脂肪干细胞的研究及临床应用进展

󰀁综述󰀁󰀂文章编号:1000󰀁2790(2009)09󰀁0860󰀁03

脂肪干细胞的研究及临床应用进展

孙晓龙1,李󰀂青2󰀂(第四军医大学:1口腔医学系十队,2基础部病理学教研室,陕西西安710033)

收稿日期:2008󰀁11󰀁10;󰀂接受日期:2008󰀁12󰀁16通讯作者:李󰀂青.Te:l(029)84774538󰀂Emai:lliqing@fmmu.edu.cn作者简介:孙晓龙.第四军医大学2006级本科学员.Te:l(029)82502540󰀂Emai:lfmmulong@qq.com 关键词!脂肪干细胞;多向分化;组织工程 中图号!R394.2󰀂󰀂󰀂 文献标识码!B

0󰀂引言再生医学的兴起激发了人们对各种干细胞、组织工程支架和细胞生长因子的研究热潮,选用合适的干细胞作为种子细胞的来源已成为研究的焦点.脂肪组织在人体内储量丰富,获取简便,通过抽脂从中获得的大量脂肪干细胞(adiposetissue󰀁derivedstemcells,ADSCs)不仅在体内体外具有多向分化潜能,在不同的诱导因子作用下可以向脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、成骨细胞、神经细胞、神经胶质细胞及胰岛细胞分化,而且可以分泌多种促血管生成因子和抗凋亡因子.最新的研究发现,ADSCs作为基因治疗的靶细胞具有抗炎、抗氧化的作用,有望成为临床上用来修复受损的组织和器官的理想干细胞来源,同时也为一系列疾病的治疗提供了新的思路.本文综述了这一领域新的研究进展.

1󰀂ADSCs与间充质干细胞1.1󰀂ADSCs与间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)的区别󰀂MSCs能向各种细胞系分化,包括中胚层来源的骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞及神经细胞等[1].传统的方法是在全麻或椎管内麻醉下从骨髓中取得干细胞,但在每毫升的骨髓中仅能获取100~1000集落生成单位(colony󰀁formingunit󰀁fibroblast,CFU󰀁F)的骨髓MSCs,且必须经过体外扩增才能获得临床需要的细胞数目,此方法不仅价格昂贵,增加患者痛苦,而且需要消耗一定的时间.相比之下,ADSCs来源丰富,在每克动物的脂肪组织中即可获得5000CFU󰀁F.ADSCs的培植过程也比其它干细胞快约1倍,只需要抽取少量ADSCs就能够很快培植出很多的干细胞,用来进行移植手术.此外,来自脂肪组织的干细胞在培养后也比其它来源的干细胞生长均匀,所以ADSCs已成为新的焦点.目前的研究发现ADSCs与MSCs多向分化潜能、表面标记等方面没有明显的差别,ADSCs的表面标记也与MSCs非常类似,如CD29,CD44,CD105,CD166与CD49e,二者均阳性表达;CD31,CD34,CD45,HLA󰀁DR,CD133,c󰀁kit,Lin与CD11b均为阴性,其中的差别在于ADSCs表达CD49d,不表达CD106;而MSCs则相反[2].1.2󰀂ADSCs在体液调节中的作用󰀂ADSCs能够分泌一定量的细胞因子,有利于建立更好的损伤修复微环境.用RT󰀁PCR的方法可观察到ADSCs高表达的细胞因子有肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)、血管内皮生长因子(vascu󰀁larendothelialgrowthfactor,VEGF)、胎盘生长因子(placentalgrowthfactor,PGF)、转化生长因子󰀁󰀁(transforminggrowthfac󰀁tor󰀁󰀁,TGF󰀁󰀁);中等表达的细胞因子有成纤维细胞生长因子󰀁2(fibroblastgrowthfactor󰀁2,FGF󰀁2)、血管生成素󰀁1(angiopoie󰀁tin󰀁1,Ang󰀁1);低表达的因子有Ang󰀁2[3].如何保存ADSCs而又不影响其功能?研究[4]认为可利用深低温保藏人ADSCs,能够有效地保存ADSCs的增殖分化、分泌细胞因子等特性.1.3󰀂ADSCs的抗炎抗氧化作用󰀂将生物材料植入体内时所产生的炎症反应一直是医学上的一大难题.在生物材料植入人体之前,利用合适的方法将ADSCs附于生物材料上增殖覆盖能够有效改善生物材料周围的伤口愈合炎症反应,而且不影响ADSCs的增殖代谢和分化能力,实验证实,在聚氨酯(polyurethane)和聚酰亚胺(polyimide)2种生物材料上,ADSCs具有很高的覆盖率,但在硅酮弹性体(siliconeelastomer)材料上覆盖率则较低[5].ADSCs具有抗氧化作用,可以抵抗在各种状态下由自由基造成的皮肤损伤[6].

2󰀂ADSCs在临床上的应用干细胞的临床应用价值主要表现在其组织修复与重建中.ADSCs能向各细胞系分化,包括中胚层来源的骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞及神经细胞等,现在临床上主要的应用策略为定向诱导、体外扩增干细胞后,与载体支架一起移植入人体或实验动物体内[7].2.1󰀂成骨细胞󰀂ADSCs可以在一定的培养条件下分化为成骨细胞,用于人ADSCs分化的培养基需要维生素D3、󰀁磷酸甘油(BGP)和抗坏血酸的联合作用,其中维生素D3发挥最重要的作用,而后两者则起到协同作用[8].用于鼠ADSCs分化的培养基需要维生素C、地塞米松、󰀁󰀁磷酸甘油,将小鼠脂肪组织提取的干细胞培养几代后,细胞表面形成突起,形态类似于体内的成骨细胞,用茜素红染色,可见细胞内出现了钙小结.近期还发现,人类成骨蛋白1(Humanosteogenicprotein󰀁1,OP󰀁1)能够强烈促进鼠ADSCs向成骨细胞分化,其作用超过其他生长因子[9].而FGF󰀁2能够促进ADSCs向软骨组织和脂肪组织的分化,同时抑制其向骨组织分化[10].研究人员将ADSCs作为种子细胞放于网状支架中,成功的修复狗的颅骨损伤模型,为临床治疗骨损伤提供新途径[11].甚至有人提出假说,可以利用脂肪细胞的骨分化特性来完整的修复牙齿,免除老年人牙齿缺失之苦[12].2.2󰀂软骨细胞󰀂软骨细胞能分泌透明质酸、硫酸软骨素和硫酸角质素等蛋白多糖,构成软骨组织的细胞外基质,还能分泌胶原纤维.马钰等[13]将ADSCs放置于含有TGF󰀁󰀁1、碱性成纤维细胞因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)、ITS、地塞米松等诱导培养基中进行诱导分化,经阿尔辛蓝染色、天狼猩红染色以及免疫组化等方法分析,诱导的细胞可分泌软骨细胞特异性的∀型胶原以及硫酸蛋白多糖,证实了ADSCs有向软骨细胞分化的潜能,同时研究者也发现,ADSCs在传860第四军医大学学报(JFourthMilMedUniv)2009,30(9)󰀂http://www.fmmuxb.cn10代后出现脂滴增多,突触伸长,细胞增殖减缓等衰老现象.因此,在5代以前的这类细胞适于作为种子细胞运用于组织工程,可以在体外扩增或定向诱导.另外,在软骨形态发生蛋白(CDMPI)体外诱导下,大鼠ADSCs可以分泌软骨特异性基质糖胺聚糖(GAG)和∀型胶原,并使其向软骨方向增殖分化,以50g/L为CDMPI诱导的最佳浓度[14].2.3󰀂肌细胞󰀂利用肌性培养基(myogenicmedium,MM)可使ADSCs定向分化为肌前体细胞,在MM中培养3wk后,可以在光镜下观察到细胞生成肌小管结构;利用免疫组化和RT󰀁PCR技术,可以检测到培养的细胞可表达MyoD1蛋白及肌球蛋白;培养6wk之后,利用细胞计数法发现有大约15%的细胞为MyoD1阳性细胞,证明了ADSCs能分化为肌前体细胞[15].另外,有学者在体外培养环境下,应用TGF󰀁󰀁1,PDGF󰀁BB联合诱导一定时间,使ADSCs定向分化的细胞表达󰀂󰀁SMA,Calponin,SM󰀁MHC,SM󰀁22󰀂血管平滑肌特异的细胞内标记物[16],可以认定ADSCs具有向血管平滑肌分化的潜能.不仅如此,ADSCs还可以分化为心肌细胞,通常用5󰀁氮杂胞苷来诱导,有效浓度为6~9 mol/L,以终浓度为9 mol/L对第3代ADSCs诱导产生的心肌细胞数量最多.5󰀁氮杂胞苷诱导后最早于第9d形成肌管样结构,以肌纤维蛋白、󰀂󰀁横纹肌肌动蛋白和心肌肌钙蛋白TmAb检测均为阳性.提示ADSCs在体外可有效转化为心肌细胞,它可能是心肌细胞移植的良好细胞来源[17].2.4󰀂血管内皮细胞󰀂将ADSCs置于添加甲基纤维素和血管内皮生长因子(VEGF)的半固体培养基中培养,在光镜下可以观察到细胞生成分支状的管腔结构,同时利用免疫组化法,可以鉴定到内皮细胞特异性的表面标志###CD31和vW因子.研究人员在后肢缺血损伤的小鼠后肢肌肉中注射培养3d的ADSCs,15d后运用血管照影和彩色多普勒检查,发现损伤后肢的血流供应得以明显改善[18].2.5󰀂胰岛细胞󰀂糖尿病一直是困扰社会的疾病,其发病机制与胰岛细胞功能减弱有关.于是,再生有功能的胰岛细胞已经成为糖尿病治疗方面的研究热点之一,近期有研究[19]发现,体外环境下ADSCs在再生胰腺提取物(regeneratingpan󰀁creasextract,RPE)刺激下,具有分化为各种胰岛细胞的潜能,为组织工程糖尿病治疗提供了新的思路.2.6󰀂神经细胞󰀂Ashjian等[20]用󰀁󰀁巯基已醇诱导人ADSCs向神经方向分化,30min后即出现类神经元样的细胞形态,3h后表达nestin,NSE,NeuN等神经细胞早期标志性因子.施万细胞对于外周神经损伤的治疗有很重要的意义,但由于短时间内无法获得大量施万细胞及获得的有创性,限制了其临床应用.ADSCs可以大量分化为施万细胞,提示ADSCs在体内可能具有神经修复潜能[21].嗅鞘细胞(olfactoryensheathingcells,OECs)对脊髓损伤的修复非常重要,当与OECs共培养时,在三维胶原支架上的ADSCs可以分化为OECs样细胞,因此对中枢神经系统的修复也将起到重要的作用[22].同时,ADSCs的种植可以形成独特的神经保护,减少水肿的发生和促进内皮细胞分化[23].周向阳等[24]自体ADSCs移植到冻伤大鼠脑内发现ADSCs可以在中枢神经系统中存活,并分化为神经元样细胞,它可以引起血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子等因子的高表达,从而减少细胞凋亡,加速神经功能修复过程并达到保护脑组织的目的.2.7󰀂脂肪细胞󰀂人体内存在棕色和白色两种脂肪.研究发现多向分化潜能的干细胞在鼠的白色脂肪组织中很丰富,而在棕色脂肪组织中它们的含量就相对要少了很多[25].目前在人体内哪一种脂肪组织可以作为最好的干细胞来源尚无定论.将ADSCs放在脂肪诱导培养基中,可以表达脂蛋白脂肪酶,aP2,PPAR(gamma)2和Glut4等脂肪细胞相关基因[26].在体内,ADSCs的成脂能力已得到证实.有研究[27]将ADSCs与海绵状胶原复合后植入免疫缺陷小鼠体内,形成了脂肪样组织.然而,脂肪组织本身就有大量的脂肪前体细胞,而且脂肪细胞本身就有增殖能力,因此,下一步研究应进一步明确诱导分化的脂肪组织的细胞来源问题.2.8󰀂作为基因转移的靶细胞󰀂干细胞具有自我更新能力,并可以将其遗传特性继承给其所有的子代细胞,利用干细胞的基因治疗成为受损器官修复的潜在途径,其关键在于替换损伤的基因,将目的基因转入干细胞中,最新研究[28]发现,多聚乙烯基亚胺(polyethleneimine,PEI)可以作为转入DNA与人类ADSCs的有效载体.将ADSCs移植应用于临床还必须解决如何在活体动态监测植入体内的ADSCs的存活、迁移及分化情况,研究发现Feridex2PLL复合物可安全高效标记AD󰀁SCs,MRI可应用于示踪植入受体脑内的ADSCs,为将来临床开展ADSCs治疗中枢神经系统疾病提供了活体示踪的技术方法[29].另外,超顺磁性氧化铁(superparamagneticironoxide,SPIO)不会影响ADSCs的生存性、转分化潜能及细胞因子的释放,也可以用来标记ADSCs,利用MRI技术可以明显的跟踪到有活性的被标记的ADSCs[30].3󰀂脂肪干细胞的前景展望和挑战ADSCs以其优势具有很高的应用潜力.然而,在真正临床应用前,还有很多的问题亟待解决,例如,干细胞移植时选用自体同源的ADSCs可以免除排斥反应等问题,有时要求患者自身提供所需的细胞有很大难度,因此,异体ADSCs的移植备受关注.传代以后的人ADSCs减少了表面组织相容性抗原的表达,并且当与异基因外周血单核细胞共同培养,它们不能刺激混合淋巴细胞的反应,表明体外环境下ADSCs不会引起T细胞的细胞毒作用[31].但是,机体排斥反应的机制比这复杂的多,今后需要有更多的实验来验证同种异基因ADSCs移植不会引起强烈的免疫反应和后期的排斥反应.另外,现在针对ADSCs的特性大多数是在体外下验证的,在体内复杂的各种体液因子的调控下会产生何种反应都不甚明了,将来的重点应转移到体内和诱导分化时基因表达变化和信号传导的精确机制中.同时,研究出在体内更好的促进ADSCs扩增与分化的载体支架也是临床应用ADSCs的保证.综上所述,ADSCs研究才刚刚起步,随着对其更多特性及分子机制的深入研究,ADSCs在组织工程和临床医学的研究中极具潜力.861第四军医大学学报(JFourthMilMedUniv)2009,30(9)󰀂http://www.fmmuxb.cn