ngs杂交捕获原理

pcr-ngs原理
PCR-NGS (Polymerase Chain Reaction - Next Generation Sequencing) 是一种结合了PCR技术和高通量测序技术的方法，用于对DNA或RNA样本进行大规模测序。

PCR-NGS的主要步骤如下：
1. DNA扩增：首先，使用PCR技术对DNA样本进行扩增。

PCR使用DNA聚合酶，引物和dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）来选择性地扩增目标DNA序列。

PCR的扩增过程包括反复进
行变性（DNA双链解开），引物结合和扩增（DNA合成）。

2. DNA片段准备：扩增得到的DNA片段会被切割成短片段，通常长度为200-600碱基对。

这些片段之后会被连接到DNA
片段适配器上。

3. DNA库构建：将连接上适配器的DNA片段进行纯化和富集，以去除未连接的适配器和剩余的引物。

4. 测序：准备好的DNA库会被加载到测序平台上，如
Illumina或Ion Torrent等。

在测序过程中，DNA片段会通过序列化反应产生荧光信号，这些信号会被靶向测序仪器检测和记录。

5. 数据分析：测序仪器获得的原始序列数据将通过生物信息学分析进行处理，包括序列拼接、去除低质量碱基、去除适配器序列以及比对到参考基因组等步骤。

最后，通过与参考序列比
对，识别和注释样本中的基因变异。

PCR-NGS技术组合了PCR的高特异性和高敏感性以及NGS 的高通量测序能力，可以广泛应用于基因组学、转录组学、表观遗传学等领域的研究和疾病诊断中。

二代测序之杂交捕获写在前面：本次更新主要介绍文库构建完成后对目标文库的富集方法——“杂交捕获法”，这一期小编将重点介绍杂交捕获法的实验流程及其作用。

1.为什么进行杂交捕获？在文库构建完成后，若是做全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS），可直接将构建好的文库按照一定的浓度、测序深度、数据量进行上机测序即可。

但在实际的操作中，由于人的基因组中存在大量丰富的重复DNA序列，且考虑到测序成本的问题，所以通常会进行靶向测序，即选择我们需要的区域进行测序，比如全外显子测序（Whole-exome sequencing，WES），或者针对肿瘤患者设计的特定的Panel测序等（一个Panel指包含所有探针的一个集合，eg：一个Panel里包含200个探针，200个探针的集合就是一个Panel）。

那么如何获得所需的目标区域或者靶序列呢？就需要探针与靶序列进行杂交，然后再通过捕获杂交片段的方法进行目标区域的富集。

2. 实验流程&作用2.1 杂交准备杂交需要投入的原料：①一定量的文库：可以是一个文库或者多个文库，多个文库的话可根据不同的接头序列区分每个样本；②Human Cot DNA：封闭大量重复的DNA序列，避免非特异性杂交；③Universal Blockers：封闭接头序列，避免非特异性杂交；④不同的Panel：生物素标记的探针，主要负责与靶序列杂交；⑤杂交Buffer、杂交Enhancer、NF水等（图中未展示）；注：杂交原料进行杂交时，由于杂交体积限制，都会进行体积浓缩，常用到的是采用真空浓缩的方法；此外还有磁珠法浓缩；针对不同的浓缩方法，各种杂交原料的加入顺序有一定的差异。

真空浓缩法：①+②+③→真空浓缩→+④+⑤→杂交。

磁珠浓缩法：①+②+④→磁珠浓缩→+③+⑤→杂交。

真空浓缩法在小Panel杂交的过程中表现比磁珠浓缩法较好，但磁珠浓缩法更简便快捷，成本更低。

2.2 杂交95℃将文库变性为单链状态；65℃进行杂交；注：A&C：表示探针与靶序列杂交；B&D表示未杂交。

NGS系列讲座——NGS基本原理在当今的生命科学领域，NGS（NextGeneration Sequencing，下一代测序）技术正以惊人的速度发展，并为我们理解生命的奥秘提供了强大的工具。

那么，什么是 NGS 呢？它的基本原理又是怎样的呢？NGS 技术其实就是一种能够同时对大量 DNA 或 RNA 分子进行测序的方法。

传统的测序技术一次只能对一个 DNA 片段进行测序，效率较低，而 NGS 技术则实现了高通量、大规模的测序，大大提高了工作效率，降低了成本。

要理解 NGS 的基本原理，首先得从 DNA 测序的基本概念说起。

我们知道，DNA 是由四种碱基——腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）组成的。

测序的目的就是要确定这些碱基的排列顺序。

在 NGS 中，大致的流程可以分为以下几个主要步骤：第一步是样本制备。

这包括从生物样本（比如血液、组织等）中提取 DNA 或 RNA。

提取出来的核酸还需要进行一系列的处理，比如片段化，将长长的 DNA 或 RNA 分子切成适合测序的小片段。

接下来是文库构建。

这一步就像是给这些小片段打上标签，添加特定的接头序列，以便后续能够被识别和处理。

然后是测序反应。

在这一环节，不同的 NGS 技术可能会采用不同的方法，但总的来说，都是通过某种方式让 DNA 片段进行扩增，并在这个过程中检测碱基的信息。

比如说，Illumina 测序技术是目前应用非常广泛的一种 NGS 技术。

它的原理是基于边合成边测序的方法。

在测序过程中，DNA 片段会被固定在芯片上，然后加入带有荧光标记的核苷酸。

当一个核苷酸与模板链配对成功并被掺入到新合成的链中时，会发出特定颜色的荧光，通过检测这种荧光信号，就能确定掺入的是哪种碱基。

再比如 Ion Torrent 测序技术，它的原理是基于检测氢离子的释放。

当核苷酸掺入到新合成的 DNA 链中时，会释放出氢离子，通过检测氢离子的变化来确定碱基的类型。

杂交捕获化学发光法原理杂交捕获化学发光法，是一种高灵敏度检测分子间相互作用的技术。

该技术主要应用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸等生物大分子间相互作用的研究，为生物医学及药物研发提供了有力支持。

一、什么是杂交捕获化学发光法？杂交捕获化学发光法是一种基于免疫学原理的技术，其基本思想是将两种在相互作用中的生物大分子捕获在一起，通过化学原理引发化学发光反应，从而获得极高的检测精度。

二、杂交捕获化学发光法的原理下面我们将从样品制备、杂交、洗涤、发光等几个方面，简单阐述杂交捕获化学发光法的原理。

1.样品制备首先需要制备标准物质以及待测样品。

标准物质一般选用可以与待测样品中的分子发生特异性结合的分子，例如抗体、配体等。

待测样品应当与标准物质具有足够的差异性，通常选用由其它杂交实验或基因组学技术分离出的富含目标分子的纯化物。

2.杂交将标准物质与待测样品混合，然后加入带有化学光亮染料的检测试剂盒中，充分混合后孵育一段时间，促使它们相互结合。

在杂交过程中，如果标准物质与待测样品中的分子能够准确匹配，就会形成稳定的复合物，从而引发后续的发光反应。

3.洗涤杂交完成后，需要对反应体系进行洗涤，用洗涤缓冲液去除残留的非特异性结合物和未发生反应的试剂，以提高检测的准确性和灵敏度。

4.发光当样品和试剂结合成复合物之后，利用化学反应引发发光。

这种化学反应基于两个酶的催化作用：辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP）。

在化学反应过程中，HRP催化蒴香酮衍生物的氧化反应，生成具有强荧光的中间体。

然后，ALP催化一种叫做Attophos的化学发光底物，使其发生化学反应，产生强烈的荧光信号。

这个化学反应式可以表示为：luminescent substrate + ALP → luminescence（发光底物＋碱性磷酸酶→发光）。

三、杂交捕获化学发光法的应用杂交捕获化学发光法技术在现代生物医学及药物研发中具有广泛的应用。

主要应用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸等生物大分子间相互作用的研究，为生物医学及药物研发提供了有力支持。

ngs 原理NGS（Next Generation Sequencing）是新一代测序技术的缩写，是一种高效、高通量的DNA测序技术。

NGS技术的原理是将DNA样本分离成许多小片段，然后同时进行大规模的并行测序。

通过这种方式，NGS技术能够在较短的时间内获得大量的DNA测序数据。

NGS技术的原理主要包括DNA文库构建、片段扩增、测序和数据分析等步骤。

首先，需要将DNA样本进行处理，使其适合用于测序。

这包括DNA的纯化、断裂、末端修复和连接等步骤。

接下来，通过PCR扩增的方式将DNA片段进行放大，以便进行后续的测序。

在测序过程中，NGS技术采用不同的方法，如Illumina测序、Ion Torrent测序等，来测定DNA片段的碱基序列。

最后，通过数据分析软件对测序结果进行处理和解读，从而获得DNA样本的完整序列信息。

相比传统的测序技术，NGS具有许多优势。

首先，NGS技术具有高通量的特点，能够在较短的时间内获得大量的测序数据，从而提高测序效率。

其次，NGS技术具有高灵敏度，能够检测到低频突变和低拷贝数的DNA序列，对于疾病的早期诊断和基因变异的检测具有重要意义。

此外，NGS技术还具有较低的成本，使得大规模的基因组测序成为可能，为研究人员提供了更多的数据资源。

NGS技术的应用非常广泛。

在医学领域，NGS技术可以用于疾病的诊断和治疗。

通过对病人的基因组进行测序，可以发现潜在的致病基因和药物靶点，为个体化医疗提供依据。

在生物学研究中，NGS技术可以用于基因组学、转录组学、表观基因组学等研究领域。

通过对不同生物体中基因组的测序，可以揭示基因的组成和结构，探索基因的功能和调控机制。

此外，NGS技术还可以用于环境监测、农业科学和人类进化等方面的研究。

尽管NGS技术具有许多优势，但也存在一些挑战。

首先，NGS技术在测序过程中会引入一定的误差，如测序错误和放大偏差等。

这些误差对于数据的准确性和可靠性有一定影响，需要通过数据分析和校正来解决。

全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。

随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。

什么是高通量测序？高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变, 一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。

什么是Sanger法测序（一代测序）Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。

直到掺入一种链终止核苷酸为止。

每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。

由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。

终止点由反应中相应的双脱氧而定。

每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。

它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

什么是基因组重测序（GenomeRe-sequencing）全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。

随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。

通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。

【原创】三种NGS技术的科普介绍illumina、roche、ABI转载于丁香园（苏格兰战士）【illumina & solexa公司】高通量测序原理并行合成测序技术Sequencing-By-Synthesis(SBS)可逆末端终结技术 Reversible Terminator Chemistry新技术：Two-Channel SBS技术原理：样品准备：将待测DNA(基因组DNA or 许多条DNA)用雾化或超声波随机切断成许多DNA短片段文库制备(mate-pair lib,MP)：用聚合酶和外切酶把DNA片段切成平末端，磷酸化并增加一个核苷酸黏性末端。

在片段DNA两端连上接头(ligation)，制成DNA文库(mate-pair libraries)PCR扩增：(芯片有8个纵向泳道(lane)的硅基片。

每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。

)带接头的DNA片段变性成单链后与含有接头(单链引物)的芯片(flow cell)杂交，DNA两端接头互补匹配到芯片上的接头，形成"桥"。

进行30轮桥式扩增，形成单克隆DNA簇(cluster generation)，是为了保证信号强度。

簇形成后，使模板"桥"线性化(切断一个接头与芯片的连接)，并用ddNTP阻断模板测序/图像采集：加入4种有阻滞基团和不同荧光标记的dNTP。

这些dNTP是"可逆终止子"，3'羟基带有可化学切割的阻滞基团，使每个循环只能掺入单个碱基。

清除未反应的dNTP和试剂，此时用激光扫描芯片，读取每条模板第一轮聚合上去的核苷酸种类(拍摄4幅颜色的图像，新技术Two-Channel只需拍摄2幅图像)。

接着将这些阻滞基团和荧光基团切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸。

如此循环，记录每个循环的荧光信息，最后得到序列信息（怎么切？什么试剂？）数据分析：将各DNA片段的序列拼接起来，组成完整DNA的序列测序仪：GA, MiSeq, NextSeq, HiSeq指标：output: 1Gb～1Tb (output = reads * read length)run time: 5h～5dreads/flow cell: 25*10e6～2*10e9read length:2*150～2*300bp(双末端测序，两端测序长度相同) flow cell: 1 or 2barcode: 24seq depth: 30X(10 human genomes)产品越先进 reads越多 output越多 read length越短早期产品通量低时间短 -- 目标基因小基因组测序后期产品通量高时间长 -- 全基因组人群规模测序【Roche & 454公司】一个片段(fragment) = 一个磁珠(bead) = 一条读长(read)焦磷酸测序 Pyrosequencing技术原理：1.样品输入并片段化：大的样品如基因组DNA或BAC等利用超声或氮气雾化打断，然后采用琼脂糖凝胶电泳回收或磁珠纯化，选择300-800bp的DNA片段；对于小分子的非编码RNA或者PCR产物，这一步则不需要。

杂交捕获原理
杂交捕获原理是一种基于DNA序列的检测技术，其基本原理是通
过使用一组特定的引物来放大目标DNA区域，并从样品中捕获与引物
互补的DNA片段，然后对其中的DNA序列进行分析和鉴定。

这种技术
广泛应用于生物学、医学和生态学领域。

在杂交捕获技术中，首先需要设计一组特异性引物，以放大目标DNA区域。

然后将这些引物与样品中的DNA混合，在PCR反应中使其扩增。

在反应过程中，引物会选择性地放大与其互补的DNA片段，因此
只有目标DNA区域才能够被扩增。

接下来，使用杂交捕获探针，比如生物素标记或荧光标记的探针，来捕获PCR扩增产物中与引物互补的DNA片段。

探针能够与PCR产物
发生强烈的互补结合，并通过一系列洗涤和选通步骤，将非特异性DNA 片段去除，最终留下互补的、目标区域的DNA序列。

这些DNA序列可
以通过测序等方法进行分析和鉴定。

杂交捕获技术的应用十分广泛。

在生物学领域，它可以用于检测
针对特定基因的突变、单核苷酸多态性等；在医学领域，可用于肿瘤、遗传性疾病等疾病的诊断和治疗；在生态学领域，可以用于研究物种
多样性和演化等方面的问题。

杂交捕获测序技术杂交捕获测序技术是一种用于研究基因组的高通量测序方法。

它能够快速、准确地揭示基因组中的DNA序列，为研究人员提供了大量的基因组信息。

本文将介绍杂交捕获测序技术的原理、应用和未来发展方向。

一、杂交捕获测序技术的原理杂交捕获测序技术是通过使用特异性探针来捕获感兴趣的DNA片段，然后进行高通量测序和分析的方法。

其原理主要分为以下几个步骤：1. 探针设计：根据研究需要，利用计算生物学方法设计特异性的探针，用来捕获目标DNA片段。

这些探针通常由寡核苷酸序列构成，可以与目标DNA片段特异性结合。

2. 样本处理：将待测样本DNA进行处理，如酶切、文库构建等，以获得适合测序的DNA片段。

3. 杂交反应：将探针与待测样本DNA进行杂交反应。

在适当的条件下，探针与目标DNA片段结合形成稳定的杂交复合物。

4. 探针富集：通过一系列的杂交后处理步骤，如洗脱、纯化等，将杂交复合物从杂交液中富集出来。

这样可以大大提高目标DNA片段的测序深度和准确性。

5. 高通量测序：对富集的目标DNA片段进行高通量测序，如Illumina、Ion Torrent等平台。

通过测序仪器的高效测序能力，得到大量的DNA序列信息。

6. 数据分析：对测序得到的数据进行处理和分析，包括序列比对、变异检测、功能注释等。

通过这些分析，可以揭示出目标DNA片段的序列信息和基因组结构等重要特征。

杂交捕获测序技术在基因组研究领域有着广泛的应用。

以下是一些常见的应用领域：1. 疾病基因组学：杂交捕获测序技术可以用于研究与疾病相关的基因和突变。

通过捕获和测序人类基因组中的特定区域，可以发现与疾病相关的突变、拷贝数变异等。

这对于疾病的诊断、治疗和预防具有重要意义。

2. 进化生物学：通过杂交捕获测序技术，可以对不同物种间的基因组进行比较和分析。

这有助于揭示物种间的进化关系、基因家族的演化和功能等。

3. 人类遗传学：杂交捕获测序技术可以用于研究人类基因组的遗传变异。

NGS肿瘤panel验证指南解读（二）：靶向NGS方法概述美国分子病理学学会（AMP）和美国病理学会（CAP）近日公布了基于二代测序（NGS）的肿瘤panels验证指南，以提高实验室测序结果的质量，为患者提供更好的临床医疗服务。

具体指南发表于《The Journal of Molecular Diagnostics》杂志上，包括了靶向测序方法和数据分析的概述、新检测方法的注意事项以及试验验证和质量控制指标的实施建议。

我们将对文章中的这4个方面进行解读。

靶向NGS方法概述总体上，靶向NGS方法包括四个主要部分：样品制备，文库构建，测序，数据分析。

样品制备临床肿瘤NGS分析的第一步是评估样本。

对于血液标本，肿瘤细胞含量可通过单独的分析来推断。

例如，通过外周血白细胞分类计数，或骨髓穿刺液流式细胞数据，可估计用于核酸提取的样本中肿瘤细胞的大致比例。

然而，对于实体肿瘤标本，则需要在进行NGS检测前由经过适当训练和认证的病理学家进行病理阅片。

阅片可确保样本的肿瘤类型与预期一致，且存在足够量且未坏死的肿瘤细胞用于NGS分析。

阅片可被用于标注手工刮取或显微切割（如通过解剖镜）的区域，从而富集肿瘤细胞，提高基因变异检测的灵敏度。

应该对肿瘤细胞比例进行估计，它在解释突变等位基因频率和拷贝数变异时提供了关键信息。

然而，对肿瘤比例的估计完全取决于对苏木精-伊红染色切片的观察，染色易受多种因素的影响，且不同阅片者之间存在显著的经验差异。

非肿瘤细胞，如炎性浸润和内皮细胞，通常小于肿瘤细胞，且与肿瘤紧密联结，可能以不明显的形式存在，导致对肿瘤比例的严重低估。

在严重炎症和坏疽的病例中，在估计肿瘤比例以及随后结合测序结果进行分析时，保持保守是非常重要的。

对这类病例的突变等位基因比例（包括沉默突变）进行回顾，将能够对肿瘤细胞纯度进行更精确的估计，并对后续所需的检测提供更为准确的结果和建议。

文库构建文库构建是指生成特定大小范围的DNA或cDNA片段的过程。