自己翻译的罗氏tunel检测细胞凋亡试剂盒说明书
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罗氏tunel检测细胞凋亡试剂盒说明书
800-820-0577
11684817910
注意:Label溶液含有甲次砷酸盐和二氯化钴,严禁吸入和食入。
反应悬浮物收集于密闭、不易碎、有明确标识的容器中,按有毒废物处理。
需要自己配置的其他物品:
除上表所列试剂外,还需准备以下溶液。下表列出每步所需物品概览:
产品概述:
特异性:TUNEL反应优先标记凋亡产生的DNA链断裂,从而辨别凋亡与坏死、以及由抑制细胞生长的药物或放射线产生的primary DNA链断裂
实验干扰:假阴性:在某些型式的凋亡细胞中DNA链断裂可能缺失或不完全。空间位阻,如细胞外元件可能阻止TdT到达DNA断裂处。两种情况均能产生假阴性。
假阳性:在坏死晚期,可能产生大量的DNA片段
DNA链断裂也可能在具有高增殖和代谢活动的细胞中出现。两种情况均能产生
假阳性。为确认细胞死亡的凋亡型式,应认真进行每种细胞的形态学检查
凋亡过程中产生的形态学改变尤其特征形式,因此,对于可以结果进行解释时,
细胞形态评估是一项重要的参数
样本:细胞离心涂片和细胞涂片
在chamber slides上培养的黏附细胞
冰冻或福尔马林固定、石蜡包埋样本
分析时间:2-3小时,除外培养、固定和渗透
检测次数:一个试剂盒50T
试剂盒存储/稳定性:未开封试剂盒储存于-15~-25℃可稳定至标签上标明的效期。
步骤和所需材料:
1 流程图:
2 样品准备
2.1 黏附细胞、细胞涂片和细胞离心涂片
需准备的其他试剂:Washing buffer:磷酸盐缓冲液(PBS)
Blocking buffer封闭溶液:甲醇稀释的3% H2O2
Fixation solution固定溶液:PBS配制的4%多聚甲醛,ph 7.4,新鲜配制
Permeabilisation solution 渗透液:0.1%Triton1)X-100溶于0.1%柠檬酸钠
溶液中,新鲜配制
步骤:下表描述了细胞固定、内源性过氧化物酶封闭和细胞渗透过程。
注意:固定和渗透另外两个细胞样本用于银杏和阳性对照
2.2 组织部分
2.2.1 福尔马林-包埋组织
福尔马林包埋组织的预处理:可按4种不同的方式预处理。如用蛋白酶K,不含核酸酶,浓
度、孵育时间和温度应按组织类型优化
注意:只用罗氏应用科学的蛋白酶K,因其经检测不含核酸酶,
核酸酶可导致假阳性。
另外3中替代方法在下表中描述(step 2)
需准备的其他试剂:二甲苯和乙醇(浓度:95%,90%,80%,70%,溶于双蒸水中)
Washing buffer:PB S
蛋白酶K,不含核酸酶,工作浓度:[10-20ug/ml,溶于10mM Tris/HCL
中,ph7.4-8]
替代处理方案
※渗透溶液:0.1%Triton1)X-100,溶于0.1%柠檬酸钠的,新鲜配制
※胃蛋白酶*(0.25%-0.5%,溶于盐酸中,ph2)或胰蛋白酶*,0.01N HCL,
不含核酸酶
※0.1M柠檬酸缓冲液,ph6,微波照射
步骤:下表描述了用蛋白酶K(不含核酸酶)和3中替代方法预处理福尔马林-包埋组织的方法
2.2.2 冰冻组织处理(略)
3 标记草案
3.1 开始之前
准备TUNEL反应混合液:每一对管子(小瓶1:酶溶液,小瓶2:标记溶液)足以用于50ul
反应体系的10张片子,和2个50ul标记溶液的阴性对照。
注意:TUNEL反应混合液应于用前临时配制,不能储存。TUNEL
反应混合液用前置于冰上
需准备的其他试剂:微球菌核酸酶或
DNase I,重组,级别1*
对照:每次实验应包含两个阴性对照和一个阳性对照应
3.2 黏附细胞、细胞涂片、细胞离心涂片和组织标记草案
需准备的其他设备和试剂:Washing buffer:PBS
湿盒
Parafilm石蜡封口膜或盖片
步骤:参考下表
3.3 困难组织标记草案(略)
3.4 信号转换
需要准备的其他设备和试剂:Washing buffer:PBS
湿盒
Parafilm石蜡封口膜或盖片
DABA底物或POD替代底物
光镜镜检封固剂
步骤:按照下表操作
4. 附件: