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④真空冷冻干燥法 加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干 燥。 适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活 时间长，是目前最好的保藏方法。 ⑤液氮超低温保藏法 将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低 温冰箱中（ -196℃）。 适用于各种微生物的较理想的保藏方法。
几种常用菌种保藏方法的比较
方法名称
实验二微生物的分离纯化_图文_图文.ppt
内容提要
• 分离 • 纯化 • 形态观察
（1）接种
• 半固体培养基：穿刺接种 • 液体培养基接种 • 普通琼脂培养基：涂布平板，平板划线接种，斜
面划线接种 • 浅盘固体接种
划线接种注意要点
• 划线时接种环与平皿约成30-40度角,轻轻接触, 以腕力在琼脂表面轻快滑动,不能划破琼脂.
同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落
（4）菌种保藏
• 最常见的保藏方法：斜面 • 细菌的保藏：甘油保藏 • 真菌的保藏：石蜡油保藏、孢子保藏
菌种保藏的方法
菌 种 保 藏 方 法

连续在培养基上（内）移种
生活态 传代培养保藏法 连续在活宿主上（内）移种
固体斜面
湿法 半固体琼脂柱
真菌分离
• 利用低碳／氮比的培养基可使真菌生长菌落 分散，利于计数，分离和鉴定。这里主要是 利用营养成分的减少而使生长减慢，并由此 限制真菌的迁涉生长。
• 一般采用PDA培养基 • 改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分
离。 • 有时，真菌子实体形成必须有光线，这在分
离培养时应加以考虑。
（2）纯化
2、琼脂平板在使用前应置于37℃培养箱中孵育l 、2天。
3、培养基的生物物理学参数，如pH及盐分也应 调节到与试样的生态系统参数值相近。

2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法
（1）牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA)
由于BSA是血清蛋白，它对细胞活性的影响很小，是早期应用连续 或不连续密度梯度分离细胞的最常用介质，但BSA黏度很高，分离细胞 必须长时间离心，且用量大，费用高，故现在已经部分被其它分离介质 取代。
1.解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离
将用于体外细胞培养的动物组织材料制备成细胞悬 液，然后接种并培养，是原代培养的最常规方法。
由于从体内切取的大多数组织（少数结缔组织如血 液、骨髓、淋巴等除外），均是由细胞和少量的细胞间 质（后者内一般含有纤维成分）紧密结合而成的实体组 织。如果直接将所取的组织块用来培养（此即为植块培 养），在培养的组织块大于1 mm3时，培养过程中只有位 于植块周边的细胞容易获得营养而存活和生长发育。
为了获得大量细胞培养物，必须将组织解离，将组织 块内部细胞与细胞之间的“组织关系”解除，将细胞“解 放”，使之成为分离（离散）的细胞，这个过程即为细胞 分离（离散）或分散（cell dissociation)。
细胞分离（离散）或分散并不等于细胞分离和纯化， 但是，细胞分散是细胞纯化的前提。目前所建立的体外分 离和纯化细胞的方法，绝大多数是从细胞悬液中进行分离 和纯化的。
分离和纯化细胞的过程不仅仅是在原代培养之前进 行，有时候，分离和纯化细胞的过程还贯穿在原代与继 代培养的过程之中，甚至主要依靠培养过程实现分离与 纯化细胞的目的。
培养物中细胞成分是否单一或者目的细胞在培养物 中的比例如何，常常是衡量某一培养工作是否成功的重 要指标。
四、细胞分离与纯化
根据所要分离纯化的对象和目的不同，可以采用不同 的细胞分离纯化方法，从简单的手工操作技术到使用自动 控制的特别是电脑控制的尖端仪器。

凝聚值：使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度。反离子的价数越高， 该值就越小，即凝聚能力越强。
絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大 絮凝团的过程。
絮凝剂：是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可高达数 万至一千万以上，它们具有长链状结构，其链节上含有许多活性官 能团，包括带电荷的阴离子或阳离子基团以及不带电荷的非离子型 基团。
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三、其他固液分离方法
1．切向流过滤：又称错流过滤、交叉过滤和十字流过滤， 是一种维持恒压下高速过滤的技术。其操作特点是使悬浮 液在过滤介质表面作切向流动，利用流动的剪切作用将过 滤介质表面的固体(滤饼)移走，过滤速率就近似恒定。 (1)用泵循环使悬浮液流经过滤介质。 (2)在过滤介质表面加以搅拌造成流动，产生切向流。
二、调整pH：等电点沉淀法
三、凝聚与絮凝
四、加入助滤剂：助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它 能使滤饼疏松，滤速增大。如：硅藻土、纤维素、石棉 粉、珍珠岩、白土、炭粒、淀粉等。
五、加入反应剂：不影响目的产物，可消除发酵液中某些
杂质对过滤的影响，提精高品p过pt 滤速率。
பைடு நூலகம்
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凝聚与絮凝
凝聚：指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位 下降，而使胶体体系不稳定的现象。
到液相，然后经固液分离除去固相；对于胞内产物，则应首
先收集菌体或细胞，经细胞破碎后,目的产物进入液相，随
后再将细胞碎片分离。 精品ppt
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第一节 发酵液过滤特性的改变
微生物发酵液的特性可归纳为：
①发酵产物浓度较低，大多为1％一10％，悬浮液中大部分 是水；
②悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；
③固体粒子可压缩性大；

树脂中留下了大大小小、形状各异、互相贯通的孔穴，且孔径较大，在100～1000nm之间， 故称为大孔吸附树脂。大孔树脂的表面积较大、交换速度较快、机械强度高、抗污 染能力强、热稳定好，在水溶液和非水溶液中都能使用。已广泛应用于废水处理、 医药工业、临床鉴定和食品等领域，在我国，采用大孔吸附树脂分离纯化中药提 取液已越来越受到人们的重视。
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6）、分离的技巧 （1） 流速不可太快，切切不可性急。 （2）柱子尽可能长， Sephadex LH-20 柱长的增加将极大地改善分离。 （3） 馏分一定要接的细，可1／10，或1／20 个保留体积接成一馏分。 （4） 洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积。 （5）鞣质成分死吸附严重，不可用Sephadex LH-20 分鞣质或原料中不能有
萃取法原理一致，对于分离具有非常相似性质的混合物效果较好。
③微分萃取 P46 ④ 液滴逆流分配法（DCCC）：本法必须选用能生成液滴的溶剂系统，且对高分子化
合物的分离效果较差，处理样品量小，并要有一定的设备，操作较繁琐。
⑤其它 P47
（5）注意事项 ①萃取剂用量
②乳化
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7、pH梯度萃取
•溶剂洗脱能力顺序：
•水<甲醇<丙酮<氢氧化钠溶液<甲酰胺<二甲基甲酰胺<尿素水溶液 ❖与鞣质吸附不可逆
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二 、精细分离方法
➢ 1、葡聚糖凝胶层析法
➢ 1）葡聚糖凝胶的分类 ➢ 葡聚糖凝胶（Sephadex-G)：水中使用，分离多糖、蛋白质等物质
➢ 羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20)：水溶液或非极性溶液中使用，可