03植物激素的配制方法灭菌方法

植物组织培养目录一.植物组织培养综述1.1概念1.2 研究历史1.3技术原理1.4培养特点二. 实验实施预先准备2.1培养基贮备液配制2.2各种植物激素配制2.3各种培养基配制和灭菌三、植物组织培养过程3.1接种过程3.2试管苗的培养3.2.1丛生芽诱导培养3.2.2继代增殖培养3.2.3生根诱导培养3.2.4 移栽定植植物组织培养一.植物组织培养综述1.1概念植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。

狭义组织培养是指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。

1.2 研究历史如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活；1902年，德国植的预言。

近几十年来植物组织培养技术已经发展成为一项新兴无性繁殖技术。

1.3技术原理植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）、组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株。

1.4培养特点1.4.1培养条件可以人为控制组培采用的植物材料完全是在人为提供的培养基和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。

1.4.2生长周期短，繁殖率高组培是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。

另外，植株也比较小，往往20-30天为一个周期。

实验二培养基的配制及灭菌一、实验目的：1. 掌握常用培养基的制备方法；2. 了解培养基的成分、类型及特点；3. 学会玻璃仪器的洗涤和灭菌前的准备工作。

4.了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程和分装方法。

二、实验原理人工配制的培养基是植物组织培养的营养基础，不同材料对培养基的要求不尽相同，适当地设计和选用培养基对组织培养是至关重要的，一个完整的培养基配方应包含有无机盐、有机营养、水、植物生长调节剂、琼脂及其他成分。

培养基的主要成分的详细内容见课本p26~29。

为了省时和减少多次称量的误差，一般先将药品配制成浓缩一定倍数的母液，用时稀释，储存于冰箱低温（2~4摄氏度）中待用。

基本培养基有8中母液，即大量元素母液、微量元素母液、有机物母液、钙盐母液、铁盐母液、肌醇母液、镁元母液、生长调节物质母液，基本培养基的配制方法有两种：一是可以将培养基的每种成分配成单一化合物的母液，便于配制不同种类的基本培养基时使用；二是配成几种不同的混合液，这样在大量配制同一种培养基时更省时、省力。

在配制母液时应注意防止沉淀产生。

绝大多数生长调节物质不溶于水，可以加热并不断搅拌促使溶解，必要时加入稀酸或稀碱等物质促溶。

各类植物生长调节物质的用量极小,它们对外植体愈伤组织的诱导和根、芽等器官分化起着重要和明显的调节作用。

通常使用的浓度单位是mg/L。

配制好的培养基应在24h之内完成灭菌工作，以免造成杂菌大量繁殖。

灭菌方法有：高温高压灭菌、过滤除菌、射线除菌等方法。

培养基常采取高压灭菌的方法，灭菌时间一般是在0.105MPa压力下，温度121摄氏度时，灭菌时间应根据容积的体积确定，所需最少时间见课本P32表2ˉ2。

培养基必需保证绝对无菌，否则因其营养丰富细菌、真菌极易滋生而导致植物死亡。

灭菌后的培养基不宜马上使用，以免造成培养材料的损失。

（一）、组成培养基的五类成分目前，大多数培养基的成分是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等五类物质组成的。

实验九植物激素配制与应用实验一、目的熟悉几种常用植物激素的配制方法及其应用。

二、材料及设备2、4—D钠盐、赤霉素、乙烯利、95%乙醇、标定过的氢氧化钠、酚酞、量筒（100ml，10ml各一个）、50ml滴定管、滤纸、烧杯（250ml）、三角瓶（250ml）、试剂瓶（1000ml）、喷雾器。

三、药剂配制1、 2、4—D：准确称取2、4—D钠盐1g，溶于200ml水中，搅拌待药剂全部溶解后倒入1000ml的容量瓶中，加水至1000ml定容。

再倒入1000ml的试剂瓶中，即成为1000ppm的2、4—D溶液，贴上标签，放于阴凉避光处备用。

如果是2、4—D原粉，2、4—D原粉在水中的溶解度低。

需先加入酚酞1—2滴作指示剂，用氢氧化钠溶液滴定，至红色消失为止，然后再加水稀释至1000ml即可。

2、赤霉素(GA3、920)：准确称取结晶赤霉素20mg，用95%的乙醇1ml溶解（赤霉素不溶于水，而溶解于酒精），然后加水稀释至200ml，即成为100ppm赤霉素溶液。

再倒入试剂瓶中，贴上标签，放在冰箱中或冷凉的阴暗处备用。

3、乙烯利（2—氯乙基磷酸）：目前国产的乙烯利均为40%的酸性溶液，易溶于水，使用时只要先计算好所需要的浓度与体积，现配现用，简便。

四、生长调节剂的应用1、2、4—D应用：2、4—D对花芽分化和花蕾的发育有抑制作用，当未被处理的菊花已经盛花时，花芽分化开始时用0、01ppm2、4—D喷布的菊花呈初花状态，用0、1ppm 喷布的菊花呈花蕾透色期，用5ppm喷布的花蕾尚小（现蕾期）。

2、赤霉素的应用：（1）赤霉素有代替低温解除休眠的作用，如牡丹在早春或冬季催花时，经赤霉素处理可促使花芽在4—7天内萌动，处理浓度，以1000-2000ppm为宜，处理方法是先将脱脂棉放在充实肥壮的牡丹花芽上，然后每天将棉球滴湿，直至开始萌芽为止。

（2）促进生长，提前开花：GA3促进山茶生长发育，使之提前开花。

处理浓度200-400ppm为宜，处理方法是8月开始用GA3点滴冬芽2—3滴，每周滴一次，至开花止。

实验一培养基的配制与灭菌一、目的掌握培养基母液的配制方法；培养基的配制和灭菌技术；不同质地实验用品的灭菌方法。

二、方法步骤1、母液配制一般大量元素、微量元素和其它成分分别配制成100－200倍母液，使用时按比例稀释即可。

配好的母液需贮存于2～4℃的冰箱中，定期检查有无沉淀和微生物污染，如果出现沉淀或微生物污染，则不能使用。

2、植物激素配制植物激素一般配制成浓度为0.1—1.0mg/ml的溶液，贮存在2～4℃下备用。

由于多数激素难溶于水，所以配制时应按下面步骤进行：IAA：先用少量95%乙醇使之充分溶解，再加蒸馏水定容至需要浓度的体积。

NAA：可溶于热水中，也可采用与IAA同样的方法配制。

2,4-D：先用少量1mol/L的NaOH溶液充分溶解，然后缓慢加入蒸馏水定容至需要浓度体积。

细胞分裂素类：KT和BA等细胞分裂素类物质均溶于稀盐酸，应先用少量1mol/L的HCl溶解后再稀释至需要浓度。

赤霉素：赤霉素的水溶液稳定性较差，一般用95%的乙醇配制成5～10mg/ml的母液低温保存，使用时再稀释。

3、培养基配制按实际配制培养基体积，取各母液的需要量加入一适当体积的烧杯或其它配制培养基的容器中，再加入实际配制培养基体积约2/3—3/4的蒸馏水，然后以每升所用蔗糖的量称取放入培养基并使其溶化。

用0.1mol/L的NaOH或0.1mol/L的HCl调整pH至5.6—5.8，以0.6%—0.8%的比例加入琼脂，并搅拌加热使琼脂完全溶化，用蒸馏水定容至终体积，混合均匀后分装于培养器皿中，然后进行高压灭菌。

4、培养基灭菌分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌条件为温度121℃，压力0.105MPa，灭菌时间与培养基容量的关系如下表所示。

培养基体积与灭菌时间的关系三、结果与分析1、培养基的母液配制情况。

2、培养基配制时的注意事项。

四、提交实验报告附：MS培养基配方。

●可高压灭菌：IBA，NAA ，6-BA，2,4-D●不可高压灭菌：IAA，GA3●水杨酸不是很清楚，参考wiki上“科尔贝－施密特反应（Kolbe-Schmitt反应）是干燥的酚钠或酚钾与二氧化碳在加温（125-150°C）加压（100atm）下生成羟基苯甲酸的反应。

它是向芳环上引入羧基的一种常用方法，常用的工业原料水杨酸（邻羟基苯甲酸）就是利用此法，通过苯酚盐与二氧化碳作用制得的。

”而高压灭菌锅的温度和压强分别为121°C和0.15Mpa（压力表的数值，实际为0.25MPa即2.5atm），我个人认为水杨酸高压灭菌会分解。

因为从上可以看出水杨酸的分解就是科尔贝－施密特反应的逆反应，看反应式便明白加压有利于正反应，而减压有利于逆反应，而121°C的灭菌温度基本与合成反应的温度相持，2.5atm的压强却远小于合成反应，明显是有利于逆反应进行。

故我认为水杨酸不宜高压灭菌。

如果不确定的话可以做个实验，配一小瓶水杨酸溶液高压灭菌，灭过后观察其会不会有粉红色，有的话就说明产生苯酚并氧化成对苯醌了。

●配制生长素类，例如IAA、NAA、2.4-D、IBA，应先用少量95%乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸馏水定容到一定的浓度。

●细胞分裂素，例如KT，应先用少量95%乙醇或无水乙醇加3~4滴1mol/L的盐酸溶解，再用蒸馏水定容。

●配制生物素，用稀氨水溶解，然后定容。

一般来说感觉用醇溶后较容易析出，而且溶解也不容易，还是用少量酸或碱溶，再用蒸馏水定容●植物激素配制方法●植物激素：每种激素必须单独配制成母液，浓度为0.1mg/ml，0.5mg/ml，1.0mg/ml，激素浓度的表示方法多种，ppm（mg/L）、mol/L、mg/ml，用时根据需要取用。

由于多数激素难溶于水，它们的配法如下：●生长素：1 IAA，IBA用适量无水乙醇或1M NaOH彻底溶解后，再缓慢加入水定容到一定浓度。

实验一细胞工程实验室、器皿的洗涤与灭菌一、目的要求通过实验，培养学生良好的卫生习惯、树立组织培养的无菌意识；掌握组织培养实验室器皿的洗涤与灭菌方法。

二、材料与用具2%新洁尔灭、高锰酸钾、甲醛、70%酒精、洗涤剂、喷雾器、各种培养器皿、工作服、口罩和手套等。

三、方法步骤1、地面、墙壁和工作台的灭菌将配好的2%新洁尔灭溶液倒人喷雾器中，对地面、墙壁、角落均匀地喷务。

在喷房顶时间，注意不要让药液滴入眼睛。

2、无菌室和培养室的灭菌首先将房子关闭，然后用10ml甲醛和5g高锰酸钾的配比液进行熏蒸。

操作时要戴好口罩和手套，用甲醛与高锰酸钾配比时要注意避开烟雾。

3、培养器皿的洗涤与灭菌将培养器皿先用肥皂水或洗衣粉浸泡几小时，然后用清水冲洗，最后用三级水和一级水各冲3遍，烘干后备用。

四、实验报告1、将本次实验内容整理成实验报告2、简述组织培养实验室的灭菌过程与注意事项。

实验二:细胞培养基的配制及灭菌一、目的要求：1．了解基本设备以及有关仪器的用途与功能。

2．通过实际操作，学会洗涤剂的配制和各种器皿的清洗和灭菌方法。

3．通过掌握培养基对母液制备及常用培养基的配制和灭菌方法，为植物组织培养准备合适的营养条件。

4．每四人一组，每人接种一个三角瓶，2支试管；每两组制备一套培养基母液。

二、材料用具：每组所需器皿：50ml三角瓶×8 ；试管×16试剂瓶×5（200ml、2×1000ml、100ml、500ml）容量瓶烧杯量筒漏斗玻璃棒移液管pH试纸称量纸封口膜橡皮筋标签纸记号笔所需仪器：高压灭菌锅、烘箱、超净工作台、百分之一与万分之一天平、电炉、冰箱、所需药品：重铬酸钾、浓硫酸等、CaCl2·2H2O，KNO3，MgSO4·7H2O，NH4NO3，KH2PO4，Na2—EDTA，FeSO4·7H2O，MgSO4·4H2O，Zn SO4·7H2O，H3BO3，KI，NaMoO4·2H2O，CuSO4·5H2O，CoCl2·6H2O，甘氨酸，盐酸硫胺素，盐酸吡哆醇，烟酸，肌醇，蔗糖，琼脂，HCL,NaOH,酒精。

植物组织培养植物组织培养是把植物的器官，组织以至单个细胞，应用无菌操作使其在人工条件下，能够继续生长，甚至分化发育成一完整植株的过程。

植物组织培养基础理论：植物细胞全能性（totipotency)是组织培养的理论基础。

一个生活的植物细胞，只要有完整的膜系统和细胞核，它就会有一整套发育成一个完整植株的遗传基础，在一个适当的条件下可以通过分裂、分化再生成一个完整植株，这就是所谓的细胞全能性。

植物组织经过脱分化作用，形成愈伤组织，经过再分化作用，愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。

早在1957 年Skoog 即发现培养基中植物激素的类型和它们的比例，对再分化过程起着重要的作用。

培养条件：①在无菌条件下进行人工操作。

②保证水、无机盐、碳源（常用蔗糖）、氮源（含氮有机物）、生长因子（维生素）等营养物质的供应。

③需要添加一些植物生长调节物质，主要是生长素和细胞分裂素。

④愈伤组织再分化到一定阶段，形成叶绿体，能进行光合作用，故需光照。

操作步骤：一、母液的配置1、MS大量元素母液的配制一般将大量元素配制成10倍的母液，使用时再稀释10倍。

按照配方表中用量依次分别称取扩大10倍的：NH4NO3 、KNO3 ,KH2PO4 、MgSO4.7H2O 、CaCl2.2H2O的量，所有药品称取完毕后用蒸馏水逐个溶解，待全部溶解后，最后定容至1000ml，转入1000ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。

2、MS微量元素母液的配制一般将微量元素配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍。

按照配方表中用量分别依次称取：MnSO4 •4H2O、ZnSO4•7H2O 、H2BO3 、NaMoO4•2H2O、CuSO4•5H2O、CoCl2•6H2O扩大100倍的量，用蒸馏水逐个溶解，待全部溶解后，用容量瓶定容至1000ml，转入1000ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。