叶绿素的提取及叶绿素铜钠的合成与测定
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单位：班级：实验操作人：实验同组人：实验地点:指导老师：实验操作时间：叶绿素的提取及叶绿素铜钠的合成与测定一、实验目的1．分析叶绿素铜钠的纯度，计算产率。
2．从绿色植物中提取叶绿素并算提取率。
3．利用光谱技术对合成的叶绿素铜钠进行初步表征4．初步研究用叶绿素合成叶绿素铜钠的条件二、实验原理叶绿素是一种含有卟吩环的天然色素，它与蛋白质结合存在于植物的叶和绿色茎中，是植物进行光合作用的催化剂。
叶绿素难溶于水，易溶于有机溶剂。
通常说的叶绿素是指由多种含镁卟啉化合物共存的混合物，有a,b两种R=CH3者为a型R=CHO者为b 型叶绿素一旦离开活性植物体，就很不稳定，；把叶绿素转化为叶绿素铜钠盐，就解决了上述问题。
叶绿素铜钠盐也有a，b型。
b 型中的—CHO在多步反应中易被氧化，以钠盐形式存在。
将蚕沙中萃取的叶绿素粗品（无溶剂物称糊状叶绿素），经皂化、置铜、纯化和成盐等几步后，就可得出叶绿素铜钠盐成品。
鉴别叶绿素铜钠盐的纯度要看它的吸光度（E1%1cm405nm），在规定条件下，吸光度值大，叶绿素铜钠盐含量高。
其中E1%1cm不低于568。
利用多波长分光光度法对产品叶绿素铜钠进行初步表征。
测定叶绿素铜钠质量的三项指标：吸光度比值、游离铜含量、干燥失重。
a和叶绿素b分子式如下：叶绿素与碱发生皂化反应：叶绿素分子中的镁原子和四个吡咯上的氮原子相结合，环上是双羧酸的酯，一个被四所酯化，另一个被叶醇基所酯化，故可以发生皂化反应生成钠盐：C55H72MgN4O5+ 2 NaOH →C34H30O5N4MgNa2+ CH3OH + C20H39OH在酸性介质中，叶绿素钠盐分子中的镁极易被氢原子取代生成褐色的叶绿素酸：C34H30O5N4MgNa2 + 4 H+→ C34H34O5N4 + Mg2+ + 2 Na+叶绿素酸可与铜盐加热条件下生成叶绿素铜酸析出，将叶绿素铜酸溶于丙酮，再与碱反应就生成叶绿素铜钠盐：C34H34O5N4 + Cu2+→C34H34O5N4Cu + 2 H+C34H34O5N4Cu + 2 NaOH →C34H34O5N4CuNa2 + 2 H2O蚕粪叶绿素铜钠盐的光谱特性蚕粪叶绿素铜钠盐水溶液在360~700之间有2个吸收峰在波长440处有一最大吸收峰,其吸光度为114;在630处有一较小的吸收峰,其吸光度为017"在波长440的吸收峰为叶绿素铜钠盐特有,而在630处的吸收峰为叶绿素特有,叶绿素铜钠盐的含量约是蚕粪中叶绿素含量的2倍，所以试验中均采用440的波长测定叶绿素铜钠盐的稳定性。
下图是蚕粪叶绿素铜钠盐的光谱特性［5］。
本实验采用稀碱性溶液从蚕沙中提取叶绿素.成分分析方法：叶绿素酸铜钠含量、产品酸碱度、产品干燥失重、游离铜均按GB 3262－82中规定方法进行测定。
三、仪器和试剂（一）、试剂：A、叶绿素铜钠合成101.3g干竹叶，95%乙醇(>600)，5%固体NaOH，浓盐酸，丙酮，500-600mL石油醚，CuSO4，蒸馏水，40%乙醇，5%NaOH水溶液，5%NaOH-乙醇溶液，温度计B、叶绿素铜钠质量分析1、磷酸盐缓冲液（pH=7.5）取0.15mol/L磷酸氢二钠与同浓度的磷酸氢二钾以21：4混合（二）、仪器：A、叶绿素铜钠合成粉碎机，带温度计，搅拌器的烧瓶1个，回流冷凝管1支，恒温槽，100ml个烧瓶，冷凝管，1个抽滤瓶及漏斗，胶管若干，玻璃棒，100mL量筒1个，500ml圆底烧瓶，旋转蒸发器一台，台氏天平1台，试纸若干B、叶绿素铜钠质量分析751分光光度计1台，台式天平、分析天平各一台四、实验步骤（一）叶绿素铜钠的合成1、蚕沙的浸泡及溶液的合成：称取干燥蚕沙50g于500ml的烧杯中，加适量水润洗，加入150ml 80%的丙酮溶液使其完全浸没，置于30-40℃的恒温水浴中搅拌回流，3小时后取出并立即过滤，滤渣复浸一次。
分离得墨绿色溶液转入500ml圆底烧瓶，于60-70℃水浴蒸出丙酮，当温度计读数骤然下降时，蒸发结束。
回收的丙酮可循环用于下一批蚕沙的浸泡，将剩下的溶液从圆底烧杯移至布氏漏斗，抽滤浓缩、风干、称量。
2、皂化：将浓缩液置于带搅拌子三口烧瓶中，用2%到5%NaOH水溶液调节使其p H等于11，用水浴加热在60℃下皂化回流0.5到1小时，收取下层。
3、萃取：将皂化液冷却后转入分液漏斗加入等量石油醚萃取2-3次，除去杂质（黄色）静置分层，下层为可溶性叶绿酸盐（绿色），取下层溶液，上层溶液用旋转蒸发器蒸发回收石油醚。
平行萃取3次。
4、调酸铜代：将下层溶液装入三口烧瓶中，往其中慢慢加入稀（1：1）盐酸溶液调节pH值为7后，按卒取液：加入20ml10%的硫酸铜溶液，再加入10%的硫酸铜，搅拌均匀后，再用盐酸将溶液调节pH为2-3，60℃搅拌1小时。
趁热过滤，用95%乙醇洗涤4次后抽干。
合并滤液和洗液，加入2-3倍的纯水，析出叶绿素铜，静置4小时后过滤，滤饼用适量石油醚洗涤3次至石油醚层变为浅绿色，以除去其中的H+Cl及残留的叶黄素和其他有机杂质。
5、成盐：洗涤结束后滤干，滤饼用丙酮溶解，加入5%NaOH-乙醇溶液，调节pH为11，搅拌，成盐（用滤纸法检验成盐情况：用玻棒点少许溶液放在滤纸上，滤纸不显绿色则说明完全成盐），过滤，滤饼用95%乙醇洗涤4次。
取滤液于小烧杯在60℃下加热蒸发以除去水分得墨绿色结晶物，然后再在60℃下烘箱中烘干结晶物，即制得墨绿色光泽的成品（略有胺味）。
（二）叶绿素铜钠质量鉴定1、标准叶绿素铜钠盐的标准曲线称取标准样品0.01克（精确至0.0002克），加水溶解，移入10mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。
准确取1mL溶液以pH7.5磷酸盐缓冲液定容为100mL，摇匀，即为0.001%溶液，用分光光度计测定，在15分钟内用1cm 的比色杯，在405nm波长处测定吸光值（A），以缓冲液作空白对照。
类似地配制0.0005%溶液、0.0015%溶液、0.002%溶液、0.0025%溶液，用分光光度计测定，在15分钟内用1cm 的比色杯，在405nm 波长处测定它们的吸光值（A），以缓冲液作空白对照，并绘制标准曲线。
2、标准叶绿素铜钠盐的吸收曲线称取标准样品0.01克（精确至0.0002克），加水溶解，移入10 mL 容量瓶中，加水至刻度，摇匀。
准确取1mL 溶液以pH7.5磷酸盐缓冲液定容为100mL ，摇匀，即为0.001%溶液，此液最大吸收峰为405nm 与630nm ， 吸光比A405nm/A 630nm 为3.2～4.0。
用分光光度计测定，用1cm 的比色杯，在350nm-700nm 波长处测定溶液吸光值A （每隔5nm 或10nm 测定一次），以缓冲液作空白对照，并绘制吸收曲线。
3、产品叶绿素铜钠盐的吸光比测定称取烘干成品0.1克（精确至0.0002克），加水溶解，移入100 mL 容量瓶中，加水至刻度，摇匀。
从容量瓶中准确取2mL 溶液移入50mL 容量瓶，用pH7.5磷酸盐缓冲液定容至刻度，摇匀，即为0. 004%溶液，此液最大吸收峰为405nm 与630nm 。
用分光光度计测定，用1cm 的比色杯，在350nm-700nm 波长处测定溶液吸光值A （每隔5nm 或10nm 测定一次），以缓冲液作空白对照，并绘制吸收曲线。
计算吸光比=A Anmnm630405五、注意事项：1. 水浴加热时温度控制不宜加热过快；2. 减压蒸馏时对压力的要求不能过高；3. 保证浸润时间足够、提取完全；4. 实验操作的规范及安全问题。
六、实验结果：（一）产品的产率计算1%水的PH=8.13原料蚕沙的质量M=50.2g滤纸的质量：1.0440g滤纸加产品的质量：1.0704g产品叶绿素铜钠的质量：M1 =1.0704g-1.0440g =0.0264g产品叶绿素铜钠的外观：块状有墨绿色金属光泽固体；叶绿素铜钠产率为W= M1 / M = 0.0264/50×100% =0.0528%(二) 产品叶绿素铜钠纯度由叶绿素铜钠盐标准曲线（见附表一）可得，其标准方程为Y=83460x+0.00987通过测定得0.001%叶绿素铜钠溶液在415nm、655 nm下的吸光度值分别为：A 415＝0.403，A 655 =0.139吸光比：吸光比=A Anmnm655415=139.0403.0=2.9故当A415nm=0.403时，百分含量：x=(0.403-0.0987)/83460=0.00000365=0.000365%，即在称取的样品叶绿素铜钠0.0157g 中实际含有的铜钠盐质量为：m=0.00000365×100=0.000365所以本次实验制备的产品纯度为η=0.000365/0.0157×100%=2.32%表 1 叶绿素铜钠盐标准曲线的测定数据表（光波长405nm）溶液百分数（%）A4050.0005 0.2910.001 0.5430.0015 0.7710.002 0.9980.0025 1.150叶绿素铜钠盐标准曲线表 2 标准样品叶绿素铜钠盐吸收曲线的测定数据表波长/nm 吸光度A 波长/nm 吸光度A 波长/nm 吸光度A 350 0.407 470 0.150 590 0.140 355 0.432 475 0.136 595 0.145 360 0.464 480 0.127 600 0.152 365 0.502 485 0.119 605 0.162 370 0.545 490 0.114 610 0.179 375 0.609 495 0.112 615 0.212 380 0.677 500 0.112 620 0.250 385 0.756 505 0.110 625 0.280 390 0.818 510 0.106 630 0.297 395 0.888 515 0.099 635 0.290 400 0.939 520 0.096 640 0.264 405 0.966 525 0.094 645 0.227 410 0.939 530 0.093 650 0.197 415 0.820 535 0.094 655 0.166 420 0.637 540 0.094 660 0.140 425 0.487 545 0.094 665 0.121 430 0.325 550 0.096 670 0.108 435 0.323 555 0.097 675 0.094440 0.280 560 0.099 680 0.084 445 0.247 565 0.103 685 0.066 450 0.221 570 0.110 690 0.066 455 0.201 575 0.119 695 0.059 460 0.181 580 0.128 700 0.054 465 0.164 585 0.135绘制标准样品的叶绿素铜钠吸收曲线表3 产品叶绿素铜钠的吸收曲线的测定数据表产品叶绿素铜钠的吸收曲线七、实验分析：本实验根据相似相容原理，叶绿素是一种有机物，难溶于水，易溶于有机溶剂。
