微生物菌种高通量筛选技术与装置PPT

★Stacking Unit 堆叠速率：可调，与输送机自动配合。 堆叠高度：2 - 15板平皿，可调 堆叠桌面：500 ´ 500 mm可扩充 尺寸重量：81cm(L)*49cm(D)*45cm(H),13kg
自动灭菌培养基制备机
全自动培养基分装系统
750皿/小时
培养基 倒平板 出发株 诱变等 10倍稀释 涂平板 单菌落 接种
9
10
11
12
A 0.330 0.331 0.331 0.330 0.331 0.330 0.331 0.332 0.331 0.331 0.331 0.330
B 0.332 0.333 0.333 0.332 0.332 0.333 0.333 0.333 0.333 0.333 0.332 0.332
56名科学家、10万份土样、历时1年 25%市场
1984年，Pfizer提出Automation Project. 1990年，在Nagoya, Japan实施
1万株份/周
菌种高通量筛选技术与装备国际进展
微生物菌种筛选一般流程 概率事件 通量限制步骤
培养基
出发菌株
倒平板 诱变等 10倍稀释 涂平板 单菌落
对操作条件的平行性没有足够的认识仅注重培养环节高通量忽略其他步骤匹配和瓶颈的转移问题高通量筛选是提高成功几率的一种技术手段菌种高通量筛选技术组成高通量前处理技术高通量培养技术高通量液体处理技术高通量转接种技术高通量克隆制备技术菌种库管理技术高通量数据管理技术高通量分析检测技术菌种高通量筛选技术分析测试高通量培养菌种资源菌种高通量筛选技术通量匹配限制瓶颈在不断克服和转移菌种高通量筛选技术菌种高通量筛选技术是一整套高通量技术的有机整合和合理匹配红霉素生产菌株的微型化培养及分析菌落库孔板培养离心检测微型化培养就摇瓶与微孔板之间的生理发酵参数和动力学参数进行了研究以证实微型化培养方法的可行性为红霉素产生菌高通量筛选奠定了基础

诱变育种
总结词
诱变育种是一种通过使用物理、化学或生物诱变剂，诱发微生物发生基因突变，从而获得所需性状的育种方法。
详细描述
诱变育种通常需要处理少量材料，因为诱变剂可以直接诱发基因突变。该方法效率较高，可以快速获得所需的突 变体。常用的物理、化学诱变剂包括紫外线、X射线、化学诱变剂等。生物诱变剂则包括某些细菌或病毒等。
培养条件控制
法规与伦理问题
微生物的生长和代谢受到培养条件的影响 ，如温度、pH、氧气浓度等，这些条件的 细微变化可能导致实验结果的波动。
在某些应用领域，如药物和食品工业，微 生物菌种选育可能面临严格的法规和伦理 要求，需要遵循相关规定和标准。
未来的发展方向
高通量筛选技术 随着高通量筛选技术的发展，未 来可以更快地筛选到具有优良性 状的微生物菌种，提高选育效率 和成功率。
基因组编辑技术
总结词
基因组编辑技术是一种通过精确地编辑微生物的基因组序列，从而获得所需性状的育种方法。
详细描述
基因组编辑技术包括CRISPR-Cas9等基因编辑技术，可以精确地编辑和修改微生物的基因组序列，从 而获得具有优良性状的菌株。该方法需要一定的基因组编辑技术基础，但具有高效率和精确性等优点 。
在医药领域的应用
抗生素生产
许多抗生素是由微生物产生的，通过 菌种选育可以获得高产抗生素的菌株 ，用于治疗各种疾病。
疫苗生产
疫苗的生产也需要用到菌种选育技术 ，通过选育具有特定抗原性的菌株， 可以生产出预防各种疾病的疫苗。
在环境保护中的应用
生物治理
通过菌种选育可以获得具有高效降解能力的 菌株，用于处理各种环境污染，如废水处理 、土壤修复等。例如，通过选育能够降解有 机污染物的细菌和真菌，可以有效治理水体 和土壤污染。

超带的某些特点，
如抗药性初步判断。
特定的质粒提取方
法和后处理使染色
体和RNA均被除掉。
26
质粒的主要功能
质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的； 在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能， 从而使宿主得到生长优势。
27
4. 质粒的主要类型
37
（4）Ti质粒（tumor inducing plasmid）
即诱癌质粒或冠瘿质粒（crown gall plasmid）。
Ti质粒是一种200kb的环状质粒，包括毒性区（vir）、 接合转移（con）、复制起始区（ori）和T-DNA区4部分。
T-DNA区可携带任何外源基因整合到植物基因组中， Ti质粒是植物基因工程中使用最广、效果最佳的克隆载体。
7
S型
R型
（1）动物实验
S型，著致名病菌的，肺炎球菌转化R型试，验非致病菌，
具荚膜，菌落表面光滑（smoth）无荚膜，菌落表面粗糙（rough）
加热灭菌
热死S菌＋活R菌
8
9
（2）细菌培养试验
10
（3）S型菌的无细胞抽提液试验
11
Avery在四十年代以更精密的实验设计重复了以上实验 12
（1）从活的S菌中抽提各种细胞成分（DNA，蛋白质， 荚膜多糖等） （2）对各组分进行转化试验
严紧型复制控制（stringent replication control）
质粒的复制与核染色体的复制同步， 在这类细胞中，一般只含1～2个质粒；
松弛型复制控制（relaxed replication control）
另一类质粒的复制与核染色体的复制不同步， 在这类细胞中，一般含10～15个或更多质粒。

实验4-1 降解苯酚微生物的选育
4.性能测定。 初筛：制备不同含酚浓度的耐酚平板培养基，苯酚浓度 为0.025%、0.045%、0.060%、0.075%，将选出的耐酚力强的 的菌株在以上平板培养基上划线分离，自高酚浓度平板上长 出的菌落，即为酚降解力高的菌株。 复筛：将初筛纯化的菌种分别接入碳源对照培养液a和苯 酚培养液b中， 30℃振荡培养48h，0、12、24、36、48h取样 测A600光密度值，绘制生长曲线，以不含酚的碳源(葡萄糖) 培养液为对照。若与对照相比，在250mg/L苯酚浓度培养液中 生长速度下降不明显，同时，用4-氨基安替比林法检测发酵 初时发酵液和发酵终止时发酵液苯酚浓度，计算降解率，若 苯酚降解率达>80%，表明确系分离到有效苯酚降解菌。
实验4-1 降解苯酚微生物的选育
五、实验报告 1．记录分离得到的苯酚降解菌情况于表4-1。 2．根据复筛耐酚试验，绘制对照组与试验组生长 曲线。 3．记录在平板上和显微镜下观察的苯酚降解菌的 菌落特征和镜检特征。
实验4-1 降解苯酚微生物的选育
表4-1 苯酚降解菌株的降解率
菌源
菌株
0.025 %
实验4-1 降解苯酚微生物的选育
三、实验材料 1.菌源 含酚工业废水或含酚废水曝气池中的活性污 泥。 2.培养基 耐酚真菌培养基(固体、液体和斜面)，耐 酚细菌培养基(固体、液体和斜面) ，碳源对照培养液a，苯 酚培养液b，见附录Ⅲ。 3.试剂 2% 4-氨基安替比林溶液，8%铁氰化钾溶液， 氯仿，氨性氯化铵缓冲液，溴酸钾-溴化钾溶液，硫代硫酸 钠溶液, 1%淀粉溶液，（见附录Ⅴ）。 4.其他 稀释分离所用的无菌水，无菌培养皿，无菌 移液管，测定酚所用的移液管，容量瓶，试剂瓶，酸式滴定 管等。

保藏 活化
初筛 复筛 前处理 检测
工艺
放大
自动细菌平板稀释仪
出发菌株
培养基 倒平板 诱变等 10倍稀释 涂平板 单菌落
保藏 活化
接种到 多孔板
初筛 复筛 前处理 检测
验证
工业应用
4600个克隆/小时
培养基 倒平板 出发株 诱变等 10倍稀释 涂平板 单菌落 接种
保藏 活化
培养
初筛 复筛 工艺 放大 前处理 检测
Laborious Laborsaving
Series Parallel
大家应该也有点累了，稍作休息 大家有疑问的，可以询
内容提纲
高通量筛选在微生物育种中的重要意义
菌种高通量筛选技术与装备国际进展
高通量筛选技术应用示范
高通量筛选技术的起源
➢ 1929，1940s-1950s ➢ Pfizer公司：土霉素的发现
高可靠性
Collision detection & recovery冲突检测 与恢复
Plate sensing in the gripper微孔板传感 器
Servo gripper – does not drop a plate when the power goes out!伺服抓板手即使停电也不会让一个板子掉落
微生物菌种 高通量筛选技术 与装置
内容提纲
高通量筛选在微生物育种中的重要意义
菌种高通量筛选技术与装备国际进展 高通量筛选技术应用示范
高通量筛选在微生物育种中的重要意义 ➢ 菌种发酵水平是企业产品市场竞争力的体现
1、菌种是发酵技术的源头 2、菌种是发酵技术的核心之核心 3、菌种提高不增加设备材料投入
56名科学家、10万份土样、历时1年 25%市场

3.2原生质体制备：去除细胞壁是制备原生质体的
关键，一般采用酶解法去壁。多酶混合除壁效果较好。
影响因素：菌体前处理、菌龄、酶浓度、酶处理 温度、PH、渗透压稳定剂（不仅起保护原生质体免于 膨裂，而且还有助于酶和底物的结合。
原生质体对渗透压极其敏感，低渗引起细胞破裂。 多采用甘露醇、山梨醇、蔗糖等有机物和氯化钾和氯 化钠等无机物。稳定剂的浓度一般均在0.3-0.8mol/L 之间。
切酶只能识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使 每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开（切
割DNA分子）
作用结果：平未端及粘性未端 .
32
• 什么叫黏性末端？
被限制酶切开的DNA两条单链的切口， 带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互 补配对，这样的切口叫黏性末端。
.
33
• 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几 个切口？可产生几个黏性末端？
始于1976年，最早是在动物实验中发现的， 后来早微生物中得以应用。使细胞间基因重组 的频率大大提高了，已大于10-1 （而诱变育种 一般仅为10-6 ）。发生基因重组亲本的选择范 围更大，可以在不同种、属、科，甚至更远缘 的微生物之间进行。
.
14
三. 原生质体融合
在有些情况下，两种或多种微生物在共同存
• 运载体的作用有哪些？
作用一：作为运载工具，将外源基因转移到 受体细胞中去。
作用二：利用运载体在受体细胞内，对外源 基因进行大量复制。
.
38
（一）载体
基因克隆载体条件：
（1）具有能使外源DNA片段组入的克隆位 点。
（2）能携带外源DNA进入受体细胞或游离 在细胞质中进行自我复制，或整合到染色 体DNA上随DNA复制而复制。

精选课件ppt
2
在提高筛选品质方面，由于过去对菌 体生理了解不够，只能随机筛选（random selection），大量筛选无特定标记的突变株， 因此筛选效率不佳；其后由菌株的生理研 究，以及由实际研发的经验，发展出合理 定向筛选（ rational selection ）技术。
精选课件ppt
3
菌种筛选方案
第三轮、第四轮…(操作同上)
精选课件ppt
5
初筛和复筛工作可以连续进行多轮， 直到获得较好的菌株为止。采用这种筛选 方案，不仅能以较少的工作量获得良好的 效果，而且，还可使某些眼前产量虽不很 高，但有发展前途的优良菌株不致于落选。
筛选获得的优良菌株还将进一步做工 业生产试验，考察它们对工艺条件和原料 等的适应性及遗传稳定性。
NS
100
100
UV
102
107
UV+VHr 127
135
34
39.16
38
41.69
47
60.09
精选课件ppt
26
替考拉宁推理选育结果（3）：
表3 菌株98-1-227传代后的生产能力和TA2-2组分含量
传代
相对活力
TA2-2(%)
1
100
56.21
2
102
59.99
3
98
55.54
4
85
48.38
图 精吡选哆课醇件p与pt 代谢拮抗物异烟肼的分子结构 15
梯度培养法培育若干代谢产物的生产菌
代谢产物 肌苷 肌苷 腺嘌呤 烟碱酸 色氨酸 甲硫氨酸 酪氨酸 亮氨酸 吡咯叠氮
生产菌 短小芽孢杆菌 棒杆菌 鼠伤寒沙门氏杆菌 衣藻 伤寒沙门氏杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌 伤寒沙门氏杆菌 金色假单胞菌

表土，取5--20 cm 处的土样几十克，
盛入事先灭过菌的防水的袋中，并在上
记录采土时间、地点和植被情况。采好 的土样应尽快分离。
5
（二） 增殖培养（富集培养）
利用选择性培养基的原理，在土样中加入 某些特殊的营养物，创造一些有利与待分离对 象生长的条件，使其大量繁殖，从而有利于分 离它们。也可以通过控制培养条件，达到富集 的目的。
36
一、菌种的退化
（一）菌种退化的现象
• 菌种退化是由于自发突变的结果，而使某 物种原有的一系列生物学性状发生量变或 质变的现象。 • 注意区分有环境条件改变造成形态和生理 上的暂时改变；以及杂菌污染情况。
37
1. 菌种退化的表现
生产形状的劣化，遗传标记的丢失， 原有的典型形 状的不典型等。

1. 接种环灭菌
2. 从琼脂平板(A)或培 养液中取培养物
3. 划线分离
12
平板反应快速检出法
• 根据分离培养基上的特异反应来挑选目的 菌的一种快速、简捷的方法。 • 与样品纯种分离同时进行 • 检测单菌落是否产目的产物，并对目的产 物量进行粗略的估计
13

平皿反应快速检出法
• • • • • 纸片培养显色法 透明圈法 变色圈法 生长圈法 抑菌圈法
目前保藏有3900多种微生物总数达35万株52中国工业微生物菌种保藏中心cicc归口轻工业总会中国食品发酵工业研究所iffi中国高校工业微生物资源与信息中心cicmcu江南大学中国农业微生物菌种保藏中心accc归口中国农业科学院中国农业科学院土壤与肥料研究所isf53中国医学微生物菌种保藏中心cmcc归口卫生部中国医学科学院皮肤病研究所id南京卫生部药品生物制品检定所nicpbp中国预防医学科学院病毒研究所中国抗生素微生物菌种保藏中心cacc国家医药管理局中国医学科学院医药生物技术研究所四川抗生素研究所sia四川华北制药厂抗生素研究所ianp石家庄54中国兽医微生物菌种保藏中心cvcc归口农业部农业部兽药监察研究所ncivbp中国林业微生物菌种保藏中心cfcc归口中国林业科学院中国林业科学院林业研究所rif55美国典型培养物收藏中心atccamericantypeculturecollection3美国北部开发利用研究部nrrl4荷兰霉菌中心保藏所cbs5英国国家典型菌种保藏所nctc6日本大阪发酵研究所ifo56设计型实验要求实验讲义十一自然界中菌种分离筛选的一般步骤子题目

高通量筛选方法 与应用
Content s
高通量筛选
高通量筛选的定 义
高通量筛选系统 的组成
高通量筛选技术
生物芯片 分子阵列技术 荧光检测技术 双杂交系统 噬菌体展示系统
高通量筛选应用
药物筛选 蛋白质定向进化 其他应用
展望
1、高通量筛选简介
❖ 高通量筛选（High Throughput Screening， HTS）是指 以分子和/或细胞水平的实验方法为基础，采用不同密度的 微孔平板作为实验载体和自动化工具操作实验步骤，通过 快速灵敏的检测装置在同一时间内对海量样品进行生物活 性测定、采集实验数据和数字化分析处理，并以相应的信 息管理软件支持整个系统的正常运转的技术体系。
图 5 生物芯片分析步骤
微孔板/微阵列技术
❖ 微孔板技术的发展主要表现在板孔数的增加。目前，使用 最多的是96孔及384孔板，也有人使用1536孔、3456孔、 甚至 9600孔板。
❖ 微阵列技术是将微孔板技术进一步微型化。 ❖ 化合物微阵列芯片技术与基于微珠体的固相组合会成技术
相结合为高通量药物筛选带来了一条新的途径，将对高通 量药物筛选技术的发展产生积极的影响。
哺乳动物细胞检测
放射性检测
非放射性检测
存活检测 生长/生长抑制检测
放射性检测
非放射性 功能检测
过滤方法检测
ELISA 检测
细胞毒性和细胞增殖检测
双杂交检测
报告基因检测
放射免疫
报告基因检测
混合检测
图 4 细胞水平检测
2、高通量筛选常用技术
生物芯片
❖ 生物芯片技术通过微加工和微电子技术在固体芯片表面构 建微型生物化学分析系统，即通过缩微技术将生命科学研 究中许多不连续的分析过程集成于硅片、玻璃片或陶片等 固相密质载体上，形成生物分子点阵，在待分析样品中的 生物分子与生物芯片的探针分子发生相互作用后，对作用 信号进行检测和分析。