第一章基因工程概述

基因⼯程知识要点第⼀章1.基因⼯程:是在分⼦⽔平上进⾏的遗传操作，指将⼀种或多种⽣物体（供体）的基因或基因组提取出来，或者⼈⼯合成的基因，按照⼈们的愿望进⾏严密的设计，经过体外加⼯重组，转移到另⼀种⽣物体（受体）的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。

2.基因⼯程的基本过程为哪些？切—接—转—增—检①获得⽬的基因：从供体细胞分离出基因组DNA，⽤内切酶将外源DNA切开。

——切（同时选择运载⽬的基因的载体）②⽬的基因与载体DNA拼接：⽤DNA连接酶将含有外源基因的DNA⽚段接到载体分⼦上，形成DNA重组分⼦。

——接③重组体分⼦导⼊受体细胞：借助于细胞转化⼿段将DNA重组分⼦导⼊受体细胞中。

——转④短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分⼦或使其整合到受体细胞的基因组中。

——增⑤筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因⾼效稳定表达的基因⼯程菌或细胞。

——检3.哪些基因是真核⽣物特有的？①假基因：核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同，但却不能合成出功能蛋⽩质的失活基因。

②基因家族：由功能相关的基因成套组合形成③重复序列哪些是原核⽣物特有的：插⼊序列。

哪些是真核和原核共有的：移动基因、重叠基因第⼆章1.寄主细胞控制的限制与修饰宿主控制限制——核酸限制性内切酶宿主控制修饰——修饰的甲基转移酶以λ(k)噬菌体侵染E.coli B菌株为例解释寄主控制与修饰的现象。

（简述寄主控制的限制与修饰现象。

⼤多数细菌的噬菌体侵染都存在着⼀些功能性障碍。

所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。

R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完成的⼀种是修饰的甲基转移酶——修饰另⼀种是核酸内切限制酶——限制R/M体系的作⽤：保护⾃⾝的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解；2. 简述Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型核酸内切酶的基本特性。

（1）Ⅰ型酶基本特性①有内切酶活性和甲基化酶活性——互斥②需要ATP、SAM（S—腺苷甲硫氨酸）和Mg 2+辅助因⼦；③EcoB和EcoK是由三种不同亚基组成。

第一章基因工程概述一、名词解释基因：编码产生蛋白质或RNA等具有特定功能产物的一段具有遗传效应的DNA片段，是控制生物性状的基本遗传单位。

基因操作：基因操作是指对基因进行分离、分析、改造、重组、转移、检测和表达等操作的总称。

基因工程：专指为实践应用而进行的基因重组事件，具体指通过基因操作来定向改变或修饰生物体，并具有明确目的的活动。

重组DNA技术：基因重组是指将一种生物（供体）的基因（DNA片段）与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。

二、思考题1、简述基因工程操作的基本步骤。

2、简述基因工程操作的理论依据。

（1）基因具有相同的物质基础（2）基因是可切割和粘合的（3）基因是可转移的（4）多肽与基因之间有对应关系（5）遗传密码通用（6）基因可以复制遗传3、简述基因工程诞生理论上的三大发现和技术上的三大发明。

理论上的三大发现: 遗传物质是DNA（基因） DNA的双螺旋结构和半保留复制中心法则和氨基酸密码子技术上的三大发明：限制性核酸内切酶 DNA连接酶质粒和病毒第二章基因工程的工具酶一、名词解释限制性内切酶：是一类能识别双链DNA分子内部某种特殊的核苷酸序列，并使每个核酸链上特定部位相邻的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开的一类核酸内切酶。

同裂酶：指来源不同，但识别相同靶序列，切割产生不同或相同末端的限制性内切酶。

即不同来源的限制性内切酶可切割相同的序列。

同尾酶：指来源各异，识别靶序列各不相同，但切割产生相同末端的限制性内切酶。

同尾酶切割DNA得到的产物可进行互补连接。

DNA连接酶：催化DNA片段两侧（相邻）核苷酸的3'羟基（-OH）和5'磷酸基（-P）之间形成磷酸二酯键，使断开的DNA连接起来的酶。

DNA聚合酶：催化DNA合成的酶逆转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶二、思考题1、简述限制性内切酶命名的基本原则。

属名+种名+株号+序号第一个字母：取宿主属名首字母，大写斜体。

第一章：基因工程概述1.1 基因工程的起源基因工程是一项涉及到生物学、遗传学和生物技术的跨学科科学。

它的起源可以追溯到20世纪60年代，当时科学家们开始研究DNA的结构和功能，并尝试利用这些知识来改变生物体的遗传特征。

1.2 基因工程的基本原理基因工程的基本原理是通过改变生物体的DNA序列来实现特定的遗传变异。

这可以通过DNA重组、基因插入和基因编辑等方法来实现。

1.3 基因工程的应用领域基因工程的应用领域非常广泛，包括农业、医学、工业等。

在农业领域，基因工程被应用于改良作物和家畜的遗传特征，提高产量和品质。

在医学领域，基因工程被应用于基因治疗、药物开发等方面。

第二章：基因工程的技术原理与方法2.1 DNA重组技术DNA重组技术是基因工程中最基本的技术之一，它包括将两种不同的DNA序列连接在一起，或者将DNA序列插入到宿主细胞的染色体中。

2.2 基因编辑技术基因编辑技术是近年来发展起来的一种新型基因工程技术，它可以实现对特定基因进行定点编辑，从而修正遗传缺陷或改变遗传特征。

2.3 基因工程的方法基因工程的方法包括质粒介导转化、基因枪法、冷冻贮存等。

这些方法可以根据具体的应用需求来选择和操作。

第三章：基因工程的伦理和法律问题3.1 基因工程的伦理问题基因工程涉及到改变生物体的遗传特征，因此引发了许多伦理和道德上的争议。

对转基因作物的安全性和影响等问题引起了广泛的关注。

3.2 基因工程的法律问题基因工程的发展也带来了一系列的法律问题，包括知识产权的保护、食品安全法规的制定等。

第四章：基因工程的应用与发展4.1 基因工程在农业中的应用基因工程在农业中的应用主要包括转基因作物的培育、抗病害、抗虫害等方面的研究和应用。

这些应用在一定程度上提高了农作物的产量和品质。

4.2 基因工程在医学中的应用基因工程在医学中的应用主要包括基因治疗、药物开发等方面。

通过基因工程技术，科学家们可以研发出更有效的药物，用于治疗各种遗传疾病和癌症等疾病。

基因⼯程知识结构（⽣⼯）《基因⼯程》课程知识结构第⼀章基因⼯程概述⼀、基因⼯程的内容与应⽤（⼀）基本概念通过基因操作，将⽬的基因或DNA⽚段与合适的载体连接转⼊⽬标⽣物细胞，通过复制、转录、翻译外源基因以及蛋⽩质的活性表达，使转基因⽣物获得新的遗传性状的操作。

（⼆）Technical process of genetic engineering1．Cloning of target gene2．Preparation of vectors3．Joining the target gene to vectors to produce recombinant DNA4．Introduction the recombinant DNA into host cells5．Identification and selection of the recombinant6．Propagation of the recombinant DNA in a host cell（三）Basic conditions1．Four elements: Target gene, Vectors, Enzymes, Host cells2．Three major components: Donors, Receptors, Vectors3．Three tools:Restriction endonuclease----Molecular scissorsDNA ligase------Molecular glueVectors-----Molecular Transporter（四）基因策略（五）研究⽬的和应⽤领域1．PurposeThere are many areas in which genetic manipulation is of value, including the following:(1)Production of useful protein by novel methods: 1982年，第⼀个基因⼯程菌⽣产药物----重组⼈胰岛素，在美国和英国获准使⽤，标志着医药领域进⼊⼀个新纪元。

第一章基因工程概述1.什么是基因工程,基因工程的基本流程基因工程Genetic engineering原称遗传工程;从狭义上讲,基因工程是指将一种或多种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体受体内,使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状;因此,供体、受体和载体称为基因工程的三大要素;1.分离目的基因2.限制酶切目的基因与载体3.目的基因和载体DNA在体外连接4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养5.选择、筛选含目的基因的克隆6.培养、观察目的基因的表达第二章基因工程的载体和工具酶1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件➢具有对受体细胞的可转移性或亲和性;➢具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点;➢具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点;➢具有合适的筛选标记;➢分子量小,拷贝数多;➢具有安全性;2. 质粒载体有什么特征,有哪些主要类型1、自主复制性2、可扩增性3、可转移性4、不相容性主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒5.探针质粒6.表达质粒3. 质粒的构建1删除不必要的 DNA 区域,尽量缩小质粒的分子量,以提高外源 DNA 片段的装载量;一般来说,大于20Kb 的质粒很难导入受体细胞,而且极不稳定;2灭活某些质粒的编码基因,如促进质粒在细菌种间转移的 mob 基因,杜绝重组质粒扩散污染环境,保证 DNA 重组实验的安全,同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因,提高质粒的拷贝数3加入易于识别的选择标记基因,最好是双重或多重标记,便于检测含有重组质粒的受体细胞;4在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的 DNA序列,即多克隆接头Polylinker,便于多种外源基因的重组,同时删除重复的酶切位点,使其单一化,以便环状质粒分子经酶处理后,只在一处断裂,保证外源基因的准确插入;5根据外源基因克隆的不同要求,分别加装特殊的基因表达调控元件;4. 什么是人工染色体载体将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起,即可构成染色体载体5. 什么是穿梭载体人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的载体;6.入-噬菌体载体及构建-DNA为线状双链DNA分子,长度为,在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端;➢1缩短长度提高外源 DNA 片段的有效装载量删除重复的酶切位点➢引入单一的多酶切位点接头序列,增加外源DNA片段克隆的可操作性➢灭活某些与裂解周期有关基因;➢使λ-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌,以避免可能出现的污染现象的发生;➢加装选择标记,便于重组体的检测单链噬菌体DNA载体➢过定点诱变技术封闭重复的重要限制性酶切口;➢引入合适的选择性标记基因,如含有启动子、操作子和半乳糖苷酶氨基端编码序列lacZ’的乳糖操纵子片段lac、组氨酸操纵子片段his以及抗生素抗性基因等;➢将人工合成的多克隆位点接头片段插在 lacZ’标记基因内部,使得含有重组子的噬菌斑呈白色,而只含有载体 DNA 的混浊噬菌斑呈蓝色;➢4在多克隆位点接头片段的两侧区域改为统一的 DNA 测序引物序列,使得重组 DNA 分子的单链形式经分离纯化后,可直接进行测序反应;8. II类限制性内切核酸酶的特点限制性核酸内切酶 Restriction endonucleases是一类能在特异位点上催化双链DNA 分子的断裂,产生相应的限制性片段的核酸水解酶;➢识别位点的特异性：每种酶都有其特定的DNA识别位点,通常是由4、5或6核苷酸组成的特定序列靶序列;➢识别序列的对称性：靶序列通常具有双重旋转对称的结构,即双链的核苷酸顺序呈回文结构;➢切割位点的规范性：双链DNA被酶切后,分布在两条链上的切割位点旋转对称可形成粘性末端或平末端的DNA分子;同位酶：一部分酶识别相同的序列,但切点不同,这些酶称为同位酶;同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶同尾酶Isocandamers：识别位点不同,但切出的 DNA 片段具有相同的末端序列,这些酶称为同尾酶;9.甲基化酶Ⅱ类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴,甲基化酶的识别位点与限制性内切酶相同,并在识别序列内使某位碱基甲基化,从而封闭该酶切口;甲基化酶在封闭一个限制性内切酶切口的同时,却产生出另一种酶的切口➢甲基化酶可修饰限制性核酸内切酶识别序列,从而使DNA免受相应的限制性核酸内切酶的切割;➢甲基化酶的用途就是在必要时可以封闭某一限制性核酸内切酶的酶切位点;连接酶连接作用的特点:①DNA连接酶需要一条DNA链的3’末端有一个游离的羟基-OH,另一条DNA链的5’末端有一个磷酸基-P的情况下,只有在这种情况下,才能发挥连接DNA分子的作用;②只有当3’－OH和5’－P彼此相邻,并且各自位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端时,DNA连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键;③DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子,被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分;④DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口nick,而不能封闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口gap;⑤由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应,因此,DNA连接酶在进行连接反应时,还需要提供一种能源分子NAD＋或ATP11.大肠杆菌 DNA聚合酶和Klenow大片段各有什么作用DNA聚合酶作用的特点：➢要有底物4种dNTP为前体催化合成DNA;➢接受模板指导;➢需要有引物3’羟基的存在;➢不能起始合成新的DNA链;➢催化dNTP加到生长中的DNA链3’-OH末端;➢催化DNA的合成方向是5’→3’;Klenow酶的基本性质：➢大肠杆菌DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端604个氨基酸残基片段,即Klenow酶;分子量为76kDa;➢Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和5’→3’的核酸外切酶活性,但失去了5’→3’的核酸外切酶活性;Klenow酶的基本用途：➢修复由限制性核酸内切酶造成的 3’凹端,使之成为平头末端;➢以含有同位素的脱氧核苷酸为底物,对DNA片段进行标记;➢用于催化 cDNA 第二链的合成;➢用于双脱氧末端终止法测定 DNA 的序列;聚合酶T4-DNA聚合酶酶的基本特性：➢有3’→5’的核酸外切酶活性和5’→3’的DNA聚合酶活性;➢在无dNTP时,可以从任何3’-OH端外切;➢在只有一种dNTP时,外切至互补核苷酸;➢在四种dNTP均存在时,聚合活性占主导地位;T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端13. 影响连接效率的因素有：➢温度最主要的因素离子浓度➢ATP的浓度 10μM - 1μM➢连接酶浓度平末端较粘性末端要求高➢反应时间通常连接过夜➢插入片段和载体片段的摩尔比➢DNA末端性质➢DNA片段的大小14.如何将不同DNA分子末端进行连接1.相同粘性末端的连接如果外源DNA与载体DNA均用相同的限制性内切酶切割,则不管是单酶酶解还是双酶联合酶解,两种DNA分子均含有相同的粘性末端,因此混合后能顺利的连接成一个重组DNA分子 2.平头末端的连接T4-DNA连接酶在ATP和高浓度酶的条件下,能连接具有完全碱基配对的平末端DNA分子,但平末端连接效率不高,基因操作不经常采用;3.不用粘性末端的连接3’端的粘性末端用T4-DNA聚合酶切平5’端的粘性末端用klenow酶补平,或者用S1核酸酶切平最后用T4-DNA连接酶进行平末端连接15. 碱性磷酸酶有什么作用1.该酶用于载体 DNA的5’末端除磷操作,以提高重组效率；2.用于外源DNA片段的5’端除磷,则可有效防止外源 DNA 片段之间的连接;16. 末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用➢给载体或目的DNA加上互补的同聚物尾;➢DNA片段3’末端的同位素标记;17. 2、细菌转化的步骤：∙感受态的形成;感受态时细胞表面出现各种蛋白质和酶类,负责转化因子的结合、切割及加工;感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子,其功能是与细胞表面受体结合,诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质如细菌溶素的合成,使细菌胞壁部分溶解,局部暴露出细胞膜上的 DNA 结合蛋白和核酸酶等;∙转化因子的结合;受体菌细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构特异性结合,单链DNA或RNA双链RNA以及DNA/RNA杂合双链都不能结合在膜上;∙转化因子的吸收;双链 DNA 分子与结合蛋白作用后,激活邻近的核酸酶,一条链被降解,而另一条链则被吸收到受体菌中;∙整合复合物前体的形成;进入受体细胞的单链 DNA 与另一种游离的蛋白因子结合,形成整合复合物前体结构,它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核酸酶的降解,并将其引导至受体菌染色体DNA处;∙转化因子单链DNA的整合;供体单链DNA片段通过同源重组,置换受体染色体DNA的同源区域,形成异源杂合双链 DNA结构;+诱导转化原理：①在0℃的Cacl2低渗溶液中,细菌细胞发生膨胀,同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来,诱导大肠杆菌形成感受态;②Ca2+能与加入的DNA分子结合,形成抗DNA酶DNase的羟基-磷酸钙复合物,并黏附在细菌细胞膜的外表面上;当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时,细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动,并随之出现许多间隙,为DNA分子提供了进入细胞的通道;③Mg2+对DNA分子有很大的稳定性作用,因此利用Mgcl2与Cacl2共同处理大肠杆菌细胞,可以提高DNA的转化效率;∙但该法要求条件高,对外界污染物极为敏感,通常很少采用;介导细菌的原生质体转化∙PEG是乙二醇的多聚物, 存在不同分子量的多聚体,它可改变各类细胞的膜结构, 使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组,此时相互接触的两细胞的胞质沟通成为可能,从而造成细胞之间发生融合;20.电穿孔法是指在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲,在质膜上形成纳米大小的微孔,DNA直接通过这些微孔或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布通过质膜进入细胞质中,这种方法称为电穿孔法;P52 接合转化,入噬菌体感染未归纳21.转化率的影响因素.载体及重组DNA方面载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞,其转化率不同;载体的空间构象：与受体细胞亲和性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体; 插入片段大小：对质粒载体而言,插入片段越大,转化效率越低;重组DNA分子的浓度和纯度受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配转化操作的影响22.转化细胞的扩增转化细胞的扩增操作：指转化完成之后细胞的短时间培养;在实验时,扩增操作往往与转化操作偶联在一起,如：∙Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时∙原生质体转化后的再生过程∙λ噬菌体转染后的30℃培养等,均属扩增操作扩增操作的目的∙增殖转化细胞,使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序;∙扩增和表达载体分子上的标记基因,便于筛选;∙表达外源基因,便于筛选和鉴定;23.抗药性筛选法这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法;抗药性筛选法的基本原理：抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子将外源DNA片段插在EcoRI位点：∙非重组子呈 Apr、Tcr∙重组子呈 Apr、Tcr将外源DNA片段插在BamHI位点：∙非重组子呈 Apr、Tcr∙重组子呈 Apr、Tcs抗药性筛选法的基本操作：先将转化液涂布含有Ap的平板再将Ap平板上的转化子影印至含有Tc的平板上在Ap平板上生长,但在Tc平板上不长的转化子即为重组子 P56抗药性标记插入失活选择法∙经过上述抗药性筛选获得的大量转化子中既包括需要的重组子,也含有不需要的非重组子;为了进一步筛选出重组子,可利用质粒载体的双抗药性进行再次筛选;如果外源基因插入在载体的抗药性基因中间使得该抗药性基因失活,这种抗药性标记就会消失,从而筛选出阳性重组子;24. 什么是蓝白斑筛选法这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体;主要是在λ载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌β—半乳糖苷酶的基因片段,携带有lac基因片段的λ载体转入lac的宿主菌后,在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷X-gal平板上形成浅蓝色的噬菌斑;外源基因插人lac或lac基因部分被取代后,重组的噬菌体将丧失分解X-gal的能力,转入lac-宿主菌后,在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷 X-gal平板上形成白色的噬菌斑,非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑;筛选法利用合适的引物,以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行PCR,通过对PCR产物的电泳分析,确定目的基因是否插入到载体中;由于在载体DNA分子中,外源DNA插入位点的两侧序列多数是已知的,可以设计合成相应的PCR引物,以待鉴定的转化子或重组子的DNA为模板进行PCR反应,反应产物经琼脂糖凝胶电泳,若出现特异性扩增DNA带,并且其分子量同预期的一致,则可确定含此重组DNA分子的重组子是期待的重组子;第三章基因工程的常规技术1. 探针有哪些类型探针标记有哪些方法类型：同源或部分同源探针cDNA探针人工合成的寡核苷酸探针标记方法：①5’端标记法②反转录标记法③缺刻前移标记法④ABC标记法4.什么是ABC荧光显色酶标记法ABC 标记法;∙A为Avidin生物素抗性蛋白,每个Avidin分子可结合3 - 4个生物素分子；∙B为Biotin生物素,每个Biotin分子可结合2个Avidin分子；∙C为Complex,首先将Biotin共价结合在探针分子上,荧光胺标记在Avidin上,两者形成复合物,即可将荧光胺标记在探针上,发出的荧光也能使普通胶片感光;如果将某一生色酶接在Avidin上,并辅以合适底物,则杂交反应还可直接以颜色反应检测,这一技术称为酶标技术5.亚克隆法∙亚克隆：是将克隆片段进一步片段化后再次进行的克隆;∙一般是将重组DNA分别用几种限制性核酸内切酶切割后,将所得各片段分别重组到载体上再转化宿主细胞,然后通过转化细胞的表型鉴定或鉴定,获得含有目的基因的重组子;此时,该重组分子中的无关DNA区域以被大量删除;6. 菌落嗜菌斑原位杂交的基本原理、流程∙该项技术是直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌和变性处理后使DNA 暴露出来并与滤膜原位结合再与特异性DNA探针杂交,筛选出含有插入序列菌落;∙操作步骤：∙①菌落生长∙②转移到NC膜上∙③DNA释放和变性∙变成单链DNA：∙ 10％SDS NaOH∙④中和 Tris-HCl pH∙⑤固定 80 ℃ 120’∙⑥杂交包括预杂交,加探针DNA杂交∙⑦放射自显影∙⑧对照比较,选出重组克隆7.鸟枪法∙鸟枪法：将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的 DNA 片段,分别连接到载体 DNA上,转化受体细胞,形成一套重组克隆,从中筛选出含有目的基因的期望重组子;鸟枪法制备目的基因的主要步骤∙①目的基因组DNA片段的制备超声波处理：片段长度均一,大小可控,平头末端;原核生物的基因长度大都在2Kb以内,真核生物的基因长度变化很大,最大的基因可达100Kb以上;全酶切：片段长度不均一,粘性末端便于连接,但有可能使目的基因断开,大小不可控;部分酶切：片段长度可控,含有粘性末端,目的基因完整;∙②DNA片段与载体连接如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择表达型载体;∙③重组DNA分子导入受体细胞如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择能使目的基因表达的受体细胞;∙④筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法筛选模型的建立;∙⑤目的基因的定位利用鸟枪法获得的期望重组子只是含有目的基因的 DNA 片段,必须通过次级克隆或插入灭活,在已克隆的 DNA 片段上准确定位目的基因,然后对目的基因进行序列分析,搜寻其编码序列以及可能存在的表达调控序列;法酶促逆转录主要用于合成分子质量较大,转录产物mRNA易分离的目的基因;这种方法以目的基因的mRNA为模板,在逆转录酶的作用下合成互补的DNA,即cDNA,然后在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA片段,与适当的载体重组后转入受体菌扩增,获得目的基因的cDNA克隆; 的分离纯化绝大多数的真核生物mRNA在其3’端都存在一个多聚腺苷酸的尾巴,利用它可以迅速的将mRNA从细胞总的混合物中分离出来,将寡聚脱氧胸腺嘧啶共价交联在纤维素分子上,制成亲和层析柱,然后将细胞总的RNA混合物上层析柱分离,mRNA会挂在层析住上,后洗脱即可分离10. 简述PCR技术的基本原理,PCR反应体系的主要成分与主要程序是怎样的PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物;过程：PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火复性：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链;重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板;每完成一个循环需2～4分钟, 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍;11. 什么是基因组文库其构建方法是怎样的是指将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存在可以长期保存的稳定的重组体中,以备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因,这种保存基因遗传信息的材料,就称为基因文库又称DNA文库;基因组文库构建的一般步骤①载体的选择和制备;②高纯度、大分子量基因组 DNA 的提取;③基因组 DNA 的部分酶切与分级分离;④载体与DNA片段的连接;⑤转化或侵染宿主细胞;⑥筛选鉴定基因组及保存;12. 基因组DNA文库的质量标准除了尽可能高的完备性外,一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：∙重组克隆的总数不宜过大,以减轻筛选工作的压力∙载体的装载量最好大于基因的长度,避免基因被分隔克隆;∙克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域,以利于克隆排序;∙克隆片段易于从载体分子上完整卸下;∙重组克隆能稳定保存、扩增、筛选;基因文库的构建通常采用鸟枪法和cDNA法13.外源DNA片段的切割原则片段之间要有一定的重叠序列片段大小要均一文库构建的步骤∙细胞总RNA的提取和mRNA的分离∙第一链cDNA合成∙第二链cDNA合成∙双链cDNA的分级分离∙双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖∙重组体的筛选与鉴定第四章基因在大肠杆菌、酵母的高效表达1. 启动子∙启动子：是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始转录的序列,其大小在20～300个碱基,是控制基因转录的重要调控元件;在一定条件下mRNA的合成速率与启动子的强弱密切相关,而转录又在很大程度上影响基因的表达;∙启动子的特征：①序列特异性②方向性③位置特性④种属特异性2.启动子类型∙组成型启动子：是指在该类启动子控制下,结构基因的表达大体恒定在一定水平上,在不同组织、部位表达水平没有明显差异;∙组织特异启动子：又称器官特异性启动子;在这类启动子调控下,基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达,并表现出发育调节的特性;∙诱导型启动子：是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下,该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平;目前已经分离了光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等;3.终止子终止子：是位于结构基因下游的一段DNA序列,基因转录时,该序列被转录为mRNA的一部分,并形成特殊的二级结构,由此终止基因的转录;序列SD序列：mRNA中起始密码子上游8-13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序,它可以与30S亚基中的16S rRNA 3’端富含嘧啶的尾部互补,形成氢键结合,有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始5.密码子不同生物对密码子的偏爱性1.生物体基因组中的碱基含量2.密码子与反密码子的相互作用的自由能3.细胞内tRNA的含量6. 密码子偏爱性对外源基因表达的影响∙由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性,因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择;一般而言,有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：∙外源基因全合成∙同步表达相关tRNA编码基因7. 包涵体及其性质在某些生长条件下,大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子,它们致密地集聚在细胞内,或被膜包裹或形成无膜裸露结构,这种水不溶性的结构称为包涵体8. 包涵体的形成机理∙①折叠状态的蛋白质集聚作用;∙②非折叠状态的蛋白质集聚作用∙③蛋白折叠中间体的集聚作用;9. 包涵体的分离检测∙包涵体的分离主要包括菌体破碎、离心收集以及清洗三大操作步骤;10. 分泌型目的蛋白表达系统的构建∙包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外,但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白细菌素分泌到培养基中,这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白,它激活定位于内膜上的磷酸酯酶A,导致细菌内外膜的通透性增大∙因此,只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞;此时,用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞,并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录,则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌;11融合蛋白表达质粒的构建原则：∙受体细胞的结构基因能高效表达,且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化;。

第一章：基因工程概述2．基因工程的三大要素是什么3．重组DNA技术的五大单元操作过程分别是什么4．简述外源基因稳定高效表达的主要战略思想6．试比较四代基因工程的基本定义7．如何理解重组DNA的安全性8．简述基因工程（包括重组DNA技术）的三大用途。

第二章：DNA重组克隆的单元操作1．用于DNA重组克隆的载体的功能是什么2．质粒DNA和病毒（噬菌体）DNA作为载体的主要特征是什么3．如何理解质粒的不相容性及其在DNA重组克隆过程中的运用意义4．列举表达质粒、穿梭质粒、探针质粒和cos质粒的不同用途5．II类限制性核酸内切酶的主要酶学特征是什么6．在DNA重组克隆实验中为什么通常使用T4-DNA连接酶而不用其他连接酶7．KLenow酶与大肠杆菌DNA聚合酶I在结构和功能上的主要区别8．影响限制性核酸内切酶活性的主要因素有哪些？9．如何理解粘性末端比平头末端更容易连接10．在重组DNA技术中常使用的微生物转化方法有哪些？11．为什么外源DNA难以转化野生型的微生物受体细胞12．简述转化率和重组率的基本概念以及在DNA重组克隆实验中的指导意义。

13．简述转化子筛选与重组子鉴定的三大基本战略14．探针、引物、接头的物质基础和用途分别是15．简述分离克隆目的基因四大战略及其适用范围16．简述基因文库的基本概念以及构建技术要点。

第三章：大肠杆菌的基因工程7．简述包涵体复性工作的原理9．简述大肠杆菌工程菌遗传不稳定性的主要表现形式和解决途径酶系用于核酸操作的酶有哪些：1限制性核酸内切酶2DNA连接酶3DNA聚合酶4核酸酶5核酸修饰酶限制性核酸内切酶定义：能够特异性的识别双链DNA某段特殊序列，并切割DNA双链的酶，主要存在于原核细菌中。

主要作用有:1保护自身的DNA不受限制2破坏外源DNA使之迅速降解限制性核酸内切酶的命名：属名+种名+株名寄主微生物属名的头一个字母（大写）种名前两个字母（小写）II类限制性核酸内切酶特性：特异性识别特定回文序列，并在识别序列里或附近切割DNA双链。

第一章基因工程概述第一节基因工程的诞生和发展一、基因1．Mendel的遗传因子阶段Mendel . (1822-1884). 1856-1864豌豆杂交实验。

1866年发表论文，提出分离规律和独立分配规律1900年Mendel遗传规律被重新发现遗传学的元年Mendel提出：生物的某种性状是由遗传因子负责传递的。

是颗粒性的，体细胞内成双存在，生殖细胞内成单存在。

遗传因子是决定性状的抽象符号。

2．Morgan的基因阶段1909年丹麦遗传学家Yohannsen (1859-1927)发表了“纯系学说”首先提出了“基因”的概念，代替了Mendel “遗传因子”的概念。

但没有提出基因的物质概念。

1910年以后，Morgan .等提出了基因的连锁遗传规律。

说明了基因是在染色体上占有一定空间的实体。

基因不再是抽象符号，被赋予物质内涵。

3．顺反子阶段1957年，本泽尔（Seymour Benzer）以T4噬菌体为材料，在DNA分子水平上研究基因内部的精细结构，提出了顺反子（cistron）概念：顺反子是1个遗传功能单位，1个顺反子决定1条多肽链。

4.现代基因阶段（1）操纵子启动基因＋操纵基因＋结构基因（2）跳跃基因指DNA能在有机体的染色体组内从1个地方跳到另一个地方，它们能从1个位点切除，然后插入同一或不同染色体上的另一个位置。

（3）断裂基因1个基因被间隔区分成不连续的若干区段，这种编码序列不连续的间断基因被称为断裂基因。

（4）假基因不能合成出功能蛋白质的失活基因。

（5）重叠基因不同基因的核苷酸序列有时是可以共用的即重叠的。

现代对基因的定义是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。

二、基因工程的诞生一般认为1973年是基因工程诞生的元年（S. Cohen等获得了卡那霉素和四环素双抗性的转化子菌落)理论上的三大发现和技术上的三大发明对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。

（一）DNA是遗传物质被证实1944年，Avery .利用肺炎双球菌转化实验1944年，美国洛克菲勒研究所的Oswald Avery等公开发表了改进的肺炎双球菌实验结果。

第一节基因工程的原理1．简述基因工程的诞生。

2．简述基因工程的原理及技术.3．尝试DNA的提取与鉴定.一、基因工程的诞生1．限制性内切酶——“基因手术刀”（1）作用：能够识别特定的脱氧核苷酸序列,并于特定位点上准确地切割双链DNA。

（2）结果:形成DNA黏性末端。

2．DNA连接酶—-“基因缝纫针”(1）作用:将两个DNA片段连接起来，修复被限制性内切酶切开的切口，拼接成新的DNA分子.（2)种类：T4DNA连接酶(把限制性内切酶切开的黏性末端的缝隙“缝合”起来)。

思考将人的胰岛素基因导入大肠杆菌，大肠杆菌能够生产人的胰岛素，在基因操作中把人的基因与大肠杆菌的基因“缝合”起来的工具是什么？提示:DNA连接酶。

二、基因工程的一般程序1．基因工程的概念基因工程是指按照人们的意愿，将一种生物的基因在体外剪切，并与特殊的运载工具进行重新组合，然后转入另一种生物的体内进行扩增，并使之表达产生所需蛋白质的技术。

2．基因工程的操作程序（1）DNA分子的提取。

(2）目的基因的获得.①直接分离法:最常用的方法是“鸟枪法”,又称“霰弹法”。

用限制性内切酶（子弹）切割DNA，再用“核酸探针"（用放射性同位素或其他标记物标记的RNA单链）检测出目的基因，再用PCR 仪扩增DNA,获得大量的目的基因。

②人工合成法：一种是反转录法。

它是以目的基因的信使RNA 为模板，借助反转录酶合成碱基互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA.另一种方法是化学合成法。

即依照某一蛋白质的氨基酸序列，通过密码子推导出其碱基序列,然后直接合成目的基因。

（3）重组载体的构建。

①载体的特点:外源DNA的插入不影响载体在宿主细胞内的自我复制；有适宜的限制性内切酶酶切位点;具有某些标记基因；载体应对受体细胞无害。

②载体的种类。

a．质粒：它是细菌中独立于细菌DNA之外的小型环状DNA 分子。

它含有一个至多个限制性内切酶切割位点，供外源基因插入其中,并带有特殊的遗传标记基因，是基因工程中最常用的载体。