质粒dna的酶切注意事项

酶切

DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。

DNA酶切及凝胶电泳

一.DNA的限制性内切酶酶切分析

限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。

5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'

3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5' DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。

一、实验目的

1、掌握PCR基因扩增的原理和操作方法；

2、掌握碱裂解法提取质粒的方法；

3、了解紫外吸收法检测DNA浓度和纯度的原理、方法；

4、学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作。

二、实验原理

1.PCR：

PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA的过程。

①延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链；

②变性：加热使模板DNA在高温下90℃-95变性，双链解链；

③退火：降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。

2. 质粒DNA的提取与定量——碱裂解法：

A、基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异；

B、高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性；

C、当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉沉淀去除。

D、定量检测原理：物质在光的照射下会产生对光的吸收效应；

而且物质对光的吸收是具有选择性的；

各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱。

3.酶切鉴定：利用限制性内切酶。

4、琼脂糖凝胶电泳：

A、琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度；

B、DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动；

C、DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系)。

三、材料与方法：

(一)、材料

1、样品：

菌液(大肠杆菌DH5a菌株)、引物、2*Premix Taq、灭菌离子水、含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5α

1 DNA的酶切原理试剂和方法步骤 摘要: DNA重组技术的第一步是从不同来源的DNA上将待克隆的DNA片段特异性切下，同时在载体DNA分子（一般为质粒DNA）上打开相应的缺口，然后将两者连接成重组DNA分子。这一特异性的切割过程常由特定的限制性核酸内切酶来完成。目前在细菌中发现有600多种限制性核酸内切酶 …… 关键词: DNA 酶切 一、实验原理 DNA重组技术的第一步是从不同来源的DNA上将待克隆的DNA片段特异性切下，同时在载体DNA分子（一般为质粒DNA）上打开相应的缺口，然后将两者连接成重组DNA分子。这一特异性的切割过程常由特定的限制性核酸内切酶来完成。 目前在细菌中发现有600多种限制性核酸内切酶，根据其性质的不同可分为三大类，分别为I、II和III类：I类酶识别部位和切点不同，切断部位不定；III类酶的识别部位和切点不同，但切断特定部位；II类酶切断识别部位或其附近的特定部位，酶切后的双链DNA的末端是粘性末端，某些限制酶产生平末端。因此，应用于基因工程研究用的限制酶，一般全是II类酶，现在市场上销售的酶都属于II类酶。 二、实验试剂 DNA样品（基因组和胆盐水解酶基因连接T载体的重组质粒），限制性内切酶，酶切缓冲液（购酶时附），无菌双蒸水。 2 单酶切质粒和基因组体系 酶切体系 目的片段 质粒载体 10×Buffer 2μL 2μL

DNA 5μg 1μg EcoRI 1μL 1μL ddH2O 补齐20μL 补齐20μL 五、实验注意事项 反应温度：常规酶切反应在37℃进行，但有些酶的最佳反应温度并不是此温度，如SmaI，最适反应温度为30℃，故最好根据所选用的酶来确定反应温度。当采用联合酶切进行实验时，尤其要注意选择的反应温度是否都满足两者的要求，如果有一个酶的最适温度不符，建议分步酶切。 缓冲体系：按盐离子浓度可将缓冲溶液分为三类：高盐、中盐和低盐。缓冲液配制为10×母液，酶切时稀释10倍。常规酶切中均选用最佳缓冲液进行酶切反应，但联合酶切时，根据厂商提供的联合酶切缓冲液选择表选择缓冲液或采用万能缓冲液。 3 反应时间：常规酶切反应时间为1.5 小时，但可根据酶切对象和酶的用量将保温时间延长2～3 小时，有时甚至可以过夜。一般来说，在DNA 量固定的前提下，长时间酶切所需的酶量可适当减少，所以在大剂量酶切DNA 时，可以考虑酶切过夜。 加入酶量：实验中常常出现酶量加入过多酶切效果反差的现象，这主要是酶的贮存液中含有50％的甘油，但酶量加入过多，超过酶反应体系的10％时，过多的甘油抑制了限制性内切酶活性。因此，在酶切反应时，酶量的加入原则：不超过反应总体积的10％，在能切开的条件下加入越少越好（可减少酶的Star 活性）。 DNA 纯度：DNA样品中常含有蛋白含量过高、有机溶剂（苯酚或氯仿）残留、高浓度的RNA 等杂质影响酶切；DNA 浓度过高会导致酶切失败，一般DNA 的质量浓度在1μg/μl 体系中能取得好的酶切效果。当发生不明原因的酶切失败时，常用的解决方法是采用稀释酶切，即将酶切体系放大，将杂质相对浓度稀释，这样不需增加酶量就能取得较好的酶切效果。

实验五 质粒DNA的微量提取及酶切鉴定

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质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的环形双链DNA分子。

一、质粒DNA的提取，它们都包括三个基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增；菌体的收集裂解；质粒DNA的分离和纯化。

1、细菌的生长和质粒的扩增

从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。对于高拷贝的质粒（pUC系列）来说，只要将培养物放到标准的LB或TB培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒DNA。但对于拷贝数较低的质粒（如pBR322）来说，则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩增。因为氯霉素可以抑制宿主菌的蛋白质合成，从而阻止了细菌染色体的复制，但是质粒则仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续上升。

（问题：提取质粒时，对于不同拷贝的质粒，应如何进行细菌的培养？为什么？）

2、细菌的收集、裂解和质粒DNA的分离

细菌的收集可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采取多种方法，包括用非离子型去污剂、有机溶剂 或 碱处理 及 加热处理 等。

质粒分离的基本原理是利用宿主菌（一般是大肠杆菌菌株）DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异：

a.大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA大得多。

b.从细胞中提取得到的大肠杆菌DNA主体是变性的线性分子，而大多数质粒DNA是共价闭合的环状分子。

利用溶菌酶和加热处理的方法，使细菌的线状染色体DNA变性，通过离心，可以使染色体DNA和变性蛋白质、RNA分子一起沉淀下来，而质粒分子仍留于上清中。

问题1：某些大肠杆菌的菌株不能用加热的方法裂解。

（1）易产生多糖的如大肠杆菌菌株，如HB101和TG1等。尤其是HB101的一些变种和衍生物，在用去污剂或加热裂解时可释放处相对大量的糖，从而影响质粒的纯化，抑制多种限制性内切酶的活性。

（2）表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株（endA+），如HB101。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在Mg2+存在下温育（如用限制酶消化）时，质粒DNA会被降解。但通过一个附加步骤（用酚：氯仿进行抽提）可易避免此问题。