大豆异黄酮的提取及电化学行为研究

大豆异黄酮的提取及电化学行为研究

1 前言

1.1 研究基础

1.1.1大豆异黄酮的作用和研究的重要意义

大豆异黄酮（Soybean isoflavone）是一种黄酮类的化合物，是大豆在它的生长过程中出现形成的一类次级的代谢产物，是一种生物活性物质。因为是从植物中提取的，它有着与雌激素类似的结构，所以大豆异黄酮又被称做是植物雌激素。主要成分为大豆甙，大豆甙元，其分子式为C15H10O2 ，分子式量为222.2387。大豆异黄酮的雌激素作用不仅会影响到生长因子的活性、激素的分泌、蛋白质的合成而且还会影响代谢生物学的活性，可以称为天然预防癌症的化学剂。此外，大豆异黄酮还可以预防由于妇女体内雌激素水平下降，而引起的更年期综合征、并可以预防以及改善由于激素水平的变化或钙和维生素D的不足而引起的骨质疏松、还可以预防乳腺癌、心血管疾病以及早老年痴呆，降低胆固醇等。

近年来，在美国、日本、德国、英国等发达国家及地区出现了大豆异黄酮热的现象，其中美国和日本对大豆异黄酮的研究更是投入了很大精力。1995 年11

月，在芬兰出现了世界上第一个主要原料是大豆异黄酮的功能性食品。目前，主要成分是大豆异黄酮的保健食品已经成为一种新型流行畅销食品。在我国，对大豆异黄酮的研究也已成为了热点。国内大豆异黄酮以食品、保健品、特别是医药中间体的形式出现在公众的视野中，同时也可被用作食品添加剂、药物组分以及保健食品等。

现如今，国内食品科研部门已经加大力度研究开发大豆异黄酮产品，这不仅能提高大豆产品的附加值，还能填补国内市场的空白。然而，自然界中的异黄酮资源却极为有限，即使在含量很高的大豆中，异黄酮也仅占0.1%～0.5%，由此见得，大豆异黄酮具有十分极其重要的研究意义[1]。

1.1.2大豆异黄酮的常用提取方法

目前，最常用的大豆异黄酮的提取方法有：有机溶剂萃取法、超声波辅助法、酶解法、酸解法、高速离心法、超临界萃取法等。由于设备及实验条件控制、可行性比较，本次试验采取的是超声波辅助法。

超声波提取法的原理是它的空化作用对植物的细胞膜的破坏作用可以使植物体内异黄酮类化合物释放出来。此外，超声波使提取液的不断震荡，有助于溶质的不断扩散。而且超声波的热效应可以使水温维持在某一个定值，与水浴作用相类似。由此超声波不仅可以大大缩短提取所用的时间，并且可以提高提取效率[2]。提取大豆中异黄酮的溶剂可以使用乙醇、甲醇等有机溶剂，但综合性价比、毒性、提取效率等各方面因素，乙醇为最佳选择。

1.1.3目前大豆异黄酮的研究方法

目前，大豆异黄酮的分析方法主要有紫外光谱法、红外光谱检测法、三波长法、高效液相色谱法、气相色谱法、高效液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱法、毛细管电泳法[3]、单扫描极谱法[4]。

而电化学方法相对于来说，操作简单，灵敏度高，分析前处理简便，容易达到分析的要求，是依据溶液的电化学性质和它的变化规律的一种分析方法，将被测定物质的浓度转化为某种电化学参量或者电化学信号加以输出测量。

其中循环伏安法 (Cyclic Voltammetry)是利用电流、电位进行电化学测量、研究的方法。在进行循环伏安实验时，工作电极的电位随时间变化呈线性斜坡。不同于线性扫描伏安法，在CV实验达到设定电位之后，工作电极的电势被在相反的方向升高到返回到初始电位。根据需要在潜在坡道这些循环可以重复多次。在工作电极上的电流被作图所施加的电压（即，工作电极的电势），得到的循环伏安图跟踪。循环伏安法一般是用来研究在溶液中分析物的电化学性能。

1.2 简介紫外-可见吸收光谱法

紫外-可见吸收光谱法[5]（Ultraviolet-Visible Absorption Spectrometry,

UV-Vis）是指吸收光谱或反射光谱中的紫外可见光谱区。这意味着它在可见光和相邻的利用光（近紫外和近红外[NIR]）的范围内。在可见光范围内的吸收或反射，直接影响所涉及的化学品的感知颜色。在电磁频谱的这个区域，分子经历电子跃迁。这种技术是互补的荧光光谱，在该荧光涉及从激发态到基态跃迁，而吸收测量从基态跃迁至激发态。

1.3 简介红外吸收光谱法

红外吸收光谱法[6]（Infrared Absorption Spectrometry ,IR）是用电磁波谱的红外区域涉及的光谱，即光具有较长波长和低频率比可见光。它涵盖了一系列的技术，主要是基于吸收光谱。如同所有的光谱技术，它可用于确定和研究化学品。对于给定的样品，该样品可以是固体，液体或气体，该方法或红外光谱的技术使用被称为红外光谱仪（或分光光度计）的仪器以产生的红外光谱。一个基本的红外光谱实质上是红外光吸收（或透射率）在垂直轴上与横轴上的频率或波长的曲线图。

1.4 简介循环伏安法

循环伏安法(Cyclic Voltammetry)可被用于研究电极反应的性质、电极反应的机理以及电极反应过程中动力学参数，然而却很少用于定量分析[8]。

（1） 电极可逆性的判断对于可逆的电极反应，其循环伏安图上下两条曲线是对称的，而且阳极峰电流和阴极峰电流之比为1。此外，也可依据公式：

（25℃）；对于准可逆电极反应，则上下两条曲线不对称外，并且阴极峰与阳极峰的电位

之差比要大；而对于不可逆电极反应则只有还原峰或只有氧化峰。因此，可以利用循环伏安法判断电极反应的可逆性。

（2）电极反应机理的判断循环伏安法还可用于研究电极吸附现象、研究化学修饰电极、电化学-化学耦联反应等，。

综上所述：本试验是在前人研究的基础上，并且综合考虑现有的实际条件后，决定采用溶剂提取法，设计正交试验找到大豆异黄酮的最佳提取工艺条件并进行定性表征；通过循环伏安法研究其电化学行为及性质，找到进行电化学测量的最佳试验条件，为大豆异黄酮进行电化学测量提供研究依据。

2 实验部分

2.1 实验试剂与仪器

2.1.1所用试剂

实验所用基本试剂见（表1）

174879068580表1 实验中所使用的基本试剂表1 实验中所使用的基本试剂

名称纯度分子式分子量厂家

大豆邯郸市美食林超市

乙醇 ≥99% CH3CH2OH 46.07 天津市瑞金特化学品有限公司

柠檬酸 99.8% C6H8O7·H2O 210.14 中国上海试剂一厂

柠檬酸钠 ≥99.0% Na3C6H5O7·2H2O 294.10 津市化学试剂批发部监制 磷酸二氢钾 ≥99.5% KH2PO4 136.09 新乡市化学试剂厂

磷酸氢二钾 ≥99.0% K2HPO4·3H2O 228.22 河南焦作市化工三厂

冰乙酸 ≥99.5% CH3COOH 60.05 天津市大茂化学仪器供应站

无水乙酸钠 ≥99.0% CH3COONa 82.03 新乡市化学试剂厂

氯化钾 ≥99.8% KCl 74.55 北京化工厂

2500目抛光粉天津市兰力科化学电子高科技有限公司

实验所有用水均为蒸馏水。

2.1.2所用仪器

实验所用的基本实验仪器见（表2）

表2 实验所用仪器

仪器名称厂家

WK-600A高速药物粉碎机KQ-100DB型数控超声波清洗器SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵101-2BS电热鼓风干燥箱756CRT紫外可见分光光度计Mayna550型富立叶变换红外光谱仪LK98BII微机电化学分析系统三电极系统：金电极、银电极、铜电极、玻碳电极、铂电极（工作电极）饱和甘汞电极（参比电极）铂电极（对电极）酸度计pHS-3CFA2004B电子天平山东青州市精诚机械有限公司昆山市超声仪器有限公司郑州长城科工贸有限公司余姚市远东数控仪器厂上海精密科技仪器有限公司广州市石新电子有限公司天津市兰力科化学电子高科技有限公司上海电光器件厂上海精密科技仪器有限公司上海精密科学仪器有限公司

2.2 实验方法

2.2.1探索大豆异黄酮提取最佳条件

大豆的处理：将市售的大豆在50℃的条件下，在烘箱中烘干24小时，再用粉碎机粉碎，置于干燥、阴凉处放置，留待试验用即可。

设计正交试验：选择料液比、乙醇浓度、提取时间、提取次数作为参考因素，以大豆异黄酮的吸光度作为评价指标，用L9（34）正交设计表安排试验，优选出最佳的提取条件。所选择的因素水平及正交设计试验方案（表3）。

表3 因素水平及正交实验设计的方案

水平因素 料液比(A)/倍乙醇浓度(B)/% 提取时间(C)min 功率(D)

1 1∶5 60 20 50

2 1∶6 70 30 60

3 1∶7 80 40 70

验证试验：按上述正交试验的结果所确定出的最佳提取条件来进行验证

2.2.2电化学性质的研究

电极的处理：首先用盛有氧化铝粉末的绸子光面把电极表面打磨至光亮，接着放到盛有1:1的HNO3溶液的小烧杯里浸泡，并放入超声仪内超声震荡20分钟以后取出，然后实验室制得的二次蒸馏水洗净，最后用普通滤纸把电极侧面的水珠吸干。

电极的选择：配制相同浓度的已经提取好的大豆异黄酮粗品溶液，以饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极，玻碳电极、金电极、银电极、铂电极、铜电极为工作电极分别进行试验，记录峰值，以选出最好的工作电极。

支持电解质溶液的选择：由于试验需在弱酸性条件下进行，考虑到用柠檬酸-柠檬酸钠、醋酸-醋酸钠和磷酸二氢钾-磷酸氢二钾这三种溶液为支持电解质溶液，以选定的铂电极为工作电极，其他条件相同，进行试验，记录峰值，选出最佳的电解质溶液。

最佳支持电解质溶液pH值的选择：确定KH2PO4-K2HPO4为支持电解质溶液后，在其他试验条件相同的情况下，改变支持电解质溶液中KH2PO4和K2HPO4的比例以调成pH不同的溶液进行一系列的试验，找到最佳支持电解质溶液的pH值。

3 结果与讨论

3.1 确定大豆异黄酮提取条件

3.1.1正交实验的结果

每次称取2.0g大豆粉末按照正交试验设计进行试验，并测定九次试验中大豆异黄酮的吸光度值（表4），并对各因素进行统计分析（表5）。

表4 正交试验结果

试验编号料液比A/倍乙醇浓度B/% 提取时间C/min 超声功率D 吸光度

1 1∶5 60 20 50 0.372 2 1∶5 70 30 60 0.629

3 1∶5 80 40 70 0.388

4 1∶6 60 30 70 0.557

5 1∶6 70 40 50 0.678

6 1∶6 80 20 60 0.536

7 1∶7 60 40 60 0.400

8 1∶7 70 20 70 0.559

9 1∶7 80 40 50 0.362

表5 单因素吸光度统计量

因素平均值极差

料液比（A）/倍 1∶5 0.463

1∶6 0.590 0.150

1∶7 0.440

60% 0.443

乙醇浓度（B）/% 70% 0.556 0.113

80% 0.428

20 0.423

提取时间（C）/min 30 0.582 0.159

40 0.489

50 0.471

超声功率（D） 60 0.522 0.051

70 0.501

通过表5的单因素吸光度统计分析可知，各因素对大豆异黄酮含量的影响次序依次是：提取时间(C)>料液比(A)>乙醇浓度(B)>超声功率(D)。

综合表4与表5进行分析可知：最好的搭配条件为料液比1∶6，乙醇浓度为70%，提取时间为30min，超声功率为60%。