新城疫病毒F蛋白在昆虫细胞中的表达及其融细胞作用

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新城疫病毒F48E9株和La Sota株F基因在Bac-to-Bac昆虫杆状病毒系统中的表达

新城疫病毒Ｆ８９和Ｌｏａ株４株ＥａＳｔ
Ｆ基因在Ｂｃｔ— ａａ— Ｂｃ昆虫杆状病毒系统中的表达ｏ
袁萍，闫丽辉冉多良。刘培欣，，，闻晓波，曹殿军
（．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，医生物技术国家重点实验室，尔滨１００；．疆农业大学动物１兽哈５０１２新医学院，鲁木齐乌８０５）３０２
ｏｆＣＡＡＳ，Ｈａｂｎ，５０１．ｏｌｇｆＡｎｍａｄｃｎ，Ｘｉｊｎｒｃｌｕａｉｅｓｔｒｉ１００；２ＣｌｅｏｉｌＭｅｉｉｅｅｎｉｇＡｇｉｕｔｒｌＵｎｖｒｉａｙ，
Ｕｒｍｑ，３０５ｕｉ８０２）Ａｂｓｒｃ：Ｆｅｅｏｆｓｒｉ８ａｄｓｒｉｏｔｆｎｗｃｓｌｓａｅｖｒｗｅｅｎｅｔｄｎｏｈｔａｔｇｎｔａｎＦ４Ｅ９ｎｔａｎＬａＳａｏｅａｔｅｄｉｅｓｉｕｓｒｉｓｒｅｉｔｔｅｔａｎｆｒｖｃｏｒｐｓＢａＨＴＡｔｃｓｒｃｔｒｃｒｓｅｅｔＦａｔｃｏｏｎｔｕｔｗｏｅｏｍｂｎａｔｅｔｒｐｓＢａＨＴ— ８ＦｎｄＦａｔｉｎｖｃｏｓ（ＦａｔｃＦ４ａｐｓ —
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鸡新城疫抗体水平测定赛项理论竞赛样卷(3)

2022年河北省职业院校学生技能大赛鸡新城疫抗体水平测定赛项理论竞赛样卷（3）一、填空题（每空0.5分，共10分）1、把经过抗凝处理的血液离心后，血液被分为明显的上下两层，上层液体为________，下层液体为________，中间一薄层为________。

2、红细胞破裂，血红蛋白逸出的现象称为________。

3、蛋白质在某些物理和化学因素的作用下，其特定的________被破坏，从而导致其生物活性丧失。

4、某些病毒具有凝集红细胞的特性是因为在该病毒表面有________。

5、天气炎热不能马上送检的病毒检验材料可保存于________中，并做到低温保存传递。

6、病原微生物刺激机体产生的抗体可以用________方法检测出来。

7、《中华人民共和国动物防疫法》规定国家对严重危害养殖业生产和人体健康的动物疫病实施________。

8、从事动物、动物产品运输的单位和个人，应当配合做好病死动物病害动物产品的________，不得在途中擅自弃置和处理有关动物和动物产品。

9、OIE规定，新城疫是由新城疫病毒强毒株引起的禽类感染，因此对于新城疫地诊断，除了鉴定新城疫病毒之外，还需要对其________进行评估。

10、我国农业农村部将新城疫列为________。

11、新城疫油乳剂疫苗属于________。

12、将采好的鸡全血呈________度角于4C°冰箱放置1h，然后低速离心3-5min，即可析出血清。

13、《新城疫诊断技术规范》（GB/T16550-2020）指出:新城疫病毒鸡胚尿囊腔接种技术采用________日龄的SPF鸡胚。

14、根据新城疫病毒F基因部分序列差异，可将新城疫病毒分为ClassI和ClassII两大类，其中ClassI在国内均系________。

15、新城疫病毒可感染240多种禽类，其中家鸡和珠鸡最易感，________和________是最主要的传染源。

16、病原微生物侵入机体，并在一定部位繁殖称为________。

基因Ⅶ型新城疫病毒的免疫及生物学基础

基因Ⅶ型新城疫病毒的免疫及生物学基础作者：陈申秒吴雪莉来源：《中国动物保健》2015年第01期摘要：基因Ⅶ型新城疫已成为我国禽业养殖中的主要新城疫类别，在商品肉鸡和蛋鸡养殖临床中成为防治重点，本文从基因Ⅶ型新城疫病毒的分子生物学基础上进行分析，结合生产实践，为养殖一线制定切实可行的防治措施提供比较有价值的参考。

关键词：基因Ⅶ型；新城疫病毒；分子生物学鸡新城疫病毒（New castle disease virus，NDV）属于副黏病毒科，腮腺炎病毒属的单股负链RNA病毒，是危害养禽业最重要的传染性病毒之一，被OIE列为A类疫病。

受养殖环境、免疫压力和生物安全措施等各种因素的影响，鸡新城疫病毒成为最常见，同时也是防控难度最大、问题最多的疫病之一。

全世界曾多次发生新城疫的大流行，研究认为目前处于NDV的第四次大流行期，流行病学研究证实本次流行是由基因Ⅶ型NDV引起的，在亚洲、非洲和欧洲等地区的研究确定为基因Ⅶd亚型引起，虽然没有出现世界性的全面大流行，但局部地区，特别是我国，出现大面积的免疫蛋鸡群产蛋率下降，肉鸡群高死亡率的情况，损失严重。

1 NDV毒力鉴定及基因型研究根据对NDV全基因组的遗传进化分析，NDV只有一个血清型，但可以分为Class I和ClassⅡ2个不同分支。

Class I型被认为是兀毒株或弱毒株，ClassⅡ型包括了基本所有的疫苗毒株，从临床分离的致病毒株基本都是ClassⅡ型，按照F蛋白可将每个群分成9个不同的基因型。

其中I-Ⅳ型和V-VⅢ型基因组长度不同，分别为15186nt、15192nt。

其中目前所用的疫苗毒株Lasota、clone30、N79等毒株均为基因Ⅱ型，当前被国内外学者认为处于NDV的第四次大流行，其主要病原为基因Ⅶ型NDV。

判定NDV强、弱毒的有传统的生物学特性鉴定法和分子生物学鉴定法。

对NDV分离株测定，6周龄静脉接种指数（IVPI）、1日龄脑内接种指数（ICPI）、鸡胚最小致死量（MDT）是用于判定NDV毒力的生物学指标，孙静等对山东分离株NDV强毒株测定的MDT、ICPI、IVPI分别为47.4h、1.975、2.85。

新城疫

鸡新城疫：病鸡十二指肠出现溃疡
鸡新城疫：病鸡肠粘膜淋巴滤泡坏死、溃疡
鸡新城疫：病鸡卵泡严重出血
鸡新城疫：病料接种鸡胚，死亡的胚胎全身出血
六、诊断 1. 临诊诊断典型新城疫，根据流行病学、临床症状和病理变化可作出诊断，表现突然发病，传播迅速，体温升高，呼吸困难，腹泻，神经症状，死亡率高，剖检时可见呼吸道、消
鸡新城疫：病鸡呼吸困难，并发出“咯咯”叫声
鸡新城疫：病鸡呼吸困难
鸡新城疫：病雏鸡呼吸困难
鸡新城疫：病鸡嗉囊内充满酸臭液体，从口腔流出
鸡新城疫：病鸡产蛋减少，并有软壳蛋褪色蛋出现
鸡新城疫：病鸡出现神经症状
鸡新城疫：病雏鸡出现神经症状
鸡新城疫：病鸡腹泻，粪便黄绿色
五、病理变化本病的主要病变是全身黏膜和浆膜出血，淋巴系统肿胀、出血和坏死，尤其以消化道和呼吸道为明显。嗉囊充满酸臭味的稀薄液体和气体。腺胃黏膜水肿，其乳头或乳头间有鲜明的出血点，或有溃疡和坏死，肌胃角质层下也常见有出血点。由小肠到盲肠和直肠黏膜有大小不等的出血点，肠黏膜上有纤维素性坏死性病变，有的形成假膜，假膜脱落后即成溃疡。盲肠扁桃体常见肿大、出血和坏死。气管出血或坏死，周围组织水肿。肺有时可见瘀血或水肿。心冠脂肪有细小如针尖大的出血点。脾、肝、肾无特殊的病变。非典型新城疫，仅见黏膜卡他性炎症，喉头和气管黏膜充血，腺胃乳头出血少见，有的病鸡腺胃乳头有少数出血点，直肠黏膜和盲肠扁桃体多见出血。
NDV的毒力分型必须进行生物学试验，即依据鸡胚最小致死量平均死亡时间(MDT)，1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)和6周龄鸡静脉注射致病指数(IVPI)将新城疫病毒分为三型：缓发型(低毒力型)、中发型(中等毒力型)和速发型(强毒力型)。区分毒型的常用标准是：鸡胚最小致死量平均死亡时间(MDT) 、1日龄雏鸡脑内接种的致病指数(ICPI)、6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)。区分三种毒型的致病指数见下表

siglec-f的表达位置

siglec-f的表达位置全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：Siglec-F是一种跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族的一员。

它在哺乳动物的免疫系统中扮演着重要的角色，主要通过其在不同细胞类型上的表达位置来调节细胞间的相互作用和信号传导。

在本文中，我们将探讨Siglec-F的表达位置及其在免疫调节中的作用。

Siglec-F在小鼠中的表达位置主要集中在各种免疫细胞上，如肺泡巨噬细胞、肺间质细胞、唾液腺上皮细胞等。

它的表达异常会导致肺部疾病的发生和发展，如哮喘、肺炎等。

研究表明，Siglec-F通过与其配体结合，调节免疫细胞的活性和功能，从而影响炎症反应的发生和发展。

Siglec-F在人类肿瘤中的表达位置也备受关注。

研究表明，Siglec-F在多种肿瘤细胞中高表达，与肿瘤的生长、转移和耐药性密切相关。

通过抑制Siglec-F的表达或活性，可以有效抑制肿瘤的发展，提高患者的生存率。

Siglec-F在不同细胞类型和不同疾病中的表达位置和作用有所差异，但都具有重要的免疫调节功能。

未来的研究将进一步探讨Siglec-F的分子机制和调控网络，为开发新的免疫疗法和治疗策略提供重要的理论基础。

Siglec-F的研究将有助于深入了解免疫系统的调节机制，为预防和治疗各种免疫相关疾病提供新的思路和途径。

【注：本文为虚构内容，仅供参考。

】第二篇示例：Siglec-F是一种免疫细胞表面的蛋白质，属于Siglec家族的一部分。

Siglec-F在哺乳动物的免疫系统中发挥着重要的作用，主要是通过与特定糖基相互作用来调节免疫反应。

最近的研究表明，Siglec-F在一些免疫相关疾病中起着关键作用，因此对其表达位置进行深入研究具有重要意义。

Siglec-F主要表达在哺乳动物的免疫细胞上，特别是在巨噬细胞和嗜酸性粒细胞（eosinophils）中。

巨噬细胞是一种对抗病原体和清除死细胞的重要细胞，其表面上的Siglec-F可以通过与特定糖基相互作用来调节巨噬细胞的活性。

f’因子名词解释细胞

f’因子名词解释细胞
f因子（也称为f质粒）是一种在细菌中广泛存在的质粒，它能够在细菌细胞之间传递基因信息，促进基因的水平转移。

质粒是一种环形的DNA分子，存在于细菌细胞中，并且可以自主地复制和传递。

f因子最早发现于大肠杆菌（Escherichia coli），它是一种非必需的质粒，意味着细菌可以在没有f因子的情况下存活。

然而，f因子的存在使得细菌具有了额外的优势，可以更快地适应环境变化。

f因子通过一种称为“接合”的方式进行传递。

在接合过程中，一个细菌细胞（称为供体）通过一种结构称为性连接管（sex pilus）与另一个细菌细胞（称为受体）相连。

接合管使得两个细胞之间可以传递物质，包括f因子以及其他基因片段。

这种传递方式可以促使基因的水平转移，使得细菌之间可以共享有益的基因。

f因子不仅能够传递自身，还具有传递细菌染色体上的基因的能力。

当f因子与细菌染色体融合时，产生了称为Hfr细菌的高频率重组细菌。

Hfr细菌能够通过接合传递自身以及与细菌染色体连接的基因片段。

然而，传递的效率相对较低，因为整个细菌染色体的传递需要较长时间。

f因子的存在对细菌的进化和适应能力起到了重要作用。

它可以传递
抗生素耐药基因、代谢途径基因以及其他有益的基因片段，从而使得细菌能够更好地应对环境压力。

总之，f因子作为一种质粒，具有在细菌细胞之间传递基因的能力。

它通过接合的方式促进基因的水平转移，使得细菌能够快速适应环境变化，并且在进化中发挥重要作用。

新城疫病毒的介绍

新城疫病毒（NeWCaStIeDiseaseVirus）新城疫病毒（NDV）是禽腮腺炎病毒1型的变种，是一种反义单链RNA病毒。

NDV属于感染鸟类的禽腮腺炎病毒（AVUIaVirUS）家族。

通过接触受感染鸟类的粪便和其他排泄物，以及通过接触受污染的食物、水、设备和衣服而发生传播。

菌株NDV毒株可分为VelOgeniC（高毒）、mesogenic（中毒）或IentOgenie（无毒）。

Velogenic菌株会产生严重的神经和呼吸症状，传播迅速，死亡率高达90%。

中源菌株会引起咳嗽，影响鸡蛋质量和生产，并导致高达10%的死亡率。

Lentogenic菌株产生轻微的迹象，死亡率可以忽略不计。

新城疫病毒是典型的副粘病毒，含有包膜与反义RNA。

基因由3∣到S依次是N（核衣壳）、P（磷酸化蛋白）、M（基质）、F（融合蛋白）、HN（血凝素.神经氨酸酶）与L（RNA聚合酶）。

其基因转录具有梯度效应一一从3∣到S依次减少。

虽然副粘病毒会通过对mRNA编辑，在PmRNA上发生移码突变，产生三种蛋白。

但新城疫病毒通过mRNA编辑，只产生P蛋白与V蛋白，而不是三种。

新城疫病毒可以通过血凝试验和神经氨酸酶试验分离到不同的血清型。

NDV主要通过健康家禽与受感染家禽的身体排泄物之间的直接接触传播。

该疾病通过受感染鸟类的粪便和鼻子、嘴巴和眼睛的分泌物传播。

NDV在圈养的鸟类中迅速传播，例如商业饲养的禽类。

在鸟类的身体排泄物中发现了高浓度的NDV；因此，这种疾病很容易通过机械方式传播。

带病毒的物质可以从鞋子和衣服上沾上，然后从受感染的禽群带到健康的禽群。

NDV可以在温暖潮湿的环境中依靠鸟类的羽毛、粪便和其他材料存活数周。

它可以在冷冻材料中无限期地存活。

然而，病毒会被脱水和阳光中的紫外线迅速破坏。

走私的宠物鸟，尤其是来自拉丁美洲的亚马逊鹦鹉，构成了将NDV引入美国的巨大风险。

亚马逊鹦鹉是该病的携带者，但不会表现出症状，并且能够传播NDV超过400天。

新城疫病毒介绍

导致家禽死亡。
F蛋白具有使病毒囊膜与宿主细胞膜融合，进而使病毒核衣壳释入胞浆中的作用。F蛋白基因编码一个553个氨基酸的多肽。 F蛋白首先以非活性前体 FO的形式存在，经裂解形成Fl和F2后，使病毒具有感染性。
HN蛋白识别细胞上的受体位点并与之结合，使自身构象发生变化，进而触发F蛋白构象发生变化，F蛋白构象改变后，其内部的融合多肽释放出来，发挥穿膜作用，引起病毒囊膜与细胞膜的融合；
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一、引言——致病性的分子基础概述
红细胞凝集特性：新城疫病毒表面具有血凝素，所有毒株都能凝集多种禽类和哺乳类动物的红细胞。在病毒的血凝试验中，鸡的红细胞最为常用。马和猪的红细胞则不被凝集。
●病毒和红细胞的结合不是永久性的，一段时间后，在病毒表面神经氨酸酶的作用下，病毒与红细胞分离后又重新悬于液体。
●用丙氨酸代替F1下游丝氨酸（473），丙氨(482)，天门冬氨酸（489），改变F1 螺旋体非保守区，变异F1蛋白的融合能力没有较大改变。这说明HR保守区具有与细胞膜相接触和促进细胞融合的作用。[9]
●但是，SV、HPV3以及麻疹病毒的Ｆ蛋白单独作用也可以诱发细胞融合。
（详细文献尚未查到）
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●由此可见，强毒F0分子能被多种细胞或组织中存在的一种或多种蛋白酶所裂解；而弱毒F0分子，仅能在某些特殊宿主细胞类型中生长，其敏感性受限。
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三、 NDV致病性的分子基础——F蛋白的功能
F蛋白
●Reitter等为了研究F1的HR区的变异对Ｆ蛋白生物活性的影响,把481、488、495 处的亮氨酸依次被丙氨酸代替．结果发现单个氨基酸的改变对细胞融合影响较小，而２到３个亮氨酸的改变就取消了F蛋白融合特性，但不影响细胞的跨细胞转运用及蛋白的低糖基化。保守亮氨酸在细胞融合中是必要的，但不是形成糖基化分子所必要的。

新城疫

①新城疫（ND），又称亚洲鸡瘟，伪鸡瘟等，是一种急性、高度接触性传染病。典型新城疫特征为发病急，呼吸困难，头冠紫黑，下痢，泄殖腔出血、坏死，腺胃、腺胃和肌胃交界处以及十二指肠出血，慢性病例常有呼吸道症状或神经症状。虽然已经广泛接种疫苗预防，但该病仍不时在养禽业中造成巨大的损失，目前仍是最主要和最危险的禽病之一。历史与分布一般认为，新城疫1926年首次暴发于印度尼西亚的爪哇和英国的新城，但也有资料认为，此前朝鲜已有类似的疾病发生。Doyle（1927）首次证实该病由病毒引起，命名为鸡新城疫，以便与当时欧洲流行的禽流感相区别。自那以后，新城疫不断传播，至今世界上大多数国家和地区均有暴发该病的记载或道。目前，新城疫仍广泛存在于亚洲、非洲、美洲的许多国家。亚洲，尤其是东南亚，该病时有暴发，使养禽业蒙受巨大的经济损失。我国新城疫的报道最早见于1935年，但估计在此之前已有新城疫的流行。自改革开放以来，我国养鸡业迅速发展，对新城疫的防制水平也有了很大的提高，绝大部分鸡群均进行了新城疫的免疫接种，所以在大中型鸡场已很少有急性新城疫的暴发。但是，这些鸡场中仍有非典型的新城疫或鸡群带毒现象，而在农村散养鸡中，尤其是在冬季，仍时有急性新城疫的发生。新城疫病毒（newcastlediseasevirus，NDV）属RNA病毒中的单股负链病毒目，副粘病毒科，副粘病毒亚科，腮腺炎病毒属的禽副粘病毒。禽副粘病毒目前已鉴定了9个血清型，新城疫病毒属Ⅰ型禽副粘病毒，而其他血清型的禽副粘病毒中，Ⅱ型和Ⅲ型病毒也侵害家禽并造成经济损失。新城疫病毒一般呈球形，直径100nm～500nm，核衣壳呈螺旋对称，有囊膜，基因组为单分子负链单股RNA，大小为15kb～16kb，病毒表面有纤突，内含血凝素神经氨酸酶（HN）和融合蛋白（F）。病毒有血凝特性，能凝集两栖动物、爬行动物、禽类、豚鼠和人的O型红细胞。病毒还有神经氨酸酶活性，能使已凝集

新城疫流行特点与诊断防控

动物生产 502022.11新城疫流行特点与诊断防控王炜（锦州市太和区农业发展服务中心，辽宁锦州 121000）新城疫的病原属于副黏病毒科、副黏病毒属，副黏病毒属共有9个血清型，新城疫属于禽副黏病毒I型。

成熟病毒多呈蝌蚪形，也有的呈不规则圆形，大小为50～400纳米，新城疫病毒表面有囊膜，囊膜有大小两种纤突，在大纤突上有血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA），血凝素能使禽类和哺乳类动物的红细胞产生凝聚，并且这种凝聚可被新城疫抗体所特异性抑制。

小纤突上有融合蛋白，可与受体细胞结合。

新城疫病毒可存活于鸡的任何组织器官以及体液、分泌物或排泄物中，但以肺和脑中的病毒含量最高，骨髓的带毒时间最长。

因为不同病毒株的致病性存在差异，不同动物的易感性也不同，所以感染新城疫病毒后，症状往往存在很大差异。

根据新城疫病毒不同病毒株致病性强弱分为强毒型、中毒型和弱毒型。

也可以根据临床症状情况，分为速发嗜内脏型、速发嗜神经型、中发型、缓发型和无症状肠型。

强毒型新城疫病毒通常不能用于疫苗制备。

1 流行特点包括鸡、火鸡、野鸡、珍珠鸡等各种鸡，以及鸽子和野鸟都能感染，鸭和鹅大多呈隐性感染很少发病，但可以带毒、排毒造成病毒传播。

易感动物在任何日龄感染都可以发病。

以鸡为例，幼龄鸡和育成鸡感染性高，老年鸡易感性低。

本病一年四季均可发生，尤以寒冷季节和气候多变季节多发。

病禽和带毒禽是主要传染源，病毒还能通过迁徙的候鸟传播。

传播方式可以是直接接触传染，也可以通过与被分泌物、排泄物的污染饲料、饮水、垫料、蛋托等间接接触传染，感染途径主要通过消化道和呼吸道，也可以通过创伤的黏膜以及交配感染。

感染以后的严重程度与临床病理分型，决定于新城疫病毒的毒力以及被感染鸡体内新城疫抗体水平。

速发型死亡率达到90%以上，其他病型的死亡率相对较低。

2 临床症状2.1 最急性型鸡群突然发病，迅速死亡，没有明显的临床症状，多见于疫病流行初期的雏鸡。

2.2 急性型速发嗜内脏型：病鸡体温升高到43～44℃；精神沉郁，羽毛逆立，蔫头耷脑，眼一睁一闭或呈眯眼状态，严重时呈昏迷状态，食欲显著减少甚至废绝；腹泻，主要排绿色稀便，也有的排白色稀便；呼吸困难，咳嗽，常表现张口呼吸，伸脖，有异常喘鸣音，口中常有黏液；病鸡常常出现嗉囊积液肿胀，倒提病鸡可见口角流出酸臭液体；产蛋鸡产蛋率急剧下降，可降至40%～60%，白皮蛋、软皮蛋增多，严重时甚至产蛋停止。

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第21卷6期中国病毒学21（6）：571-574收稿日期：2006-05-16, 修回日期：2006-07-06* 江苏省教育厅资助项目(JH03-028); 全国优秀博士论文作者专项资金资助项目(200256)作者简介：王桂军(1969-)，男，安徽阜南籍，博士生，安徽农业大学副教授，从事动物病原分子生物学研究。

** 通讯作者. Corresponding author. E-mail: aijian@572 中国病毒学第21卷组病毒，而且表达的外源蛋白能够进行糖基化等修饰，具有天然蛋白的生物学活性[6]。

本研究中我们采用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统表达了我国新城疫病毒标准强毒株F48E8株F基因，为进一步研究F基因的生物学功能和新城疫基因工程疫苗创造条件。

1材料和方法1.1细胞、载体及主要试剂转座用E.coli DH10Bac、杆状病毒转移载体pFastBac1、逆转录酶M-MLV、总RNA 提取试剂和Lipofectin脂质体转染试剂购自Invitrogen公司；pGEM-T easy vector、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶为Promega公司产品；琼脂糖回收试剂盒为QIAGEN公司产品；FITC标记的羊抗鼠IgG为Sigma 公司产品；沉淀性TMB底物溶液购自天为时代公司；新城疫病毒F48E8株和Sf9昆虫细胞为本实验室保存；抗NDV小鼠血清由本实验室制备。

1.2 RT-PCR和F基因的克隆参考GenBank已发表的NDV F基因序列设计一对引物，5’端分别引入Bam HI和Xba I酶切位点，P1: 5’-GACGGATCCGCCCATTCAAAGTGCAAGAT-3’，P2: 5’- GCCTCTAGAGCCTCTTGTCTGCATTCACA-3’。

RNA的提取按Invitrogen公司的总RNA提取试剂液操作说明进行；在引物P1和M-MLV反转录酶作用下合成cDNA，然后立即进行PCR。

PCR回收产物和pGEM-T载体按3:1比例连接，转化，小提质粒，酶切鉴定正确后，命名为pGEM-NDF，由上海联合基因公司进行测序。

1.3表达转移载体质粒的构建和重组病毒的获得按照参考文献[7]进行。

主要步骤：用Bam HI和Xba I双酶切pGEM-NDF质粒和pFastBac1载体，构建pFast-NDF质粒，然后将pFast-NDF重组质粒转化DH10Bac感受态细胞，获得的单个白色菌落经连续纯化4次。

重组Bacmid DNA的提取、PCR鉴定和转染按照Bac-to-Bac使用手册（Invitrogen）进行。

1.4 昆虫细胞表达的F蛋白的特异性检测间接免疫荧光检测 SDS-PAGE和Western-blot以P3代重组杆状病毒于96孔板感染Sf9细胞，27℃培养观察细胞变化，至感染后6d固定细胞，按常规方法进行间接免疫荧光检测。

SDS-PAGE和Western-blot按参考文献[8]进行。

1.5表达的F蛋白的免疫原性用感染P3代重组杆状病毒和野生杆状病毒的Sf9细胞，待细胞出现病变后收集细胞，经腹腔免疫小鼠免疫，每次每只150万个细胞，间隔10d后再次免疫，3次免疫后采集小鼠血清，按参考文献[1]进行间接免疫荧光检测和病毒中和试验。

2结果2.1F基因的扩增和克隆以F48E8株病毒RNA为模板，经RT-PCR 扩增出一条约1.7kb特异的目的片段。

以Bam HI和Xba I酶切鉴定重组质粒pGEM-NDF，结果获得了与预期大小一致的DNA片段, 表明F基因克隆成功(图１)。

图1重组质粒双酶切鉴定Fig.1Identification of pGEM-NDF by restriction dige stionusing Bam HI and Xba I1, λHandⅢ DNA Marker; 2, pGEM-NDF.2.2 PCR方法证明F蛋白表达载体构建成功用上述方法构建的pFast-NDF质粒经Bam HI和Xba I双酶切后电泳，结果获得约1.7kb的目的条带和约4.77 kb大小载体条带(图2)。

用pFast-NDF质粒转化大肠杆菌DH10Bac，白色菌落经连续四次传代后，提取reBacmid-NDF重组质粒(图3)，进行PCR 扩增，结果扩增出约1.7kb的特异性片段，证明F基因成功转座；用reBacmid-NDF重组质粒转染Sf9图2 pFast-NDF酶切鉴定Fig.2Identification of pFast-NDF by restriction digestion 1, pFast-NDF digested with Bam HI and XbaI; 2, 1kb Marker.图3reBacmid-NDF重组质粒PCR鉴定Fig.3Identification of reBacmid-NDF by PCR1, reBacmid-NDF; 2, λ HandⅢ Marker.王桂军, 等. 新城疫病毒F 蛋白在昆虫细胞中的表达及其融细胞作用 573细胞，结果获得了重组杆状病毒，命名为rBac-NDF 。

2.3 F 蛋白在sf9昆虫细胞中成功表达对感染了rBac-NDF 的昆虫细胞进行免疫荧光检测，结果表明，感染了rBac-NDF 的Sf9细胞能与NDV 多抗血清发生反应，在感染的Sf9细胞膜上产生特异的亮绿色荧光，而野生型昆虫杆状病毒感染的Sf9细胞呈阴性反应，说明F 蛋白在昆虫细胞内得到表达（图4）。

图4 重组杆状病毒表达F 蛋白的间接免疫荧光检测Fig. 4 Indirect immunofluorescence assay for F protein expressed in insect cellsA: 96 hours post-infection with rBac-NDF; B: 120 hours post-infection with rBac-NDF ; C: Sf9 cells infected with wild baculovirus.2.4 表达的F 蛋白具有融合细胞作用在rBac-NDF 病毒感染Sf9细胞后48h ，细胞即开始变圆；96h ，细胞逐渐出现多个细胞聚合，形成明显可见的细胞融合，而野生杆状病毒感染Sf9细胞仅出现细胞变圆病变，但没有细胞间融合现象，未感染正常细胞则有较多的细胞分裂相(图5)。

• 图5 重组杆状病毒表达的F 蛋白的细胞融合作用•Fig. 5 Fusion activity of F protein expressed in Sf9 cells infected with rBac-NDFA: post-infection 120h with rBac-NDF; B: post-infection 120h with wild baculovirus; C: Normal sf9 cells without infection2.5 特异性抗NDV 抗血清能识别F 基因表达产物以NDV 多抗血清为一抗，HRP 标记的羊抗鼠IgG 为二抗，TMB 显色进行Western blot 分析，结果发现，在分子量60kDa 左右出现一条特异性带，说明抗NDV 多抗血清能特异性识别F 基因表达产物，进一步证实了NDV F 基因在杆状病毒表达系统中获得了表达（图6）。

2.6 重组杆状病毒表达的F蛋白能诱导机体产生特异性中和抗体用重组杆状病毒和野生杆状病毒感染的sf9细胞经腹腔免疫小鼠，免疫量为每次150万个细胞，三免后进行间接免疫荧光检测。

结果用重组杆状病毒感染的sf9细胞免疫的小鼠血清有明显的荧光反应，而野生杆状病毒感染的小鼠血清没有检出特异性荧光。

免疫小鼠血清分别以1:25，1:50，1:100，1:200, 1:400, 1:800稀释，与200 TCID 50 NDV F48E8株等量混合感染鸡胚成纤维细胞 (Chicken embryo fibroblasts, CEF)，测得对CEF 的半数保护量（PD 50）为10-2.24，说明重组杆状病毒表达的F 蛋白具有良好的免疫原性，能诱导产生特异性中和抗体。

图6 SDS-PAGE 和Western-blot 分析Fig.6 SDS-PAGE and Western-blot analysis for F proteinexpressed in insect cells1/2, SDS-PAGE; 3/4, Western-blot; 5, Protein Maker ；1, 4, Recombinant baculovirus; 2, 3, Wild baculovirus.3 讨论新城疫是危害养禽业的最主要的传染病之一，免疫接种是我国控制新城疫的主要措施[9]。

F 蛋白作574 中国病毒学第21卷为NDV 的最主要保护性抗原，一直是构建DV亚单位疫苗和重组疫苗的研究热点。

本研究选用我国标准强毒株F48E8株F基因为目的基因，并用Bac-to-Bac 系统成功表达了F 蛋白，为研究F 蛋白的生物学功能和新城疫活病毒载体疫苗奠定了良好的基础。

细胞融合是胞饮、膜代谢、病毒穿入、细胞间信息传递的重要生物学过程，而对新城疫病毒来说，细胞融合则是侵入宿主的一个非常重要的步骤，也是其毒力表现的象征。

本研究用杆状病毒表达了我国标准强毒F48E8株的F蛋白，间接荧光检测发现表达的F蛋白主要分泌在昆虫细胞膜，并在重组杆状病毒感染96h，感染细胞出现融合，这种融合作用显然没有HN蛋白的参与。

Deng 等则报道了NDV F和HN的相互作用导致宿主细胞发生融合，认为HN 吸附细胞后产生了一种信息传递，使F蛋白空间构型发生改变，从而显示出融合细胞的功能[15]。

可见病毒蛋白的细胞融合作用是一个复杂的过程，这种融合作用不仅与F蛋白本身的结构有关，而且与所处的pH值、胰酶的作用等有关。

因此，研究病毒感染引起细胞融合的发生机理了解病毒的致病机理和感染具有重要的理论和实际意义，有关F蛋白的生物学作用正在深入研究。

F蛋白作为NDV 的最主要保护性抗原一直是新城疫疫苗研究的主要靶抗原，国内外用多种病毒载体表达了F蛋白，而重组病毒表达的F蛋白是否裂解成F1和F2对其免疫原性有很大影响[11~13]。

Murakami等[14]研究证实，重组杆状病毒表达NDV F 蛋白分布在昆虫细胞的外膜上，强毒株的在昆虫细胞内可部分被裂解，而弱毒株的F蛋白在培养的昆虫细胞内不裂解，用强毒株的F蛋白作为亚单位疫苗免疫鸡能够提供完全保护。

Kamiya N报道了无毒株的F蛋白的免疫保护性较差，而强毒株F 蛋白对鸡致死性攻击有完全保护作用[10]。