目标区域捕获测序 目标区域捕获文库制备

DNA捕获技术在基因组学中优势及挑战讨论DNA捕获技术（DNA capture）是一种常用于基因组学研究的方法，它能有效地高通量捕获特定DNA片段，用于测序和分析基因组中的关键区域。

这种技术的出现，为研究人类遗传变异以及其他物种的基因组变异提供了强有力的工具。

本文将探讨DNA捕获技术在基因组学中的优势，并讨论它所面临的挑战。

DNA捕获技术的优势主要体现在以下几个方面：1. 高效捕获特定DNA片段：DNA捕获技术能够选择性地富集目标DNA序列，以减少测序的成本和工作量。

相比于全基因组测序，该技术能够仅关注与研究目的密切相关的区域，从而提高测序深度和覆盖度，获得更加精确的结果。

2. 目标区域测序的精度和灵敏度更高：通过使用DNA捕获技术，研究人员可以集中精力在感兴趣的基因组区域上，从而获得更加精确和灵敏的测序结果。

尤其在研究复杂疾病的发病机制时，捕获并测序关键候选基因或区域可以帮助识别潜在的遗传变异并揭示其与疾病之间的关联。

3. 可以在不同样本的基因组中进行比较：DNA捕获技术允许研究人员对不同样本的基因组进行相互比较和分析。

这对于研究个体之间的遗传差异以及物种之间的进化关系具有重要意义。

通过捕获和测序多个样本的目标DNA片段，研究人员可以识别和分析这些样本之间的共同和差异之处。

尽管DNA捕获技术在基因组学研究中有诸多优势，但它也面临一些挑战，包括：1. 复杂的样本准备：DNA捕获技术的成功应用需要对样本进行特定的处理和制备，包括提取和纯化DNA，构建文库以及选择目标捕获探针等。

这些步骤往往需要专门的实验技术和设备，且耗时耗力。

样本准备的复杂性会增加分析的难度，同时也可能引入潜在的误差。

2. 数据分析和解释的挑战：DNA捕获技术产生的数据量通常很大，对数据的分析和解释需要复杂的生物信息学工具和算法。

处理和解释这些数据需要高级的计算能力和专业的分析技能。

此外，对于非编码区域的捕获和测序，数据的解读更加困难，因为这些区域的功能和意义还不完全清楚。

1G=1024M测序深度是指测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值.假设一个基因大小为2M,测序深度为10X,那么获得的总数据量为20M.测序深度=总数据量20M/基因组大小2M=10X覆盖度是指测序获得的序列占整个基因组的比例.由于基因组中的高GC、重复序列等复杂结构的存在,测序最终拼接组装获得的序列往往无法覆盖有所的区域,这部分没有获得的区域就称为Gap.例如一个细菌基因组测序,覆盖度是98%,那么还有2%的序列区域是没有通过测序获得的.核苷酸多态性位点SNP,插入缺失位点InDel,Insertion/Deletion、结构变异位点SV,StructureVariation位点.SBC可以协助客户,通过手段,分析不同间的结构差异,同时完成注释.技术路线提取基因组DNA,利用Covaris进行随机打断,电泳回收所需长度的DNA片段0.2~5Kb,加上接头,进行cluster制备Solexa或E-PCRSOLiD,最后利用Paired-EndSolexa或者Mate-PairSOLiD的方法对插入片段进行重测序.图1-1,以SOLiD为例,说明整个实验方案.2、外显子测序也称目标组捕获,是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法.是一种选择基因组的的高效策略,外显子测序相对于基因组重测序成本较低,对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势.外显子expressedregion是真核生物基因的一部分,它在剪接Splicing后仍会被保存下来,并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质.外显子是最后出现在成熟RNA中的基因序列,又称表达序列.既存在于最初的产物中,也存在于成熟的RNA分子中的核苷酸序列.在人类基因中大约有180,000,占人类基因组的1%,约30MB.。

2）DNA的质量监测通常有两个方法：首先OD260/OD280比值应该在1.8左右（1.7-1.9），否则意味着DNA样品中存在大量的蛋白质或RNA污染。

其次，琼脂糖电泳分析时应主要以超螺旋条带为主。

最多不超过三条带（分别为超螺旋DNA，线性化DNA和环状DNA）。

否则意味质粒DNA的质量不高，应该重新制备。

2.限制性内切酶的活性1）限制性内切酶一般需要低温保存，而且反复的升降温过程对酶活性的损害很明显。

因而为了确保在有效期内的限制性内切酶不会失活，限制性内切酶的日常保存和使用应当很小。

2）建议购买具有保温功能的冻存盒保存限制性内切酶（-20度），而且取用限制性内切酶时，也应该使用具有保温功能的冻存盒，尽量防止酶的温度反复出现大的波动。

3.限制性内切酶的用量1）限制性内切酶的单位定义通常为：在合适的温度下，完全消化1ugDNA底物所需的酶量定义为一个单位。

2）在这个单位定义中，有几个不确定因素：首先是底物，不同的酶单位定义是选择的底物可能不同（常用的几个底物DNA包括：Lambda DNA ,AD2 DNA 和一些质粒DNA）；第二个不确定因素是限制性内切酶在底物DNA上的酶切位点的个数。

由于单位定义中要求完全消化，因而底物上某个酶的酶切位点的个数的多少，就直接影响了该酶的单位定义。

3）因而，在进行酶切时，用1ul酶（一般10IU/ul）消化1ugDNA的通常做法是很不科学的，这也导致在实际工作中，大家要进行多次预实验才能确定最合适酶切条件。

4）以前，我推荐了一个在线的双酶切设计软件，double digestion designer, 可以精确地计算酶切时的限制性内切酶的用量。

使用中，能够注意到，用来进行双酶切的两个酶的用量有时竟然相差近20倍（EcoRI + NheI)，而且发现，小片段PCR产物（100-500bp）进行酶切时，需要的酶量比质粒DNA酶切时用量多10倍以上。

5）该软件目前可以免费使用，用户名和密码都是test。

临检实验室建设标准与要求一、高通量测序（NGS）实验室简介1.1NGS实验室又叫高通量测序检测实验室。

NGS是下一代测序技术(N EXTG ENERATION S EQUENCING)即高通量测序技术的简称。

高通量测序技术是对传统S ANGER测序（称为一代测序技术）革命性的改变,可同时对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能,也称为深度测序(D EEPSEQUENCING)。

1.2由于NGS技术对所检测的核酸模板进行大量扩增，容易出现实验室污染导致检测结果准确性下降；另外NGS技术要求高、影响因素多，实验过程处理不当易导致检测结果准确性下降或检测失败。

因此临床基因扩增检验实验室技术验收和规范化管理是NGS技术本身需要，也是在临床上顺利应用该技术前提。

二、NGS实验室临床应用的基本条件2.1必须拥有符合临检中心相关规定的标准NGS实验室。

2.2检测设备必须符合标准NGS实验室设置要求：高通量测序仪及配套服务器；高通量测序检测试剂盒；通用电脑；自动分析软件，实验室样本信息管理系统等。

2.3检测人员必须通过专门的技能培训，并获得省级以上卫生计生行政部门颁发的临床基因扩增检验技术上岗证书。

NGS实验室必须建立严格的实验室管理制度、建立标准化操作程序（SOP）、建立系列质量管理文件等，确保实验室日常运行符合国家卫生部的要求，确保检测结果准确、确保实验室卫生安全，确保实验室长期稳定运行。

2.4NGS临床应用必须在无菌无尘环境下进行操作。

三、NGS实验室建设基本要求3.1主体结构主体为彩钢板、铝合金型材。

室内所有阴角、阳角均采用铝合金50内圆角铝，从而解决容易污染、积尘、不易清扫等问题。

结构牢固，线条简明，美观大方，密封性好。

3.2标准的各区分隔和气压调节将检测过程分成试剂准备、样本制备、PCR扩增和高通量测序四个独立的实验区。

整个区域有一个整体缓冲走廊。

外显子捕获结题报告2010-11-22内容1 项目信息 (1)2 工作流程介绍 (2)2.1 Agilent液相捕获平台 (2)2.2 NimbleGen 液相捕获平台 (3)2.3 生物信息分析流程 (4)3 分析报告 (5)结果 (5)3.1 标准生物信息分析 (5)3.1.1 数据产出统计 (5)3.1.2 目标区域单碱基深度分布图 (6)3.1.3外显子捕获测序的均一性 (7)3.1.4一致序列组装和SNP检测 (7)3.1.5 SNP注释 (8)3.1.6插入/缺失(indels)检测 (9)3.1.7插入/缺失(indels)注释 (9)3.2个性化分析 (9)3.2.1氨基酸替换预测 (9)3.2.2群体SNP检测和等位基因频率估计 (12)3.2.3孟德尔遗传病分析 (13)3.2.4 NGS-GW AS 分析 (14)3.2.5正向选择信号的检测 (14)4 数据分析方法说明 (15)4.1信息分析软件及常用参数介绍 (15)4.2参考数据库 (16)4.3数据文件格式 (17)1 项目信息2 工作流程介绍采用Aglient SureSelect外显子靶向序列富集系统和NimbleGen SeqCap EZ人全外显子捕获系统。

这两个系统都采用液相系统进行高特异性和高覆盖率的外显子区域捕获。

2.1 Agilent液相捕获平台图2.1 Aglient外显子捕获和测序流程基本流程：首先将基因组DNA随机打断成150-200bp左右的片段，随后在片段两端分别连接上接头制备杂交文库。

文库经纯化后经过LM-PCR的线性扩增与SureSelect Biotinylated RNA Library (BAITS)进行杂交富集，再经过LM-PCR 的线性扩增，文库检测合格后即可上机测序（Hiseq2000测序仪）。

对每个捕获文库进行高通量测序并保证测序深度达到要求，原始图像文件经过Illuminabasecalling Software 1.7进行碱基读取，获得读长为90bp双末端序列（reads）。

探针捕获测序原理
摘要：
1.探针捕获测序的原理概述
2.探针捕获测序的基本步骤
3.探针捕获测序的优势与应用
正文：
【探针捕获测序的原理概述】
探针捕获测序（Probe-based capture sequencing）是一种基于基因组捕获的高通量测序技术，其主要原理是通过特定的探针与目标DNA 序列结合，实现对目标序列的捕获与富集，然后进行高通量测序，以获取目标序列的信息。

这种技术能够有效解决基因组结构复杂、重复序列高等问题，为全基因组测序提供了一种有效的研究手段。

【探针捕获测序的基本步骤】
探针捕获测序主要包括以下几个步骤：
1.设计探针：根据目标DNA 序列设计特异性的捕获探针，使其与目标序列特异性结合。

2.捕获目标序列：将设计好的探针与基因组DNA 混合，通过高温解链，使探针与目标序列结合。

3.富集目标序列：结合后的目标序列与探针一起进行PCR 扩增，实现目标序列的富集。

4.高通量测序：对富集后的目标序列进行高通量测序，获取目标序列的详
细信息。

5.数据分析：对测序数据进行分析，得到目标序列的基因型、表型等信息。

【探针捕获测序的优势与应用】
探针捕获测序技术具有以下优势：
1.较高的捕获效率：通过特异性探针的设计，可实现对目标序列的高效捕获，降低非目标序列的干扰。

2.较高的测序深度：由于富集了目标序列，使得高通量测序得到的数据中，目标序列的占比大大提高，从而提高了测序深度。

3.广泛的应用领域：探针捕获测序技术可应用于基因组结构分析、基因变异检测、基因表达谱分析等领域。

新型冠状病毒全基因组测序通用技术要求1 范围本文件描述了新型冠状病毒全基因组测序方法的术语和定义、要求、试验方法等。

本文件适用于对口咽拭子、鼻咽拭子、气道抽吸液、痰液、肺泡灌洗液、其他呼吸道分泌物或病毒培养物等样本中的新型冠状病毒的全基因组测序，包括宏转录组测序法、多重聚合酶链反应（PCR）测序法及杂交捕获测序法等。

本文件适用的测序原理包括可逆末端终止测序、联合探针锚定聚合测序、纳米孔测序等。

2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。

其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB 19489 实验室生物安全通用要求GB/T 19495.2转基因产品检测实验室技术要求《新型冠状病毒实验室生物安全指南》3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。

基因测序 gene sequencing对核酸分子不同碱基类型的测定，即测定组成核酸分子的腺嘌呤（Ａ）、鸟嘌呤（Ｇ）、胞嘧啶（Ｃ）和胸腺嘧啶（Ｔ）或者尿嘧啶（Ｕ）等碱基的组成或排列顺序。

[来源：YY/T 1723—2020，3.1]全基因组测序 whole genome sequencing对生物体整个基因组序列进行测定，获得完整的基因组信息。

[来源：DB32/T 3762.11—2020，3.1]宏转录组测序 metatranscriptomic sequencing以特定环境中整个群落作为研究对象，不分离培养，直接提取得到的所有RNA，经过逆转录合成互补DNA后，进行基因测序。

[来源：GB/T 40226—2021，3.3，有修改]多重聚合酶链反应 multiplex polymerase chain reaction多重聚合酶链反应是在同一扩增反应体系中，使用两对以上引物同时扩增出多个核酸片段的扩增反应。

[来源：GB/T 19915.5—2005,3.2]杂交捕获 hybridization capture对一个或多个基因的核苷酸序列定制目标基因区域特异性探针，与基因组核苷酸进行杂交，并富集目标基因片段的过程。