高效液相色谱法分析饮料中咖啡因的含量
院（系）生化系年级2009级专业制药工程
姓名吴雄辉学号0940902007
课程名称基础化学实验报告实验日期2011年12月日
实验地点3L 5楼指导教师夏湘黄玉
一．实验目的
（1）熟悉高效液相色谱仪的结构，理解反相HPLC的原理和应用；
（2）掌握外标定量法。
二．实验原理
咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称为1，3，7-三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。它能兴奋大脑皮层，使人精神亢奋。咖啡因在咖啡中的含量约为1.2%-1.8%，在茶叶中约为2.0-4.7%。可乐饮料、止痛药等均含咖啡因。咖啡因的分子式为C8H10O2N4，其化学结构式如下图：
在化学键合相色谱法中，若采用的流动相的极性大于固定相的极性，则称为反相化学键合相色谱法。该方法是目前应用最为广泛的色谱方法。本实验采用C18键合相色谱柱分离饮料中的咖啡因，用紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度作标准曲线，再根据试样中咖啡因的峰面积，由标准曲线计算出试样中咖啡因的浓度。
三．实验用品
仪器：高效液相色谱仪、恒流泵、超声波清洗仪、紫外光检测器等。
试剂：甲醇（分析纯）、咖啡因（分析纯）、二次蒸馏水
咖啡因标准溶液的配制：
（1）标准储备液配制含咖啡因1000ug/mL的甲醇溶液，备用。
（2）标准系列溶液用上述备用液配制含咖啡因20ug/mL、40ug/mL、80ug/mL、160ug/mL、320ug/mL的甲醇溶液，备用。
试样市售的可口可乐和百事可乐。
四．实验条件
（1）色谱柱长150mm，内径4.6mm，装填C-18烷基键合物，颗粒度10μm 的固定相
（2）流动相甲醇-水（60：40），流量0.6m/mim
（3）紫外光度检测器测定波长254mm，灵敏度0.08
（4）进样量10μL
五．实验步骤
（1）将配制好的流动相置于超声波清洗仪上脱气15min；
（2）根据实验条件，将仪器按照仪器的操作步骤调节至进样状态，待仪器液路和电路系统达到平衡时，色谱工作六站或记录仪的基线呈平直，即可进样；（3）依次分别吸取10μL的可乐试样进样，并记录各色谱仪的数据；
（4）分别将约20mL的可口可乐和百事可乐试样置于25mL的容量瓶中，用超声波清洗仪脱气15min；
（5）依次分别吸取10μL的可乐试样进样，记录各色谱仪的数据；
（6）试验结束后，按要求关好仪器。
六．实验数据处理
（1）记录实验条件
（2）处理色谱数据，将系列对照品溶液与可乐试样的咖啡因色谱峰保留时间及峰面积列于下表中：
（3）绘制咖啡因色谱峰面积-对照品溶液浓度的回归曲线，并计算回归方程和相关系数。
将标样的数据利用EXCEL软件绘图，并计算回归方程，如下：
（4）根据可乐试样中咖啡因色谱峰面积值，计算可乐试样中的咖啡因浓度。
七．思考题
（1）用标准曲线法定量有什么优缺点？
答：标准曲线法的优点是：绘制好标准工作曲线后测定工作就变得相当简单，可直接从标准工作曲线上读出含量，因此特别适合于大量样品的分析。
标准曲线法的缺点是：每次样品分析的色谱条件（检测器的响应性能，柱温，流动相流速及组成，进样量，柱效等）很难完全相同，因此容易出现较大误差。此外，标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品（或已知准确含量的样品），而实际样品的组成却千差万别，因此必将给测量带来一定的误差。
（2）根据咖啡因的结构特点，咖啡因还可采用其他类型的色谱方法吗？（3）采用咖啡因浓度与色谱峰高作回归曲线，能给出准确的测试结果吗？与本实验的峰面积-浓度回归曲线相比，哪一种方法更好一些？为什么？
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