分别沉淀出来。

这种方法称为蛋白质的盐析。

利用蛋白质的盐析法，可以得到我们所需的不同的免疫球蛋白。

最常用的中性盐包括，硅酸铵、硫酸镁、硫酸钠等，其中以硫酸铵最为常用：（一）、优点1、在水中溶解度大，其饱和溶液含有大量盐；2、在水中的溶解度受温度的影响很小；3、一般不会引起蛋白变性。

（二）、缺点提取的纯度较差，所以只能用它作为粗提。

饱和硫酸铵溶液配法：取760g～800g硫酸铵，放人70～80℃蒸馏水1000mL中，搅拌约20min，室温静置过液，硫酸铵结晶析出，即上清为饱和硫酸铵，再用NH40H调pH为7.0。

六、实验内容（一）稀释血清向血清中加入生理盐水，做1�U1稀释，主要目的，以防蛋白质溶液浓度过稠，引起其它蛋白质共沉，或局部蛋白质变性。

（二）用50%饱和度硫酸铵提取免疫球蛋白将用生理盐水按l�U1稀释的动物血清置于三角烧瓶或烧杯中，在电磁搅拌器不断搅拌下，逐滴加入与稀释的蛋白液等量的饱和硫酸铵（血清1体积+生理水1体积+饱和硫酸铵2体积），搅拌的目的是为了防止局部硫酸铵浓度过高。

搅拌后，室温放置0.5～1h，或置4℃冰箱过夜，次日取出，以每分钟4000转离心30min（离心管周围加冰块或冰水），离心后弃上清（内含白蛋白等），沉淀物中即含γ和β球蛋白。

硫酸铵溶液的饱和度是指在整个溶液中所占的百分比，与原蛋白液的浓度无关。

分子量大的蛋白质先沉淀，分子量小的蛋白质后沉淀，球蛋白的分子量20～30万，而白蛋白的分子量只有69000，所以50%饱和度硫酸铵沉淀的是球蛋白，而白蛋白则留在上清液中。

（三）用33%饱和度硫酸铵提取血清中的γ球蛋白当血清中饱和硫酸铵为50%饱和度时，沉淀三次，仍含有大量的α、β球蛋白及极少量的白蛋白，当硫酸铵饱和度由50%减少到33～35%时，沉淀蛋白质中的α、β球蛋白和白蛋白的含量相应逐渐减少，而γ球蛋白的纯度逐渐提高，第三次沉淀物只含有少量的α、β球蛋白及白蛋白。

单克隆抗体的纯化一、简介抗体或免疫球蛋白（Ig）是B 淋巴细胞针对暴露于外源抗原后产生的独特的可溶性糖蛋白。

通常可从血浆（占总蛋白20%），血清，腹水，细胞培养基，蛋黄，植物提取物或细菌和酵母培养物中分离得到抗体。

常用于纯化的材料主要以腹水和细胞培养上清为主。

单抗纯化方式常用的技术：DEAE 离子交换层析柱，凝胶过滤法和亲和层析。

二、技术方法及原理（一）单抗粗提1.硫酸铵沉淀法（1）原理：高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。

各种蛋白质的溶解度不同，故可利用不同盐浓度来沉淀不同蛋白质，硫酸铵因其溶解度大，温度系数小，不易使蛋白质变性而应用广泛。

（2）方法：①若样本体积较小，可配置100%饱和硫酸铵（375 g 硫酸铵加入500 mL 的蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出晶体任其留在瓶中，用氨水或者硫酸调节pH 至7.0）；若体积较大直接使用固体硫酸铵，根据表格（1）称取所需质量。

②盐析：缓慢向腹水中加入一定量的饱和硫酸铵溶液（或者缓慢加入固体硫酸铵，0.277 mg/mL 终浓度为45%），缓慢搅拌30 min ，室温静置2 h ，再5000 rpm 离心25 min ，去上清，沉淀用PBS 溶解。

③脱盐：主要有柱层析和透析法a）柱层析：将上述样品过Sephadex G-25 层析柱，以PBS 或Tris-HCl 缓冲液为平衡液和洗脱液，第一个蛋白峰即为脱盐后的抗体溶液；b）透析法：将样品装入处理后的透析袋（2% NaHCO3，1mM EDTA 煮沸10 min，蒸馏水洗净）中，置换缓冲溶液为PBS 或Tris-HCl 缓冲液，期间更换4-5 次透析液；2.辛酸-硫酸铵沉淀法（1）适用范围：该法简单易行，适用于提纯IgG1 和IgG2b ，但对IgG3 和IgA 的回收率及纯化效果差。

（2）试剂：0.06M 醋酸缓冲溶液（pH5.0），1M HCl，辛酸，1xPBS ，1M NaOH；（3）方法：在预处理后的腹水中加入2 倍体积的0.06M 醋酸缓冲溶液（pH5.0），按比例加入辛酸（11uL 辛酸/mL 腹水），室温搅拌下逐滴加入，30min 内加完，4℃静置2 h ，10000 rpm 离心30 min ，弃沉淀，上清过滤（经尼龙筛125uM），加入1/10 的1xPBS，再用1M NaOH 调节pH 至7.2；4℃下加入饱和硫酸铵至45% 饱和度，静置1h ，10000 rpm 离心30 min ，弃上清；沉淀用PBS 溶解；3.优球蛋白沉淀法（1）适用范围：适用于提纯IgG3 和IgM 的提取，不会影响抗体活性；复溶缓冲溶液（1M NaCl ，0. 1M Tris-HCl ，pH8.0）（2）试剂：NaCl ，CaCl2，（3）方法：取一定量的预处理后腹水，先后加入NaCl（终浓度0.2M）和CaCl2 （终浓度25mM），可看到纤维蛋白的产生；经滤纸过滤后，透析或层析过滤，缓冲体系为去离子水，超高速离心30min；弃上清，沉淀用1M NaCl，0. 1M Tris-HCl，pH8.0 溶液复溶，再经过透析或层析过滤更换缓冲体系；（二）亲和层析法1.基本原理：基因工程改造的protein A 和protein G 能特异性结合哺乳动物IgG 的Fc 区段，将protein A 和protein G 结合到柱料上，通过亲和层析的方式，可将IgG 及其亚类与片段纯化出来。

辛酸—硫酸铵沉淀法提取免疫球蛋白G一、实验目的：1、了解蛋白质纯化的基本技术；2、学习辛酸—硫酸铵法纯化抗体的方法。

二、实验原理：根据免疫球蛋白的性质利用生物化学各种纯化方法进行抗体的纯化，主要有常规生物化学和特异性亲和层析两类方法。

本实验采用辛酸—硫酸铵沉淀法从动物血清中纯化抗体，纯度和回收率较高，且抗体活性不被破坏；同时此方法操作简便、周期短、成本低、不需要复杂的仪器设备，不仅使用于小量抗体的纯化，也适合大批量抗体的制备。

三、实验材料试剂和器材：1、实验材料：兔血清。

2、试剂：乙酸-乙酸钠缓冲液、10×磷酸盐-NaCl缓冲液、透析液、5 mol/LNaOH、0.1mol/L NaOH。

3、器材：电磁搅拌器、离心机、透析袋。

四、操作方法：1、动物血清用4倍体积乙酸-乙酸钠缓冲液稀释，0.1mol/L NaOH调整血清稀释液pH至4.5。

2、室温下用电磁搅拌器边搅拌边缓慢滴加辛酸（加入量为1L血清稀释液加25ml），滴加完后继续搅拌30min。

3、离心（10000转/分，20分钟）,收集上清液，弃去沉淀，上清液用滤纸过滤除去悬浮物，量体积。

4、按照10%体积加入10×磷酸盐-NaCl缓冲液，用5 mol/LNaOH调pH至7.4。

5、上清液4℃预冷10min，测量溶液总体积，在4℃按277g/L缓慢加入硫酸铵粉末（终浓度达到45%饱和度），边加边搅拌，加完后继续搅拌30min。

6、离心（5000转/分，15分钟）,弃去上清液，收集沉淀。

7、沉淀用少量透析液溶解（一般为原血清体积的1/10），透析并更换两次透析液。

8、透析后的抗体溶液在50～55℃水浴中加热20min，离心（5000转/分，20分钟）,上清液于-20℃保存。

免疫球蛋白G提纯方法的研究进展李登亮;伊淑帅;郭衍冰;刘宏凯;牛江婷;董国英;胡桂学【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2018(054)012【总页数】3页(P65-67)【作者】李登亮;伊淑帅;郭衍冰;刘宏凯;牛江婷;董国英;胡桂学【作者单位】吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;吉林省畜牧兽医科学研究院,吉林长春130022;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;北京师范大学全球变化与地球系统科学研究院,北京海淀100875;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118【正文语种】中文【中图分类】Q512.2免疫球蛋白(IgG)是血液中除白蛋白外最丰富的蛋白，由通过二硫键连接的两条轻链和两条重链组成，呈“Y”型。

免疫球蛋白(IgG)约占血液总免疫球蛋白的75%，并且是与体液免疫应答相关的主要免疫球蛋白[1]，作为参与机体对抗感染的主要分子，具有与病原体或毒素结合，激活补体，加强吞噬作用的杀伤作用，启动过敏反应和减轻移植器官排斥的能力，是临床应用中使用最广泛的免疫球蛋白[2-3]。

IgG 与其他免疫球蛋白相比，具有持续时间长、含量高、稳定性强等优点，一般情况下，通过对动物机体或动物性产品内特异性IgG 含量的测定，可判断该动物是否曾患有相关疾病或其产品是否合格，这在动物的出入境检验检疫及其产品的质量评价中应用十分广泛，因此IgG 的分离纯化倍受关注。

本文对不同的血清IgG 提纯工艺进行了详细的阐述与比较，以期为IgG 生产工艺的改良提供理论参考。

1 免疫球蛋白的粗提1.1 有机溶剂沉淀法目前，有机溶剂沉淀法是一种被广泛应用于蛋白质制剂生产的提纯方法，其中，低温乙醇沉淀法是生产中应用最为广泛的一种方法，也是WHO 规程和中国生物制品规程推荐用的方法。

第24卷第4期 阜阳师范学院学报(自然科学版) V o l.24,N o.4　2007年12月 Journal of Fuyang T eachers Co llege(N atural Science) D ec.2007辛酸沉淀2凝胶过滤法提取猪血清Ig M刘生杰1,2,周　杨1,朱茂英1,聂传鹏1,李东伟1,余为一2 (1阜阳师范学院生命科学学院,安徽阜阳　236041;2安徽农业大学生命科学学院,安徽合肥　231072)摘　要:使用辛酸沉淀2凝胶过滤法提取猪血清中免疫球蛋白Ig M,并通过其纯度鉴定等探讨提纯效果.通过辛酸沉淀法粗提免疫球蛋白,再结合Sephadex G200凝胶过滤法纯化获得Ig M,利用SD S2PA GE电泳法和A lphaEaseFC凝胶成像分析软件测定其分子量和纯度、B radfo rd法测定提取蛋白浓度并计算其得率.结果显示辛酸粗提能够去除大部分杂蛋白,凝胶过滤获得两个洗脱峰,其中第一峰通过电泳鉴定含有Ig M,纯度63.8%,得率1.28m g m l血清.利用辛酸沉淀2凝胶过滤法能够获取纯度和得率都较高的Ig M,纯度可满足普通要求的实验和应用.关键词:猪血清;免疫球蛋白M(Ig M);提取;纯化中图分类号:Q81;S85 文献标识码:A 文章编号:100424329(2007)0420022204 猪血清中免疫球蛋白Ig M是猪感染免疫初期首先应答的免疫球蛋白,它的含量高低能反映猪的感染状况和免疫抗性高低,分离纯化Ig M可用于相应疾病的早期诊断和免疫学研究[1].虽然Ig M的分离和纯化方法有很多种,包括各种沉淀法和层析法,但由于猪的血清中含有很多杂蛋白,采用一步纯化法不可能得到纯度较高的Ig M抗体[2].经典的方法多采用硫酸铵分部盐析后凝胶过滤,硫酸铵具有溶解度大且随温度变化小,价格低廉等优点[3],但由于硫酸铵盐析步骤多、损失大,Ig M在血液中含量本来就低,所以探索其他更为便捷的方法是大量获得Ig M 的共同愿望.文章通过辛酸沉淀法和凝胶过滤法纯化猪血清中Ig M抗体,试图在获取高纯度、高得率Ig M的同时对Ig M纯化方法作初步探讨.辛酸为短链脂肪酸,辛酸沉淀法原理是在酸性条件下辛酸可沉淀腹水和血清中的非Ig蛋白[4]　.而凝胶过滤法主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子具有不同的排阻效应实现的.对于某种型号的凝胶,一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外,只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外;而一些小分子不被排阻,渗透进入凝胶内部的筛孔,尔后又被流经的洗脱液带走;中等大小的分子只能进入一部分凝胶较大的孔隙,因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间.这样待分离样品经过层析后,分子便按照从大到小的顺序依次流出,达到分离不同分子量物质的目的[5].1　仪器与试剂1.1　仪器高速离心机,透析袋,玻璃层析柱(1c m×100 c m),层析系统,核酸蛋白检测仪(W Z29021型),电泳槽,摇床,分光光度计,Eppendo rf移液器,磁力搅拌器,震荡器,电泳仪(北京君义)、A lp haEaseFC凝胶成像分析系统.1.2　试剂乙酸,乙酸钠,辛酸,Sephadex G200,T ris,丙烯酰胺,甲叉双丙烯酰胺,SD S,甘氨酸,过硫酸铵,甲醇,冰醋酸,考马斯亮蓝R2250,B radfo rd试剂盒, PB S(pH7.2～7.4).2　材料与方法2.1　材料猪新鲜血液(采自阜阳市颖南屠宰场)2.2　方法2.2.1　常规方法制备血清.2.2.2　Ig M的粗提收稿日期:2007209211基金资助:国家自然基金项目(30671537);安徽省教育厅教学研究项目(2007jyxm345);阜阳师范学院自然科学青年项目(2003YQL08).作者简介:刘生杰(1971-),男,硕士,讲师,兽医师.研究方向:动物学、动物免疫学. 辛酸沉淀法[6],有改进.取10mL 血清,加40mL 乙酸2乙酸钠缓冲液磁力搅拌稀释,用0.1m o l L N aoH 调节pH 至4.5.室温下边搅拌边缓慢加入辛酸1.25mL 按辛酸25ΛL mL 血清稀释液),加后继续搅拌30m in .以13000r m in 的转速离心30m in ,弃沉淀,留上清.上清用多层纱布过滤,装入透析袋中透析,每8～10h 和换一次透析液,透析48h .2.2.3　Ig M 的纯化采用Sep hadex G 200凝胶过滤法[7].2.2.3.1　凝胶预处理[8]称取5g Sep hadex G 200,加入50mL 去离子水,浸泡溶胀24h ;倾去Sep hadex G 200溶胀后凝胶上层的水,再加入凝胶等体积的1.0m o l L N aOH 液并轻轻搅动,浸泡1h 后倾去上清;用去离子水反复洗涤3～5次,倾去悬浮的细小凝胶颗粒,并使凝胶悬液pH 至中性;将Sephadex G 200凝胶悬液盛放于抽滤瓶中,用洗耳球塞住杯口,减压抽气30m in ,除去凝胶液内气泡,将脱气后的凝胶溶液轻轻倒入烧杯中,其中盛有1 2去离子水.2.2.3.2　装柱取干净层析柱(51c m ×100c m ),上、下端连接塑料管并装上螺旋夹,将层析柱垂直装于铁架台上,并多角度校正使柱垂直;打开柱上、下端口,从柱底向柱内注水至柱高1 4,使柱底全部充满水而不留气泡,关闭柱出口,最终柱内留存2c m的水;旋开柱的上口,搅动凝胶溶液,使形成均一的薄胶浆,并立即沿玻棒倒入层析管内,使凝胶在柱内自然沉降,待柱底积起约1～2c m 的凝胶床后,打开柱出口调节流速;同时上面不断加入凝胶液,使凝胶连续沉降(如果凝胶床面上不再有凝胶沉降,应该用玻棒均匀地将凝胶床搅起数厘米高,然后再加凝胶,不然就会形成界面,影响层析效果),最终柱床高度约70c m .连接层析系统(自动部分收集器,紫外检测仪,记录仪)并打开电源预热,调解水流速度约0.2mL m in ,平衡洗脱.2.2.3.3　加样、洗脱与收集在柱床表面放一张大小适合的滤纸,以防止加样时冲动柱床面.小心吸去柱床面以上洗脱液,或打开下端出口让柱床面上的洗脱液刚好完全进入凝胶床.立即沿管壁将2mL 辛酸沉淀透析液小心加到凝胶柱中,让样品溶液自然降入柱床内.当样品液面恰好与凝胶床表面相平时,再加入4mL 洗脱液淋洗管壁,使所有样品全部进入凝胶床后,接通层析柱与洗脱液储瓶之间的导管,以0.25mL m in 流速洗脱.1h 后开启自动部分收集器,按2mL管收集.2.2.4　蛋白质分子量与纯度鉴定SD S 2PA GE 法[9].采用10%的分离胶、5%的浓缩胶,分别按顺序向加样孔中加样.用A lphaEaseFC凝胶成像分析软件对电泳图片处理分析鉴定分子量和蛋白纯度.2.2.5　蛋白浓度测定及得率计算采用B radfo rd 法测定纯化蛋白浓度,并依据蛋白稀释度还原计算提纯蛋白得率.2.2.5.1　样品配制标准蛋白B SA (牛血清白蛋白)配制与检测样品准备(表1)按试剂盒步骤进行.表1　测定样品液配制样品名样品量(ul )PBS (ul )Comm assie (m l)To tal (m l )血清-1:64501002.853.00辛酸-1:5501002.853.00凝胶第一峰501002.853.00凝胶第二峰501002.853.002.2.5.2　吸光度测定使用分光光度计测定595nm 波长时标准蛋白B SA 和测定样品吸光度值,并根据B SA 标准蛋白吸光度值对其浓度绘制标准曲线,再由标准曲线计算测定样品的浓度.2.2.5.3　蛋白浓度与得率计算由测定样品浓度按原蛋白稀释度还原计算提取蛋白得率.3　结果3.1　凝胶层析凝胶层析获得两个洗脱峰,两峰基本分开但有部分重叠(图1).图1　凝胶层析洗脱曲线3.2　分子量与纯度鉴定SD S 2PA GE 电泳结果见图2.32第4期 刘生杰等:辛酸沉淀2凝胶过滤法提取猪血清Ig M图2　提纯蛋白电泳图1.血清2.辛酸沉淀上清3.凝胶第二峰4.凝胶第一峰5.蛋白M arker 3.2.1　Ig M分子量测定A lphaEaseFC凝胶成像分析软件测定图2第4泳道条带1、2分子量分别为75kD、26kD,和Ig M重链、轻链分子量一致,故判断为Ig M经还原剂还原后产生的重链和轻链;第3泳道条带3、4分子量分别约57kD、26kD,分别和IgG重链、轻链一致,故判断其为IgG经还原后形成的重链和轻链[10].3.2.2　纯度测定对图2中2、4泳道用A lphaEaseFC凝胶成像分析软件计算得辛酸沉淀上清中Ig M(2泳道)纯度9.5%;凝胶过滤纯化的Ig M(4泳道)纯度63.8%.3.3　浓度与得率测定3.3.1　B SA标准液吸光度值纪录与标准曲线绘制B SA标准液吸光度值纪录见表2,标准曲线绘制见图3.表2　BSA标准液吸光度值管号0123456BSA吸光度值0.000.1000.1920.2830.3840.4900.594浓度(m g m l)00.0033340.0066670.010.0133340.0166670.02图3　标准液浓度与吸光度曲线3.3.2　测定样品吸光度值纪录与得率计算结果,见表3.表3　免疫球蛋白得率及浓度测定结果凝胶层析洗脱峰凝胶第1峰凝胶第2峰测定蛋白吸光度值0.0530.096测定蛋白浓度m g mL0.00190.0034蛋白原液中浓度m g mL0.1140.204蛋白得率m g mL血清1.289.184　分析与讨论4.1　辛酸沉淀与硫酸铵盐析提取Ig M效果比较实验结果表明辛酸沉淀猪血清能去除血清中免疫球蛋白外大部分杂蛋白,能为进一步纯化Ig M提供粗提物,笔者多次试验证明,此法粗提Ig M要比经典的硫酸铵分部盐析效果要好,硫酸铵盐析会因pH偏离Ig M等电点及步骤繁杂使含量本就很低的Ig M大量丢失,所以在分离提纯Ig M时,应避免采用硫酸铵沉淀.辛酸沉淀法药品价廉易得、操作简单、环境条件要求不高、快速方便,是个很好的免疫球蛋白粗提方法,但因离心速度(>10000rpm)要求较高而使推广会受到一定局限.4.2　凝胶层析的影响因素由凝胶层析洗脱曲线可见,两个层析峰重叠明显,重叠部分必然有IgG和Ig M混合.洗脱峰重叠严重的原因可能是上样体积过大,导致洗脱蛋白量超出凝胶的分离承载量,而使不同分子量蛋白不能充分分开,导致洗脱峰偏态分布,或者是多肩峰、多峰重叠等,一般100mL柱床加样122mL(1%22%).解决的办法是在分部收集时,应尽可能减少每管收集量,最后通过电泳确定纯度较高的纯化蛋白后再合42 阜阳师范学院学报(自然科学版) 第24卷并相应收集管,而不能仅凭经验未经纯度鉴定就合并同一洗脱峰,该实验纯化Ig M 纯度仅为63.8%的原因可能就是把整个第一峰全部收集合并的缘故;或收集第一峰时仅收集其上升支可使纯化蛋白的纯度大为改善,但这样会明显降低其回收率,该实验中纯化Ig M 回收率(1.28m g mL 血清)较高的原因可能也是含有了部分杂蛋白的缘故.洗脱时,洗脱液的流速受凝胶颗粒大小的影响,颗粒大时流速较大,但使用较大流速常使洗脱峰形态变宽;颗粒较小时流速较慢,分离效果较好.每一种凝胶均有最适宜的流速,一般选择厂家建议的流速或通过试验筛选适宜流速.4.3　提前免疫可提高Ig M 提取得率猪血清Ig M 是猪免疫应答早期分泌的免疫球蛋白,分泌量少、半衰期短,导致血液中含量较低,所以要想获得较多Ig M 应该提前对猪进行人工免疫,一周后采血提取纯化.总之,文章为Ig M 纯化作了相应方法探索,采用辛酸沉淀-凝胶过滤法初步纯化获得了较高纯度和得率的猪血清Ig M ,对于纯度要求不高的实验与应用能够基本满足要求.参考文献[1]　陈　飞,秦爱建,姚永华,等.猪Ig M 单克隆抗体的研制与鉴定[J ].动物科学,2005,7:829.[2]　刘生杰,余为一.免疫球蛋白IgG 和Ig M 分离纯化技术现状与展望[J ].阜阳师范学院学报(自然科学版),2006,23(3):26231.[3]　罗　垒,朱雅东,丁霄霖.聚丙酰胺凝胶电泳研究猪血清蛋白硫酸铵分级盐析J ].食品科学,2006,27(2):2182222.[4]　M cK inney MM ,and Park inson A .A si m p le ,non -ch rom atograph ic p rocedure to purify i m m unoglobulins from serumand ascites fluid [J ].J I mm uno lM eth ,1987,96:2712278.[5]　杨健雄.生物化学与分子生物学实验技术教程[M ].北京:科学出版社,2002,5:85288.[6]　M ichella MM m ,A ndrew P .A si m p le ,non 2ch rom atog raph ic p rocedure to purify i m m unoglobulins from serum and as 2cites fluid [J ].Journal of I mm uno logicalM ethods ,1987,96:2712278.[7]　王秀奇,秦淑媛,高天慧,等.基础生物化学实验[M ].北京:高等教育出版社,1999,6:2362241.[8]　杨健雄.生物化学与分子生物学实验技术教程[M ].北京:科学出版社,2002,5:1132114.[9]　陶钧辉,陶　力,李　俊,等.生物化学实验[M ].3版.北京:科学技术出版社,2005,4:1102114.[10]　章金钢,钱爱东,丘鹤英,等.猪的免疫学基础[J ].中国兽医杂志,1997,23(3):51253.Pur if ica tion and Iden tif ica tion of Ig M from Sw i ne Seru mL I U Sheng 2jie 1,2,ZHOU Yang 1,ZHU M ao 2ying 1,N IE Chuan 2peng 1,L I Dong 2w ei 1,YU W ei 2yi2(1.S chool of L if e S cience ,F uy ang T eachers Colleg e ,F uy ang ,A nhu i 236041,Ch ina ;2.S chool of L if e S cience ,A nhu i A g ricu ltu re U niversity ,H ef ei ,A nhu i 231072,Ch ina )Abstract :Purify the i m m unoglobulin M (Ig M )from s w ine serum w ith the cap rylic acid p reci p itati on 2the SepherdaxG 200gelatin filters and app roach the purifying effect by identifying its purity .T he experi m ent com bines the cap rylic acid p re 2ci p itati on m ethod and the Sepherdax G 200gelatin filters to purify Ig M .T hen the mo lecular w eigh t and purity of Ig M are de 2ter m ined by SD S 2PA GE and A lphaEaseFC analysis softw are ,and the yield of Ig M is calculated acco rding to the p ro tein con 2centrati on deter m ined by B radfo rd k it .T he cap rylic acid p reci p itati on can eli m inate the bulk of p ro teins w h ich are no t Ig M .Tw o eluting peak s are abtained in the p rocess of purificati on Ig M by the Sepherdax G 200gelatin filters.T he purity of Ig M w h ich is only in the first eluting peak is 63.8%and the yield is 1.28m g m l serum .T he experi m ent can get h igh purity and yield of Ig M by the cap rylic acid p reci p itati on m ethod and the Sepherdax G 200gelatin filters.T he Ig M purified from s w ine serum in th is experi m ent can m eet the need of the experi m ents and the app licati ons ,in w h ich the requirem ent of purity is no t h igh .Key words :s w ine serum ;i m m unoglobulin M (Ig M );extract ;purify52第4期 刘生杰等:辛酸沉淀2凝胶过滤法提取猪血清Ig M。