实验技术问答题

实验技术问答题

1、移液器的正确使用方法

答：⑴ 要根据移液体积选择合适的移液器。在调整取液量的旋钮时，不要用力过猛，并应注意计数器显示的数字不要超过其可调范围，

⑵ 将移液器垂直插入吸头后，并左右微微转动上紧。严禁上下敲击。

⑶ 垂直吸液，要将吸头插入液体一定的深度（约在液面3毫米以下），然后缓慢平稳地松开按钮,吸进液体，等一秒钟，然后将吸头提离液面，贴壁停留2-3 秒，使管尖外侧的液滴滑落。

⑷ 放液时将吸头口贴到容器内壁底部并保持一定倾斜。压住按钮排出液体。排空液体后继续压住按钮并同时提起移液器,使吸头贴容器壁擦过。最后松开按钮按吸头弹射器除去吸头。

⑸ 对于较粘稠的液体可预吸一次，将枪头浸润后，再开始吸液。

2、在细胞培养箱中通入二氧化碳的作用是什么?是否培养任何细胞时都必须保持培养箱中

二氧化碳的浓度为5%。

答：在细胞培养箱中通入二氧化碳的作用是维持培养液中pH值的相对稳定

大多数细胞所需pH 在 7.2 - 7.4.但是,细胞培养最适pH值随培养的细胞种类不同而不同.成纤维细胞喜欢较高pH (7.4 - 7.7), 而传代转化细胞系则需要偏酸pH (7.0 - 7.4)一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 为每升1.97 g 时， 则应使用5 % CO2 培养细胞

3、 为何培养基保存于4 °C 冰箱中， 颜色会偏暗红色， 且pH值会越来越偏碱性？

答：培养基保存于4 °C 冰箱中， 培养基内之CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为酚红-酸性培养液呈橙黄色,碱性培养液呈深红色)

的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱的结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。

4、动物细胞培养的条件有哪些？

答：⑴无菌无毒的环境；

⑵营养与体内基本相同；

⑶适宜的温度和酸碱度；

⑷气体环境。

5、在细胞培养过程中，胰酶有什么作用？

答：胰酶的主要作用是使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散。胰酶对细胞的分离作用与细胞的种类和细胞的特性有密切关系。一般来讲，胰酶浓度大、作用温度高、作用时间长，对细胞分离能力也大，但超过一定的限度会损伤细胞。胰酶溶液在pH8.0，温度为37℃时，作用能力最强。注意：钙离子、镁离子和血清蛋白的存在会降低胰酶活力。因此，胰酶溶液常用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks’ 平衡盐溶液配制成0.25%溶液

6、用台盼蓝鉴别细胞死活时，为什么活细胞不作色，死细胞核呈蓝色？

答：因为当细胞死亡时，染料通过变性的胞膜与解体的细胞核DNA结合，而使其染色。 7、超净工作台的正确使用

答：⑴使用前应提前30分钟同时开启紫外灯和风机组工作，

⑵当需要调节风机风速时，用工作台操作面板上的风速调节钮进行调节。

⑶工作台面上禁止存放不必要的物品，工作区内的所有物品均应排放整齐，以免干扰气流方向。应即时将工作台内的闲置物品撤离出去，并且不得堵住气流的进口以保持工作区的洁净气流不受干扰。

⑷禁止在工作台面上记录书写，工作时应尽量避免作明显扰动气流的动作

⑸使用结束后，用消毒液清理工作台面后打开紫外灯，15~30分钟后关闭紫外灯，关闭洁净台电源

8、洁净工作台与生物安全柜的区别？

答：生物安全柜与洁净台的主要区别在于生物安全柜主要是保护操作者和环境，也可保护受试样品并防止交叉污染的发生，生物安全柜是一种负压的净化工作台，结构比洁净台复杂，操作区气体负压，气体净化后排放；

洁净柜保护操作样品，不保护操作者及环境，操作区处气体正压，操作区外气体直接排放。

9、石英比色皿与玻璃比色皿有何区别？测定DNA RNA浓度时是否可以使用玻璃比色皿

答：石英比色皿可以让可见波长与紫外波长的光都透过。玻璃比色皿不能透过紫外波长的光

测定DNA和RNA浓度时使用的是紫外光，波长为260与280nm，因而不可以使用玻璃比色皿。

10、移液器吸头消毒后，放入洁净工作台内是否既可以保持无菌？

答、洁净工作台不是一个密闭容器，洁净工作台不运行时，台内的洁净程度与洁净工作台所放置的房间的洁净度相同，如果不是在无菌室内，放置在洁净工作台内的消毒过得移液器吸头是不能保持无菌的。

11、如果血液标本泼洒在实验台上，应该如何处置？

答：血液标本泼洒在实验台上后，应该立即将用布或纸巾覆盖并吸收溢出物。向纸巾上倾倒适当的消毒剂，并立即覆盖周围区域（通常可以使用5%漂白剂溶液如84消毒液）。使用消毒剂时，从溢出区域的外围开始，朝向中心进行处理。作用适当时间后（例如30 min），清理掉。污染区再次清洁并消毒。

12、正置与倒置荧光显微镜有何区别？培养的活细胞要在何种显微镜上观察？

答：正置荧光显微镜的物镜在载物台上，光源在载物台下。此种显微镜可用来观察制成薄片贴附在载玻片上的样品。即可做可见光观察，也可作荧光观察。

倒置荧光显微镜的光源在载物台上，物镜在载物台下此种显微镜可用来观察培养的活细胞。与正置荧光显微镜相同，即可做可见光观察，也可作荧光观察。

13、用荧光显微镜的油镜观察含有荧光的物体时，选用的镜油有何要求

答：用荧光显微镜的油镜观察含有荧光的物体时，必须选用无荧光的镜油

14、在制备电泳胶过程中，使用的丙烯酰胺，亚甲双丙烯酰胺，过硫酸胺试剂，有何种毒性？ 答：未聚合的丙烯酰胺，亚甲双丙烯酰胺，过硫酸胺可通过皮肤和呼吸道吸收，具有神经毒性。操作时要带手套和口罩。

15、在电泳过程中为解决散热问题，是否可以将冰块直接加到电泳时的缓冲液中？为什么？

答：不可以。当冰块不断溶解时缓冲液中的离子强度就不断发生变化，将影响条带的分离。

16、电泳以后未能检出样品的原因有哪些？

答：电泳以后未能检出样品的可能原因如下：

⑴加样量太少；

⑵染色液性质、浓度或染色时间不合适

⑶样品比重小，加样时样品浮出；

⑷分离胶浓度太高，样品未进入凝胶；

⑸分离胶浓度太低，样品已电泳出分离胶；

⑹若样品是RNA，可能其中含有蛋白质，形成的巨大复合物将凝胶孔径堵塞；

⑺样品中含有水解该样品的酶，在电泳过程中样品水解。

17、电泳后样品分离带宽或拖尾的原因有哪些？应该如何处理

答：电泳后样品分离带宽或拖尾的原因可能是：

⑴缓冲液组成或pH值不合适；

⑵样品溶液的离子强度过高

处理方法：

⑴选择合适的缓冲液

⑵减少加样量

⑶降低样品浓度

⑷进行去离子化处理；

18、在用紫外测定DNA、RNA纯度和浓度时，A260/A280比值是多少？出现不合适的比值时说明什么问题？

答：DNA RNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，眼和小分子则集中在230nm处有吸收。A260/A280比值在1.8～2.0相当于核酸的纯度为90%～100%。

若比值低于1.7，说明有蛋白质等污染，若比值高于2.0，说明有盐、胍、糖等小分子的污染。

19、PCR出现假阴性的原因

答：⑴模板的的问题： ①模板上含有杂蛋白质或Taq酶抑制剂；②模板中蛋白质没有消化除尽；③在提取制备模板时丢失过多；④模板的核酸变性不彻底。

⑵酶失活

⑶引物：①两条引物的浓度不对称，一条高，一条低，造成低效率的不对称的扩增。

②引物没有高浓度小量的分装保存，多次使用多次冻融，或长期放在冷藏部分导致引物变质降解失效。

⑷镁离子浓度：过低影响扩增产量甚至不出现条带，但过高又会降低扩增的特异性，

⑸物理原因：变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性。退火温度过低，可因非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高影响引物与模板的结合而降低扩增效率。 ⑹靶序列变异：靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，无法扩增。

20、 PCR出现假阳性的原因、

答：⑴引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，扩增出的产物为非目的性序列。

⑵靶序列或扩增产物的交叉污染①整个基因组或大片段的污染，②空气中的小片段核酸污染

21、实时定量PCR的荧光扩增曲线分为哪3个阶段？在哪个阶段PCR产物量的对数值与起始模板量之间有线性关系？

答：实时定量PCR的荧光扩增曲线分为以下3个阶段：

⑴背景信号阶段

⑵指数扩增期

⑶平台期

在指数扩增期PCR产物量的对数值与起始模板量之间有线性关系

22、RT-PCR的荧光阈值一般的缺省设置时3～15个循环的荧光信号的标准偏差的多少倍；何谓Ct值？

答：RT-PCR的荧光阈值一般的缺省设置时3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍.

每个反应管的荧光信号达到设定阈值所需的循环数为Ct值。

23、：考马斯亮蓝法测定蛋白质含量多少时间内达到反应平衡，其结合物在室温下多少时间内保持稳定？可测定哪个级别的蛋白质含量？蛋白质-考马斯亮蓝色素结合物在多少nm波长下有最大光吸收。

答：⑴蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合完成反应十分迅速；在2min左右的时间内达到平衡，

⑵其结合物在室温下1h内保持稳定。

⑶反应非常灵敏，可测定微克级蛋白质含量。

⑷蛋白质-考马斯亮蓝色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。

24、用酶标板测定蛋白质含量时，每孔中所加溶液的体积不一致，是否影响测定结果？为什么？

答：用酶标板测定蛋白质含量时，每孔中所加溶液的体积不一致，影响测定结果。

因为用紫外或可见光进行测定时，根据朗伯-比尔定律：A=abc, 吸光度值的大小，不仅与溶液的浓度相关，而且还与光通过溶液的距离相关。如果每孔中所加溶液的体积不一致，光通过溶液的距离就不一样，即使每孔中蛋白的浓度相同，但测定得到吸光度值却不相同。

25、对瓶装液体进行高压灭菌时，怎样封瓶口？

答：对瓶装液体进行高压灭菌时，用棉塞或插有针头的胶塞封瓶口。以防瓶内压力过高瓶子破裂，或瓶塞崩脱。