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细胞支原体污染的PCR检测支原体菌株来源：M.Arginini ATCC23838 精氨酸支原体M.FermentaneATCC19989发酵支原体M.SalivariumATCC23064唾液支原体M.HominisATCC23114人型支原体M.OraleATCC23714口腔支原体M.HyorhinisATCC29052猪鼻支原体其共同引物序列来自16s和23s保守区域外部引物为Ｆ1 5′-ＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡＴ-3′Ｒ1 5′-ＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＴ-3′；内部引物为Ｆ2 5′-ＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴ-3′Ｒ2 5′-ＧＣＡＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴ-3′ＰＣＲ反应体系和条件：10×缓冲液(10ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ、500ｍＭＫＣｌ、20ｍＭＭｇＣｌ2、0.01%明胶)、ＰｒｉｍｅｒＦ1、Ｒ1、Ｆ2、Ｒ2的浓度为2ｎｍｏｌ/μＬ、2.5ｍＭｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ酶、Ｈ2Ｏ、石蜡油覆盖反应温度和时间为:94℃ /2ｍｉｎ预变性、94℃/30ｓ变性、55℃/1ｍｉｎ退火、72℃/1ｍｉｎ延伸循环30次后72℃延伸5ｍｉｎ第1次ＰＣＲ反应取模板10μＬ,第2次ＰＣＲ反应以第1次ＰＣＲ扩增产物为模板取1μＬ。
下面是更详细的：污染测试——支原体：PCR方法原理：利用具特殊专一性之primers，经由PCR反应来复制mycoplasma DNA。
所用之primers来自mycoplasma之conserved 16S-23S rRNA序列，由于此段spacer之序列依mycoplsma种类不同而不同，因此可依所复制之DNA大小及其restriction fragment大小差异来作侦测与鉴定。
特点：灵敏(e.g. 0.1~1.6 CFU / 5 ul sample) 与快速(一天)。
可侦测不易培养之mycoplasma (e.g. M. hyorhinis)。
PCR法检测支原体实验原理：通过对支原体特定的序列设计引物，当存在支原体污染时通过PCR特异性扩增，会将目标DNA特异性的复制，然后通过琼脂糖电泳观检测，会跑出条带出现阳性结果。
反之当没有支原体污染时，由于没有模板，PCR无法扩增，则琼脂糖电泳跑不出条带，出现阴性结果，为确保PCR法的精确性，故需要找到最优的PCR 条件在进行检测。
实验目的：检测培养的细胞是否有支原体污染。
实验材料：0.5ml EP管；PCR管；镊子；手套；口罩；EP管架；移液枪（100ul，10ul）及配套枪头(黄、白)；dd H2O；上下游引物（两组）；dNTPs；10x Buffer；Easy Taq；冰盒；琼脂糖；锥形瓶（200ml）；量筒（50ml）；全套琼脂糖电泳设备（电泳槽，制胶槽，梳子，电源输出）；凝胶成像系统；PCR引物：LZY-5Myco universal F：GGGGAATGGGTGAGTAACACGLZY-5Myco universal R：CGGATAACGCTTGCGACCTATG产物大小：500bpLZY-6mycotest F：GGGAGCAAACAGGATTAGTATCCCTLZY-6mycotest R：TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC产物大小：250bp实验步骤：1、取样：直接取培养细胞的培养基上清。
2、PCR（为25ul体系）1、配制反应体系，根据检测样本数+1个阴性对照（水）+1个阳性对照，算出PCR样本的个数，在此基础上增加几管的量，把除检测培养基外的其他组分按计算好的量加到一起，混匀后分装，最后加入检测培养基。
25ul反应体系5#引物：LZY-5Myco universal反应体系反应条件检测培养基1ul94℃3minLZY-5-F0.5ul94℃30sLZY-5-R0.5ul55℃30s10xBuffer 2.5ul72℃30sdNTP0.5ul25cycles或30cycles Easy Taq0.5ul72℃10min ddH2O19.5ul6#引物：LZY-6mycotest反应体系反应条件培养基1ul94℃3minLZY-5-F0.5ul94℃30sLZY-5-R0.5ul51℃30s10xBuffer 2.5ul72℃20sdNTP0.5ul35cyclesEasy Taq0.5ul72℃5minddH2O19.5ul3.琼脂糖凝胶的制备1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。
支原体测试操作方法
支原体测试操作方法包括以下步骤：
1. 制备标本：向6孔板内滴加待检细胞上清液约1ml，注意设立对照组（已证实的支原体阳性和阴性细胞上清液），培养48h后（VERO细胞汇合前）将细胞爬片从平皿中取出。
2. 漂洗：将细胞爬片置于培养皿中，用不含酚红、NaHCO3的Hanks溶液（或PBS）漂洗3次。
3. 固定：用乙酸：甲醇（1：3）固定液固定10min。
4. 漂洗：待固定液自然风干后用去离子水漂洗3次。
5. 染色：置于Hoechst33258工作液（μg/ml）中染色10min。
6. 漂洗：去离子水中漂洗3次，每次1~2min。
7. 封片，紫外激发，观察。
以上步骤仅供参考，建议咨询专业医生获取准确信息。
细胞支原体检测项目
细胞支原体检测项目主要包括以下几种：
1. 支原体培养：标本取材男性为尿道内口约0.5cm以上，女性提倡子宫颈棉拭子取材，而不用尿培养。
2. 支原体血清学鉴定：微量的酶标免疫法，能检测支原体的8种血清型抗体。
这有助于诊断患者为哪一种支原体血清型感染。
此外还有DNA检测和PCR法等。
3. 基因诊断：利用DNA探针对支原体诊断，其敏感性稍差，但特异性高；聚合酶链反应（PCR），敏感性、特异性均高。
4. 血常规检查：通常感染支原体的白细胞和中粒细胞会增多。
5. X线或CT等影像检查：用于检查肺部损伤情况。
6. 内镜检查：如有必要，对多种支原体导致的尿道感染的患者，进行内镜检查等。
以上项目仅供参考，如有需求，请以医生的建议为准。
细胞培养中支原体污染的检测方法由于细胞支原体污染的隐蔽性及对细胞的严重影响，细胞的支原体污染已经成为了一个比较棘手的世界性难题。
实验室新引进的细胞，应该比较采取一定的方法检疫确定没有支原体污染才能使用。
为了提高动物细胞培养生物制品的质量和安全性，中华人民共和国药典规定主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞应进行支原体检测。
美国食品药品监督管理局(FDA)强烈建议，应该用合适的方法检测细胞的支原体污染状况。
欧洲药典European Pharmacopoeia(EP,7 the dition,Section2.6.7.)规定对细胞治疗产品需要进行严格的支原体检测。
提高对支原体污染的警惕，坚持定期做支原体的检测，努力杜绝污染。
所以寻找一种快速简单灵敏的方法进行细胞支原体常规检测就显得尤为重要。
2017年先达基因（）研发了一种细胞污染支原体检测试剂盒，每次检测只需半个小时，减少了很多工作量，其原理是基于其自主研发的恒温核酸检测技术（ERA），结合恒温荧光定量检测仪，可以在恒定的低温下（25℃-42℃）对痕量的支原体种内保守性DNA 片段进行特异性的扩增，扩增反应可以在20min内完成，该试剂盒检测范围涵盖130种支原体，实现了快速、简单、灵敏的进行细胞支原体常规检测。
1956年，Robinson等首次发现细胞培养物中的支原体污染以来，对其形态、繁殖、分类、体外培养、细胞膜结构和膜蛋白分析、代谢途径等方面都进行了深入研究。
1995年10月，来自马里兰盖瑟斯堡的基因组研究协会(TIGR)与位于ChapelHill的北卡罗来纳州立大学的团队合作，共同完成生殖支原体全基因组580kb测序，这也是人类首次完成支原体全基因组测序的，随后RichardHerrma实验室完成了肺炎支原体全基因组800kb的测序，使得支原体的检测进入分子检测领域成为可能。
到目前为止，出现了很多支原体的检测方法，有传统检测方法（包括直接培养法和DNA荧光染色法）、ATP酶法、免疫法（ELISA法等）以及分子诊断方法（包括普通PCR和荧光PCR、LAMP，重组酶扩增技术等），这些技术在检测时间，检测准确性，灵敏度和特异性上有不同的差别。
支原体检测方法支原体感染是一种常见的性传播疾病，由于其很容易与尿路感染或妇科炎症相混淆，所以早期正确的诊断，有助于及时使用对症的药物来治疗，如抗生素、李小平利尿消炎丸或妇炎丸等。
那么支原体的检测方法有哪些呢？下面我们就来详细的了解一下。
支原体检查方法1、支原体培养法支原体培养法也叫分离培养法，是检测支原体的一种传统方法。
支原体培养法的优点是精确度高，因此被誉为支原体检测金标准，但缺点也很明显，就是所需时间比较长，通常需要4周左右。
该检测方法的主要过程是将患者的样本放置在培养基中，以促使支原体的生长。
以下是支原体培养法的两种常见应用：1.1尿液检测采集患者的中段尿液，将其置于培养皿中，培养皿中含有适合支原体生长的培养基。
然后通过观察培养皿中是否会显示出典型的支原体生长特征，如小结构的细胞典型来判断患者是否患有支原体感染。
1.2生殖道分泌物检测除了尿液检测，支原体培养法还可用于检测生殖道分泌物样本。
通过采集患者的生殖道分泌物，然后与尿液检测一样，将生殖道分泌物置于培养皿中，通过观察是否有典型的支原体生长特征，来判断患者是否感染了支原体。
2、聚合酶链反应（PCR）聚合酶链反应（PCR）是一种现代分子生物学技术，其是检测支原体时间最快但却并不灵敏的方法。
该方法是采用针对支原体DNA的引物用PCR检测可疑样本，其中PCR引物通常针对支原体的16srRNA 基因。
在凝胶电泳过程中，支原体DNA会显示为特异性条带，以此来提示有支原体存在。
虽然PCR法能够检测大多数支原体，但为了保险起见，最好还是同时使用另一种方法来进行验证。
3、DNA检测DNA检测是另一种现代支原体感染检测的方法，它不仅具有高度的敏感性和特异性，还可以用于识别支原体的亚型。
DNA检测需要将标本与指示细胞共同培养，因此一般需要几天时间。
DNA检测所用的指示细胞通常为细胞质区域较大的Vero细胞，如果标本中含有支原体则当细胞DNA被荧光染料（如Hoechst染料）染色时，就可在指示细胞的核周围观察到荧光斑点或荧光颗粒。
生物发光法和qPCR法检测支原体支原体检测试剂盒(MycoAlert Mycoplasma Detection Kit)定义：支原体（mycoplasma），又称霉形体，没有细胞壁的原核生物，为目前发现的最小的最简单的原核生物。
支原体细胞中唯一可见的细胞器是核糖体（支原体是原核细胞，原核细胞的细胞器只有核糖体）。
它对许多抗生素具有抗性，如类胸膜肺炎微生物。
一.支原体污染成为细胞培养的重大隐患:1．研究表明，世界范围内超过15%的培养细胞都有支原体污染。
2．支原体污染会对细胞造成多方面的影响，包括代谢、免疫或生化特性、生长状况、以及细胞存活等多方面的改变。
3．支原体污染会影响实验结果的稳定性、可靠性和准确性。
4．支原体难以检测，同时也很难消除。
支原体能轻易地通过标准滤膜，同时也能拮抗绝大多数的抗生素，给细胞培养造成巨大损失。
二.常规检测才能有效避免细胞支原体污染:1．常规性的进行支原体检测是保证细胞培养中不受到支原体污染影响的唯一途径。
2．传统的支原体检测方法需要在特殊的选择性培养基作用下对样品进行培养，时间往往达数周，费时，费力并且无法获得足够的灵敏度和特异性。
三检测原理美国Lonza MycoAlert Mycoplasma Detection Kit支原体检测试剂盒是利用支原体酶的这一特定活性，进行选择性的生物化学检测。
这些酶的存在提供了一种快速的筛选操作，能灵敏地检测出样本中的支原体污染。
这些存活的支原体被溶解，然后释放出来的酶与支原体检测试剂盒中提供的底物发生催化反应，将ADP转化成ATP。
通过测量样品中添加底物前后ATP的含量，可以得到一个比率，该比率指示支原体是否存在。
如果这些酶不存在，第二次读数相对于第一次读数就没有增加；如果酶与底物进行特异性反应，就会导致ATP含量上升。
ATP含量的上升通过生物发光化学反应可以检测到，其公式如下：LuciferaseATP + Luciferin + O2 ——————> Oxyluciferin + AMP Mg 2+ + PPi + CO2 + LIGHT这个反应的发生是在室温(18°C～22°C)进行的，也是荧光素酶反应的最佳温度。
PCR检测支原体方法如下：
1、吸取待检细胞的培养液100ul，转移入无菌的1.5ml 离心管中。
请注意：待检
细胞必须换液24小时以上，否则会有假阴性结果。
2、将盛有100ul待检培养液的 1.5ml 离心管用金属浴或空气浴在95℃加热
5min。
请注意：加热过程中，要保持离心管的盖子是盖紧的。
（因为在加热时，盖子会自己崩开，可以在离心管上放置书本之类的物品压住盖子）
3、高速离心，13200rpm，1min。
4、配制PCR反应体系：
1）待检样品数量+1个阳性对照+1个阴性对照=总的样品数量。
2）阳性对照是以往确定被支原体污染的样品，阴性对照是灭菌超纯水。
3）PCR反应体系：
H2O（灭菌超纯水）13 ul
Buffer 10×（必须含Mg2+） 2 ul
dNTP 0.8 ul
Primer(+) (10uM) 0.5 ul
Primer(-)(10uM) 0.5 ul
Polymerase 0.2 ul
Sample 3 ul
4) PCR反应程序：
94℃2min
94℃30sec
55℃30sec
72℃20sec
GOTO step 2 , 36 times
72℃7min
5、配制2%的琼脂糖胶，上样量5-10ul。
6、20-30min后观察结果，阳性条带在200-300bp。
引物序列：
Primer(+)：5’GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT3’ Primer(-)：5’TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC3’。
细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍（2016年10月16日）哺乳动物细胞的培养，支原体（Mycoplasma）污染是个世界性的问题。
支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数，导致实验结果的不准确、甚至完全错误。
从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。
相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。
目前，细胞支原体污染常用的支原体检测方法主要有：一、培养法●原理：将待检测样品先接种到支原体液体培养基中大量繁殖，然后再转接种到支原体固体培养基中，培养一段时间后（大约一个月），如果固体培养中，出现典型的支原体菌落，则说明待测样品有支原体污染。
●优点：支原体培养法是相对可靠的支原体检测技术，也是我国药典认可的方法之一。
●缺点：（1）培养法非常耗时的，需要数周，不适合作为细胞培养液中支原体污染的快速检测；（2）通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最常见的支原体，即猪鼻支原体（M.Hyorhinis）。
这是因为猪鼻支原体无法在支原体固体培养基上形成可见的菌落。
而猪鼻支原体约占所有细胞支原体污染的20-50%。
●《培养法支原体检测试剂盒》》主要厂家：读者可以根据《中国药典》中收录的培养法支原体检测方法进行操作。
二、荧光染色法●原理：将待检测样品接种到专门的指示细胞（如：Vero细胞）中，培养一段时间后，用DNA荧光染料（如：Hoechst 33258，DAPI）进行染色，如果除了细胞核被染色外，细胞质也有大量的絮状核酸物质被荧光染料染色，那么这些处于细胞质的核酸物质就是支原体DNA。
●优点：荧光染色法也是我国药典认可的方法之一。
●缺点：（1）该方法灵敏度太低，当检测成阳性时，细胞经常已经严重污染；（2）需要用到专门的指示细胞（如：Vero细胞），如果不用指示细胞而直接对目标细胞进行荧光染色，由于每种细胞繁殖和吸附支原体的能力差异极大，检测的准确性将比用Vero等指示细胞进行检测要低得多；（3）该方法严重依赖实验人员的经验，可重复性较差。
