猪肉中沙门氏菌的PCR检测

山西农业科学２０１０，３８（８）：７１—７６　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＳｈａｎｘｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　

ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００２—２４８１．２０１０．０８．２０　

Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ方法检测肉品中的沙门氏茵　

方　平，杨永莉，杨　宝，王晓闻　（山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷０３０８０１）　

摘　要：应用ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ染料能选择性结合双链ＤＮＡ的特点，可检测到沙门氏菌ｆｉｍＩ基因特异性靶序列　扩增所产生的荧光信号，通过熔解曲线可知其熔点值约为８５．６℃，而对其他非沙门氏菌则检测不到荧光信　号。建立了一种肉品中的沙门氏菌Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ检测方法，用该方法检测市售牛肉、香肠中的沙门氏菌，其　检测灵敏度分别为１３，１２　ｃｆｕ／２５　ｇ，从样品的处理到得出检验结果可以在１０　ｈ内完成。该检测方法具有简　便、快速、特异性强、敏感度高等特点。　关键词：沙门氏菌；Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅＰＣＲ；快速检测；肉品　中图分类号：ＴＳ２０７．４　文献标识码：Ａ　文章编号：１００２—２４８１（２０１０）０８—００７１—０６　

Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ａｓｓａｙｓ　ｆｏｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｉｎ　Ｍｅａｔ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　

ＦＡＮＧ　Ｐｉｎｇ，ＹＡＮＧ　Ｙｏｎｇ—ｌｉ，ＹＡＮＧ　Ｂａｏ，ＷＡＮＧ　Ｘｉａｏ－ｗｅｎ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｈａｎｘｉ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｇｕ　０３０８０１，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｓ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ　ｃｏｕｌｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｂｉｎｄ　ｔｏ　ｄｏｕｂｌｅ—ｓｔａｎｄ　ＤＮＡ．ｉｔ　ｉｓ　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｔｈｅ＃ｍＩ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｔｏ　ｃｏｎｆｉｒｍ　ｔｈｅ　ｍｅｌｔｉｎｇ　ｐｏｉｎｔ　ｏｆ　ａｂｏｕｔ　８５．６　ｏＣ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　ｍｅｌｔｉｎｇ　ｃｕｒｖｅ，ｗｈｉｌｅ　ｏｔｈｅｒ　ｎｏｎ－Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｈａｄ　ｎｏ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．Ａｎｄ　Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ａｓｓａｙ　ｗａｓ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｉｎ　ｍｅａｔ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ．　Ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｌｉｍｉｔｓ　ｏｆ　Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ａｓｓａｙ　ｗｅｒｅ　１３　ｃｆｕ／２５　ｇ　ｂｅｅｆ　ａｎｄ　１２　ｅｆｕ／２５　ｇ　ｓａｕｓａｇｅ．Ｔｈｅ　ｅｎｔｉｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｆｏｒ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅｄ　ｗｉｔｈｉｎ　１０　ｈｏｕｒｇ　ｏｒ　ｅｖｅｎ　ｌｅｓｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｓｈｏｗｉｎｇ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ．Ｉｔ　ｉｓ　ｃｏｎｃｌｕｄｅｄ　ｔｈａｔ　ＰＣＲ　ｉＳ　ａ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｒａｐｉｄ，ａｎｄ　ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌｃａ　’　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ；Ｒａｐｉｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；Ｍｅａｔ　ｐｒｏｄｕｃｔ　

熟肉制品中微生物安全检测方法

熟肉制品中微生物安全检测方法主要包括以下几种：

1.总菌落数检测：通过将熟肉样品进行稀释处理，接种在富养基上培养出菌落，并统计菌落形成的数量，来评价样品中微生物的总数。

2.大肠菌群检测：通过对样品进行培养和鉴定，筛选出能发酵乳糖并产气的肠道大肠菌群，来评估样品中可能存在的致病性菌群。

3.金黄色葡萄球菌检测：通过对样品进行培养和鉴定，筛选出产生凝固酶的金黄色葡萄球菌，来评估样品中可能存在的致病性菌群。

4.沙门氏菌检测：通过对样品进行预处理和培养，利用生化试剂和PCR等方法来检测样品中是否存在沙门氏菌，来评估样品的微生物安全性。

5.脱氢酶培养基法：通过将样品接种在含有特定脱氢酶底物的培养基上，观察培养基底部颜色的变化，来评估样品中可能存在的致病性菌群。

这些方法可以根据需求灵活选择和组合使用，以便对熟肉制品中的微生物安全进行有效评估。

８８０　江苏农业学报（Ｊｉａｎｇｓｕ　ｏｆＡｇｒ．Ｓｃｉ．），２０１２，２８（４）：８８０～８８５　

姚大伟，叶可萍，江芸，等．生鲜猪肉中含扩增内标的沙门氏菌Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ检测方法的建立［Ｊ］．江苏农业学报，２０１２，２８　

（４）：８８０—８８５．　

生鲜猪肉中含扩增内标的沙门氏菌Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　

检测方法的建立　

姚大伟　，　叶可萍　，　江　芸　，　徐幸莲　，　周光宏　（１．南京农业大学肉品加工与质量控制教育部重点实验室，江苏南京２１００９５；２．南京师范大学金陵女子学院，江苏南京　２１０ｏ９７、　

摘要：建立含扩增内标的生鲜猪肉中沙门氏菌Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ检测方法，以提高检测的准确性。根据沙门氏　菌ｔｔｒＢＣＡ基因设计引物和探针，利用犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因构建和目标基因相同引物的扩增内标，并对退火　温度和引物、探针的浓度进行优化，建立含扩增内标的Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ检测方法，用该方法对人工污染生鲜猪肉样　品进行检测。结果显示，该方法对１９株非沙门氏菌检测结果均为阴性，对３６株沙门氏菌检测结果均为阳性，特异　性较好，热学裂解制备ＤＮＡ模板法检测灵敏度达１００　ＣＦＵ／ｍｌ，试剂盒提取ＤＮＡ制备模板法检测灵敏度达１　ｔｘｌ　２．６６拷贝。在２５　ｌ反应体系中加入扩增内标１０　拷贝不影响目标基因的扩增，该方法能在１２　ｈ内对人工污染沙　门氏菌的肉样做出检测。该方法不仅可快速检测生鲜猪肉中的沙门氏菌，同时避免了假阳性现象的产生。　关键词：　猪肉；沙门氏菌；实时荧光定量ＰＣＲ；扩增内标　中图分类号：ＴＳ２０１．６　文献标识码：　Ａ　文章编号：　１０００－４４４０（２０１２）０４－０８８０－０６　

Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｉｎ　ｆｒｅｓｈ　ｐｏｒｋ　ｂｙ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ａｓｓａｙ　ｗｉｔｈ　ａｎ　

ｉｎｔｅｒｎａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ　

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FOOD INDUSTRY分析 检测　陈文财 惠州市食品药品检验所食品中沙门氏菌的快速检验方法泛用于遗传病诊断和微生物检验中。（我个人认为沙门不会用）荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检验法基于沙门氏菌ｆｉｍＹ基因序列，进行引物和探针的设计，利用基因重组技术对检测的定量标准品进行构建，可借助荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ法对沙门氏菌进行检测。该方法操作简单、检验快速、适用范围广，在临床诊断、商品检验、食品卫生监管等领域均有运用。多重ＰＣＲ快速检验法多重ＰＣＲ快速检验法基于质粒毒力基因ｓｐｖＣ、１６Ｓ　ｒＲＮＡ、ｆｉｍＡ、致病基因ｉｎｖＢ序列设计引物，多重ＰＣＲ检测沙门氏菌株基因组ＤＮＡ，以此实现对沙门氏菌的快速检验。多重ＰＣＲ快速检验法可对沙门氏菌的多种毒力因子进行鉴定，是沙门氏菌株检验和鉴定的新方法。变性高效液相色谱检测法　变性高效液相色谱结合多重ＰＣＲ反应技术可对食品中的沙门氏菌进行快速检测。该方法以ｆｉｍＹ基因为靶基因，选择引物可实现对多重ＰＣＲ体系的优化，由此可对沙门氏菌进行快速鉴别。该方法的特异性、灵敏性较高，其扩增产物为２８４ｂｐ，可对沙门氏菌进行快速检验，并能进一步验证多重ＰＣＲ的特异性。沙门氏菌是食物常见的病原菌，具有传播媒介多、途径繁复等特点，容易污染食品而危害人体健康。另外，沙门氏菌是多种有紧密联系细菌的泛指，包括导致伤寒、胃肠及引起食物中毒的众多细菌。文中提到的几种快速检验法与传统检验法相比，具有操作简单、特异性强、灵敏度高等特点。但这些方法也存在各自缺陷，试纸快速检验法检验纯菌时，若目菌＞１０３ｃｆｕ／ｍｌ时，纸片菌斑密集，可导致假阴性反应的发生。ＰＣＲ检验的特异型取决于所选扩增的靶序列，若为保守的特异片段，所选引物就会显示出特异型。ＬＡＭＰ技术的产物复杂多样，引物设计要求较高，目标单链ＤＮＡ的分离困难，无法对扩增产物的序列进行分析；其在同一温度条件下采用多条引物扩增非特异性条带，可能会出现假阳性结果。对此，联合多种检测方法对沙门氏菌进行检验，各种方法的优势互补，可提高沙门氏菌的检验效果。目前，食品工业迅猛发展，各式各样的“加工”层出不穷，而选择快速、准确的方法对食品中的沙门氏菌进行检测，对于微生物研究者而言任重而道远。源性病原菌中，沙门氏菌的分布广、危害大，食用沙门氏菌污染后的食物，可罹患感染性腹泻疾病。水中沙门氏菌的繁殖能力弱，冰箱中其可存活３－４个月，自然环境下的粪便中沙门氏菌可存活１－２个月。３７℃的环境中，沙门氏菌的繁殖最佳，而在２０℃以上即可大量繁殖［１］。所以，对低温储存食品的质量进行防护至关重要。沙门氏菌主要存在于家禽、蛋、肉类产品中，食物在生产运输过程中，低温储存环境下容易被污染。而在食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒病例位居第一或二位。沙门氏菌的传统检测方法需要经过前增菌、选择性增菌、划线分离、生化鉴定及血清学鉴定等步骤，整个检验过程大约需要４－７天且存在操作繁琐、灵敏度低等缺陷，故容易出现错检或漏检现象；无法满足食品中沙门氏菌快速检测的需求。因此，寻求有效方法对沙门氏菌进行检验，有效预防沙门氏菌病具有重要意义。试纸快速检验法试纸快速检验法具有敏感、特异等优点，其将微生物的鉴定、分离合二为一，利用微生物测试纸片，通过专有技术将显色培养基变为便于使用的测试纸片。其检验迅速、经济、方便，主要用于沙门氏菌的快速初筛。沙门氏菌显色培养基法用显色培养基对沙门氏菌进行鉴定，以通过改良的选择性培养基为基础，使沙门氏菌在选择性培养基上的菌落显示出特定的颜色，便于观察。其原理是利用目标菌特有的生理生化反应，将细菌特异性酶的显色底物加入培养基中，根据菌落颜色可对菌种进行鉴定。显色培养基法操作简单、方便，将食品样品增菌后直接划线于选择性培养基，于３７℃培养１８￣２４ｈ，然后观察生长菌的颜色。显色培养基检验法在环境、医药和食品领域的使用广泛，能够有效提高微生物检测的工作效率。不足之处是存在假阳（阴）性问题，部分操作有待进一步优化。聚合酶链反应（ＰＣＲ）检验法体外酶促基因扩增是在体外对自然ＤＮＡ复制进行模拟的一种技术，借助寡核苷酸引物在靶ＤＮＡ序列两端于模板链分端互补的物性经过ＤＮＡ变性，经模板－引物复性、ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶催化，发生引物链延伸反应，这一过程循环３０次，即可在短时间内促使靶ＤＮＡ扩增。ＰＣＲ检验法的操作简单、特异性强、灵敏度高，广食