基因工程的三大理论基础和三大技术手段

基因工程的三大理论基础和
三大技术手段
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题目：请简要阐述基因工程的三大理论基础和三大技术手段。

1、三大理论基础
基因工程的核心理论来自分子生物学。

一是基因、核苷酸及其结构的发现，尤其是基因控制形状这一基本理论。

孟德尔发现了遗传规律，这是基因控制现状的最初发现，也是基因工程最基础的理论；二是遗传信息的传递以及遗传密码的共享性；三是基因表达调控机制。

1961年，Jacob和Monod提出了操纵子模型，为基因工程中调控基因表达提供了理论基础。

2、三大技术手段
一是限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割；
二是DNA连接酶的发现与DNA片段的连接；
三是基因工程载体的研究与应用。

基因工程绪论1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。

作动词：基因的分离和重组的过程。

2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。

供体、受体和载体是基因工程的三大要素。

3、基因工程诞生的基础三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。

以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。

三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。

2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。

5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。

6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。

7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。

8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。

9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。

10、RNAH降解与DNA杂交的RNA，用于cDNA文库建立时除去RNA以进行第二链的合成。

基因工程各章知识点第一章绪论1．基因工程的首例操作实验三大理论基础：DNA是遗传物质、DNA的双螺旋结构和半保留复制、遗传密码的破译和遗传物质传递方式的确定三大技术基础：限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割、DNA连接酶的发现与DNA片段的连接、基因工程载体的研究与应用基因工程的诞生：72年，P.Berg首次实现体外DNA重组：体外用EcoRI分别切割SV40和λDNA,并用T4 DNA连接酶连接成为重组的杂种DNA分子73年，S.Cohen 体外重组DNA并转化：具Kanr的E.Coli质粒R6－5和具Tetr的E.Coli质粒pSC101切割并连接转化的大肠杆菌具有双重抗性S.Cohen 和H.Boyer首次实现真核基因在原核中表达：将非洲爪蟾的DNA与E.Coli质粒（pSC101）体外切割并连接，转化大肠杆菌2．基因工程的基本概念基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种新物体（受体）内，使之稳定遗传并表达出新产物或具有新性状的DNA体外操作技术，也称为分子克隆或重组DNA 技术。

供体、载体、受体是基因工程的三大基本元件。

3．基因工程的基本操作过程a分离目的DNA片段：酶切、PCR扩增、化学合成等。

b重组：体外连接的DNA和载体DNA，形成重组DNA分子。

c转化：将重组DNA分子导入受体细胞并与之一起增殖。

d筛选：鉴定出获得了重组DNA分子的受体细胞。

e对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。

第二章载体1．理解用PBR322和PUC18作载体的克隆外源基因的原理。

答案不确定PBR322作载体的克隆外源基因的原理:PBR322质粒具有12 种限制性内切酶的单一识别位点：Tet r 基因内有7个酶切位点：Bam HⅠ，SalⅠ：Amp r基因内有3 个酶切位点：PstⅠ。

Eco RⅠ和HindⅢ不在抗生素基因内，不导致插入失活。

（36 – 26）
用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组l-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组l-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的
转化子的筛选和鉴定（检）
重组DNA分子的转化和扩增（转、增）
DNA的体外重组（切、接）
基因工程的操作过程
基因工程的操作过程
切
接
转
增
检
B 基因工程的基本形式
1 基因工程的基本概念
第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程
第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程
基因工程(gene engineering)常和以下名称混用: 遗传工程(genetic engineering); 基因克隆(gene cloning); 分子克隆(molecular cloning); 基因操作(gene manipulation); 重组DNA技术(rebination DNA technique) 克隆(clone): 作名词时指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系. 作动词时是指基因的分离与重组过程。
P
PstI等产生的3‘粘性末端
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’
3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
PstI 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G … 3’
具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点