插入突变在水稻功能基因组学中的研究进展

基因片段插入技术的新进展与应用基因片段插入技术是一种非常重要的生命科学技术，它可以将外源DNA片段精确地插入到目标细胞或组织的基因组中，从而实现研究和应用。

近年来，这一技术得到了快速发展，并在医学、农业、工业等领域展现出广阔的应用前景。

一、技术原理基因片段插入技术是利用DNA重组技术，将外源DNA连同其启动子和终止子序列，插入到目标基因组的特定区域，从而实现对目标基因的调控或改造。

具体而言，该技术主要有三个步骤：1、产生目标载体先将目标DNA载体（如质粒）获取到，然后进行设计和修饰，使其包含有一些重要的基因片段（如启动子、结构域、卡方片段等），以及其他的一些调控元件，如转录因子绑定位和增强子。

2、构建外源DNA片段在设计好目标载体之后，就需要构建外源DNA片段。

这一过程通常包括PCR扩增、限制性酶切和克隆等步骤，以产生能够精确插入到基因组特定位置的DNA序列。

3、基因片段插入一旦得到了目标载体和外源DNA片段，就可以进行基因片段插入。

这个过程通常要利用电穿孔、介导体、姜黄素、逆转录酶等元件，将目标载体导入到细胞质中，使其被整合到基因组的特定位置。

二、新进展与应用近年来，基因片段插入技术受到了广泛的关注和研究，并得到了不断的完善和改进。

以下是该技术的新进展和应用领域：1、基因治疗基因片段插入技术在基因治疗中被广泛应用，用于治疗一些遗传性疾病，如囊性纤维化、含铁血黄素病、类风湿关节炎等。

此外，该技术还可以用于治疗一些恶性肿瘤，如癌症和肺癌等。

2、基因改良基因片段插入技术可以用于作物和动物的改良，特别是在食品生产中。

例如，可以向作物或动物基因组中插入一些突变基因，以使其拥有抗虫性、耐性、抗性、产量高等特性。

这一技术还可以用于产生一些特殊类别的作物和食品，例如转基因食品和纯种肉类。

3、分子医学分子医学是一种将基因技术和药物技术结合起来的医学，它可以将基因片段插入到目标细胞或组织中，从而切断病毒和癌细胞的生物学过程。

水稻驯化过程中结构变异的进化基因组学研究Mol. Biol. Evol. 37(12):3507–3524 doi:10.1093/molbev/msaa185一、研究背景和目的关于结构变异还有许多研究不清楚的地方，比如：结构变异SV对表型的影响，SV的普遍性，个体SV事件在群体内的频率。

研究的第一步需要鉴定群体内的SVs，过去基于长短reads对此进行了大量研究并取得了一定进展。

尽管通过提高测序深度，短reads序列也可以用于鉴定SVs，但对一些SV类型的鉴定上，仍存在低估，比如大的INV，因此作者增加了长reads序列和de novo基因组以确定鉴定到的SVs的准确性。

本文作者使用了水稻和其近缘野生祖先 O. rufipoogn 的样品，拟通过鉴定 SVs 作为研究驯化的工具。

关于水稻的起源以及驯化基因的研究很多，为此提供了很好的研究背景。

关于水稻 SV 的研究也有一些，但缺少同时比较野生稻和栽培稻的比较研究。

葡萄中比较了野生和栽培群体中的SV频率，提供了基因组中人工选择区域的独特见解，反映了与无性繁殖相关的遗传负荷会增加。

但其它物种中的情况尚不清楚。

此外，基因的获得丢失也仍是一个不断发展的领域。

作者利用发表的高倍重测序数据鉴定了SV，然后比较了野生稻和栽培稻之间的SV群体频率；调查了不同TE家族的MEI频率；估计了和驯化有关的特征。

二、研究方法和特色作者充分利用已发表的数据，除高倍重测序数据外，还使用了已发表的长reads序列和de novo基因组以确定鉴定到的SVs的可靠性。

基于鉴定到的SV分析了群体内的多样性、频谱分布、LD decay；驯化过程中的遗传负荷，群体间的分化水平，并同SNPs数据的结果进行了比较。

利用候选基因策略，评价了基于SV有助于提高寻找驯化基因的效率。

分析了基因组中的不同TE家族的群体动态及造成差异的可能原因。

三、主要结果和重要发现基于重测序数据，作者鉴定了 SNP 和 indels，并基于 SNPs 构建了系统发生树，Fig. 1a所示，aus 和 indica 聚为一支，japonica 和 aromatic 聚为一支，O. nivara 和 O. rufipogon 聚到了一起，而 O. rufipogon 分为两支，一支主要是东南亚和印度的材料，另一支主要是中国的材料。

T -DNA 标签技术及其在植物功能基因组研究中的应用杨永智(青海大学农林科学院,青海西宁　810016)摘要:综述了T -DNA 转移和整合机理的研究进展,植物T -DNA 标签的种类和特点及其在功能基因组研究中的应用。

关键词:T -DNA ;T -DNA 标签;植物功能基因组学;突变中图分类号:Q812 文献标识码:A 文章编号:1006-8996(2006)06-0034-06T -DNA tagging and its applicatlon in plantfunctional genome researchYANG Yong -zhi(Academy of Agriculture and F orestry Science ,Qinghai University ,X ining 810016,China )Abstract :This paper viewed the principle of T -DNA trans fer and integration ,the types and the charac 2ters of T -DNA insertion mutation in plant and the application of T -DNA tagging to plant functional ge 2nome research 1K ey w ords :T -DNA ;T -DNA tagging ;plant functional genomics ;mutantT -DNA 标签技术是以农杆菌(Agrobacterium )介导的转化为基础的一种插入突变研究方法。

插入突变是将某些DNA 元件插入到植物基因组中后,相应位点的基因的表达就可能受到抑制,利用插入元件作为标签,在插入位点处贴了一个标签,使得植物基因组的插入位点容易辨认。

根据插入位点的基因序列与植物表型变异等的相互关系可以从基因组中分离出相应的基因并鉴定其功能。

基因编辑技术在水稻遗传改良中的应用进展作者：李萌姜恭好段海燕来源：《南方农业·上旬》2021年第12期摘要基因编辑是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的基因工程技术或过程。

总结了近年基因编辑技术在提升水稻育种速度和效率、实现水稻的生长发育调节、载体构建和突变体创制、水稻抗病目标改变、水稻品质提升等遗传改良方面的应用进展。

简要介绍了一代ZFNs基因编辑技术、二代TALENs基因编辑技术和三代CRISPR/Cas9基因编辑技术，重点介绍了CRISPR/Cas9的工作原理、优缺点、类型和相关技术。

最后对基因编辑技术在水稻遗传改良方面的发展方向进行了展望。

关键词基因编辑;CRISPR/Cas9;水稻;遗传改良;应用进展中图分类号：Q789 文献标志码：A DOI：10.19415/ki.1673-890x.2021.34.002基因编辑，又称基因组编辑或基因组工程，是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的基因工程技术或过程。

基因编辑技术通过插入和敲除基因、定点突变和碱基替换等对基因组靶位点进行一系列的人工修饰，以获得新的功能或表型，甚至创造新的物种，在基因研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力，尤其是在植物遗传改良和新品种培育方面应用十分广泛。

1 基因编辑技术在水稻遗传改良中的应用进展1.1 提升水稻育种速度和效率近年将基于CRISPR/Cas9系统的基因组定点编辑技术不断应用于水稻，用来深入研究水稻基因功能和精准培育水稻品种，而传统基因组编辑技术只可对水稻基因片段随机删除或插入，精准插入效率不高。

Yuming Lu等用硫代修饰和磷酸化修饰供体片段，成功提升敲入靶向的效率，对约1 400株植株进行编辑，成功效率平均值为25%，高者可达47%;此方法还能够在4个位点进行靶向敲入，改进该方法得到重复片段介导的同源重组方法，能够精准有效融合原位标签蛋白并实现片段的替换，该效率约为11%[1]。

49BIOTECHWORLD 生物技术世界水稻类病突变体是一种水稻外表在没有明显损伤、外界环境没有出现逆境或病原物侵染的条件下,自发产生的一种类似于坏死性病斑的外观病变,病变能扩散到整株水稻上。

其病变位置、颜色、大小有所不同(Lorrain S et al.,2003;杨雪静等,2010)这些突变体被分为两个类型,显性突变或隐性突变,几乎所有的突变体在病斑的大小,发病时间和病斑颜色上有独特的表型。

类病斑的发生受到外界环境(低温、高光强)、遗传背景和水稻植株的发育状态这些因素的影响(Johal et al.,1995)。

1 水稻突变体来源第一个植物类病斑突变体的研究报道是1923年Emerson报道的一个玉米类病斑突变体(黄奇娜等,2010)。

在水稻中,日本科学家S e k i g u c h i 于1965报道了第一个类病斑突变体,将其命名为Sekiguchi lesion(sl)。

水稻类病斑突变体的主要来源为自然突变、化学诱变、物理诱变、插入突变等方法。

自然突变产生的类病斑相对较少,主要还是人工诱变产生的。

近年来,通过转座子标签、T-DNA 标签插入突变和人工诱变产生了大量的水稻类病斑突变体,到目前为止报道了近200个(陈析丰等,2011)。

这近200个的水稻类病斑突变体大部分没有进行正式命名和基因的等位分析。

目前,国际谷物基因组数据库Gramene()只注册了32个水稻类病斑基因。

根据国内外的研究报道,截止2014年12月一共有73个水稻类病斑基因被鉴定和命名。

国际谷物基因组网数据库统一以lrd (lesion resembling disease)命名。

表型不同的突变体赋予不同名称。

其中,lrd1-lrd6又被称为bl1-bl6(brown leaf spot,bl),lrd7-lrd17、lrd26-lrd30和lrd33又被称为spl1-spl14和spl18(spotted leaf,spl),lrd18-lrd20又被称为cdr1-cdr3(cell death and resistance,cdr),lrd21又被称为sl(Sekiguchi lesion,sl),lrd22又被称为RPR1(Probenazol inducible gene Pbz1,RPR1),lrd23又被称为ysl(yellow leaf spot,ysl),lrd24又被称为fgl(faded green leaf,fl),lrd25又被称为zn(zebra necrosis,zn),lrd31又被称为lrd。

⽔稻TOS17突变体库的创建与应⽤1⽂献综述1.1⽔稻基因组学研究现状⽔稻全基因组测序⽔稻(Oryza sativa L.)是世界上最主要的粮⾷作物之⼀，全世界有⼀半的⼈⼝⾷⽤它，⽔稻年总产量占世界粮⾷作物产量第三位，维持较多⼈⼝的⽣活。

亚洲是世界⽔稻主产区，近年稻⽶产量占世界的90%以上，年产量占亚洲的38%。

⼤⽶作为我国主要粮⾷种类，在养活我国13亿⼈⼝和改善我国居民营养结构中具有举⾜轻重的影响。

同时，⽔稻⼜以其基因组相对较⼩(～430Mbp)，⾼效的遗传转化体系，与⽟⽶、⼤麦和⼩麦等其它⽲本科作物在基因组上存在明显的共线性，⽽成为研究单⼦叶植物的模式植物。

国际⽔稻基因组计划(IRGSP)启动于1998年，以粳稻品种(japonica)⽇本晴(Nipponbare)为模式材料，由中国、⽇本、美国等是⼗个国家参与，所采⽤的⽅法为逐步克隆策略(clone by clone sequencing)，随后在2002年由⽇本和中国科学家率先公布了第1、4染⾊体的精确序列(Feng et al., 2002; Sasaki et al., 2002; Consortium 2003)；2003年9⽉第10条染⾊体的全长序列由美国Clemson⼤学公布(Rice Chromosome 10 Sequencing Consortium, 2003)。

2005年8⽉⽔稻全基因组精确序列在Nature发表(International Rice Genome Sequencing Project, 2005)。

IRGSP公布的⽔稻“⽇本晴”精确序列经过分析表明：(1) ⽔稻“⽇本晴”基因组⼤⼩为389Mb，IRGSP公布的序列能够覆盖其全基因组的95%，并包含了所有的常染⾊质和两个完整的着丝粒；(2)整个基因组中包含⼤约37544个⾮转座相关基因，其中71%的基因可能在拟南芥中有同源基因；(3)通过与拟南芥基因组序列对⽐分析发现，拟南芥90%的基因在⽔稻中可能存在同源物；(4) ⽔稻中预测的37544个基因中，29%是属于成簇的基因家族；(5) ⽔稻基因组中转座元件的数⽬和种类与⽟⽶和⾼粱基因组共线性区段的扩张是⼀致的；(6) 有证据证明基因能从细胞器中转移到细胞核(International Rice Genome Sequencing Project, 2005)。

基因组学-Genomics-知识考点汇总•基因组（Genome：Gene＋chromosome）细胞或生物体中一套完整的单倍体遗传物质•基因组学（Genomics）最早Thomas Roderick在1986年提出，包括基因组作图、测序和分析。

可分为结构基因组学和功能基因组学。

一、结构基因组学1.遗传图(Genetic Mapping Genomes) : Based on the calculation of recombination frequencyby linkage analysis .通过亲本的杂交，分析后代的基因间重组率，并用重组率来表示两个基因之间距离的线形连锁图谱每条染色体组成一个连锁群，所有染色体的连锁群组成的图谱即构成基因组遗传图。

重组率代表基因位点之间的相对距离。

在遗传作图中，人们把一个作图单位定义为1厘摩（cM），1cM等于1%的重组率。

提高遗传作图的分辨率：选用不同的杂交群体；增加杂交群体的数目；增加分子标记的数目；扩大分子标记的来源分子标记：绘制基因组遗传图需要的坐标点。

分子标记的主要来源是染色体上存在的大量等位基因。

在DNA水平上，两个基因间一个碱基的差异就足以形成等位基因。

2.物理图（physical map）：指DNA序列上两点的实际距离，它是以DNA的限制酶片段或克隆的大片段的基因组DNA分子为基本单位，以连续的重叠群为基本框架，通过遗传标记将重叠群或基因组DNA分子有序排列于染色体上。

物理图的绘制: Based on molecular hybridization analysis and PCR techniques杂交法；指纹法；荧光原位杂交技术。

3.基因组序列测定: Sequencing methods: the chain termination procedure;Map-based clone by clone strategy;Whole genome shotgun (WGS) strategy;Sequence assembly;•传统基因组测序的方法：克隆步移法（BAC-by-BAC Strategy）和全基因组鸟抢法（Whole Genome Shotgun Strategy）。

基因组学在农作物改良中的应用随着人类对基因组的深入研究，基因组学在农作物改良中扮演着越来越重要的角色。

通过对农作物基因组的分析和编辑，科学家们能够实现农作物的优化和提高产量的目标。

本文将探讨基因组学在农作物改良中的应用，并展望基因组学在未来农业领域的前景。

一、基因组学简介基因组学是研究生物体所有基因组的科学，它包括了基因组序列与结构的研究，以及基因组信息在生物体功能及其在遗传和进化过程中的表达与调控机制。

通过基因组学的研究，科学家们可以了解物种的遗传特征和进化过程，从而为农作物的改良提供理论基础。

二、基因组学在农作物改良中的应用1. 基因组测序与注释基因组测序是指对农作物基因组的整个DNA序列进行测定。

通过基因组测序，科学家们可以获得农作物的基因序列信息，进而了解特定基因的功能和位置。

注释则是对基因组数据进行解读，确定基因的编码区域、功能以及与其他基因的相互作用关系。

基因组测序与注释为后续的基因编辑和功能研究奠定了基础。

2. 基因编辑与功能研究基因编辑技术如CRISPR-Cas9的出现，使得科学家们能够直接对农作物基因组进行修改。

通过基因编辑，农作物中的有害基因可以被剔除或修复，有益基因可以被插入或增强。

此外，基因编辑还可以用于提高农作物的抗病性、耐盐碱性、产量等重要性状。

功能研究则通过对特定基因的敲除或过表达等手段，来揭示该基因在农作物生长发育、抗逆性等方面的功能。

3. 精确育种基因组学在农作物育种中有着巨大的潜力。

通过对农作物基因组的分析，科学家们可以发现与重要农艺性状相关的基因和突变体。

引入这些基因或突变体到育种材料中，可以加速育种进程，提高育种效率。

基因组学还可以帮助区分优质品种和劣质品种，在育种过程中做出准确的选择。

三、基因组学在未来农业领域的前景基因组学在农业领域的应用前景广阔。

随着新一代测序技术的不断发展，基因组测序的成本和时间将进一步降低，促进了大规模农作物基因组测序的实施。

此外，基因组学与其他技术的结合，如计算机科学和机器学习等，将加速基因数据的解读与分析。

浙江大学硕士学位论文农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的稻瘟病菌转化及致病突变体的筛选姓名：刘朋娟申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：王政逸20050501本研究受国家自然科学基金项目３０２７０８６１资助单位代码：——究生学号：——硕士学位论文农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）介导的稻瘟病菌转化及致病突变体的筛选论文评阅人：．郄鏖压潘废垡蒸友基答辩委员会主席：．郑康乐答辩委员会成员：奎蕉夔筮回盐国昌三遮逸论文答辩日期：摘要稻瘟病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｓｅａ）可以引起水稻上的重要病害一稻瘟病。

了解彪ｇｒｉｓｅａ的致病分子机理不仅对防治稻瘟病具有重要的意义，而且它作为一个理想的研究体系对了解其他植物病原真菌与寄主的相互作用也有重要的意义。

分离和鉴定稻瘟病菌的致病相关基因，是达到这一目标的关键所在。

ＢＮＡ插入突变是标记、分离功能基因的有效途径之一，ＡＴＭＴ是丝状真菌遗传转化的一个的新的技术，具有转化效率离、成本低，操作方便和重复性好多重优点。

我们在构建了二个含有潮霉素Ｂ磷酸转移酶基因双元载体的基础上，成功地实现了农杆菌介导的稻瘟病菌转化，转化效率达每１０６个分生孢子＞３００个转化子，并得到了４０００多个转化子。

通过继代培养和ＰＣＲ检测，证明插入到稻瘟病菌基因组中的潮霉素抗性基因可稳定遗传。

Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析表明，大约有２／３转化子的Ｔ－ＤＮＡ插入是单拷贝的。

用大麦叶片离体接种的方法快速测定部分稻瘟病菌转化子的致病性，发现一个致病缺陷突变体：Ａ１－４１２。

该突变体不能侵入水稻叶片及擦伤的大麦或水稻叶片，说明Ａ１．４１２突变体在寄主组织中扩展进程被阻断。

进一步的表型分析，发现Ａ１，４１２突变体的产孢量显著下降，仅为野生菌株的７％，在疏水表面不能形成附着胞，部分分生孢子萌发的速度也略有延迟。

Ｓｏｕｔｈｃｍ杂交显示Ａ１－４１２基因组中Ｔ－ＤＮＡ插入是单拷贝的。

水稻基因组学的新进展水稻是我国最重要的经济作物之一，也是世界上最重要的粮食作物之一。

水稻的高产和抗病能力一直是人们研究的重点，而水稻基因组学的进展让我们对这些问题有了更深入的认识。

1. 水稻基因组的测序2002年，国际水稻基因组组织（IRGSP）开始了水稻基因组的测序工作，历时10年，终于在2012年完全解析出了水稻基因组的所有序列。

这项工作的完成不仅有利于水稻的育种研究，也为其他谷物的基因组测序和研究奠定了基础。

2. 水稻基因的功能研究水稻基因组的解析，为研究水稻基因的功能提供了重要的基础。

现在已经有许多水稻基因的功能被证实，如水稻叶绿体RNA编辑因子OsPPR6可以提高水稻的干旱抗性；水稻盐胁迫相关基因OsNHX1可以提高水稻耐盐性等。

同时，通过比较水稻基因组和其他作物基因组的序列，也可以发现一些共同的基因，这为跨物种育种研究提供了可能。

3. 水稻品种改良水稻是我国的主要经济作物之一，也是粮食安全的重要保障。

但是由于品种单一，抗病能力不足等问题，水稻产量和质量受到了一定的影响。

然而通过基因组学的研究，人们能够更好地了解水稻的基因和生理特性，帮助设计更好的品种。

现在的水稻品种改良方法基本上是通过加强水稻基因的表达或抑制水稻不利基因的表达来改善水稻的生长和抵抗力。

例如可以利用CRISPR-Cas9技术，定向地修改水稻基因，达到改良品种的目的。

4. 水稻的基因多样性研究水稻基因组多样性对水稻种质资源的利用和保护起到了重要的作用。

水稻是典型的自交物种，不同地区和种植环境中的水稻品种基因组存在明显的差异。

这些之前未知的多样性为水稻的育种提供了新的资源。

5. 将水稻基因组技术应用于其他领域水稻基因组学的成功也为其他领域的基因组研究提供了经验和教训。

例如在医学领域，基因组学的发展能够帮助人们更好地理解人类基因及其疾病。

在环境保护方面，数字化的基因组学研究能帮助我们了解全球生态的演变和发展。

这些技术的发展和进步都离不开水稻基因组学的成功。

Molecular identification of Ds insertion sites and Ds-tagged genes in rice dwarf mutantAbstractMutants are important germplasm resources for crop genetic analysis and functional genomics research.Insertional mutations based on transposable elements are an important pathway for high throughput mutants.Ac/Ds transposable elements are the most widely used genetic elements for rice mutant libraries.Plant height is an important agronomic trait that directly affect the high yield and quality of crops in rice and other gramineous crops.In previous studies,we screened a dwarf mutant with Ds inserted from the Ac/Ds insertion mutant strain of japonica rice cultivar Dongjin(Oryza sativa L.var.Japonica cv.Dongjin).Using the mutant,this study was used to characterize the Ds insertion site and Ds marker gene in the genome.The aim of this study was to provide reference for the study of high quality and high yield rice breeding.The results of this study mainly include the following aspects:1.Preliminary Morphological and Physiological Identification of Dwarf Mutant. Compared with wide-type rice,the dwarf mutant showed dwarf height and large flag leaf angle.The data of the plant height,flag leaf and spike length.The results showed that the plant height of the mutant line(average plant height44.6cm)was significantly lower than that in wild-type rice(average plant height88.0cm).The flag leaf angle of the mutant line(74.3°)was significantly larger than that of wild-type rice(20.9°).2.Based on TAIL-PCR technique,the flanking sequences of the Ds insertion site of the dwarf mutant genome were amplified and separated by the combination of different degenerate primers and specific primers.Through NCBI-BLAST analysis,we found that the Ds element inserted in a gene which coding divalent ion transporter protein on chromosome3(gene="Os03g0147400",protein_id="BAS82290.1").3.The Ds-tagged gene contains three exons and two introns,with Ds is inserted in the third exon.This gene encoded a469amino acid with divalent ion transporter protein. The dwarf phenotype is derived from the insertion of the Ds element on the divalent iontransporter protein gene,The study illustrated that the gene was related to the divalent ions necessary for the normal growth and development of rice,and the normal plant height of rice was maintained by ion absorption,transport and distribution.4.RACE technology was used to validate the impact of Ds insertion to the structures and functions of the Ds-tagged genes.Bioinformatics analysis of the results showed that,compared with the wild type rice,the structure of the divalent ion transporter protein encoded by the dwarf mutant rice was changed by a mechanism called exon shuffling.The length of the second exon of the gene which encode divalent ion transporter protein had shortened from1214bp to590bp.The shorten exon contained parts of Ds sequences.5.Real-time quantitative PCR was used to detect the expression of Ds-tagged genes in mutants in different organs.The results of SPSS software showed that the expression of Ds-tagged gene was the highest in stem,followed by leaf,root and stamens.As a whole,we preliminary forecasted that the expression of Ds was the highest in the stem,and the Ds insertion induced the exonation of the related gene.The structure of the divalent ion transporter was changed and involved in the life activities of the rice of the necessary ions,functional molecules to absorb and transport obstacles,leading to rice plant phenotypic dwarf.Key words:Rice(Oryza sativa L);Dwarf mutant;Ac/Ds;RACE;Quantitative real-time PCRWritten by:Guo YanyanSupervised by:Sun Bingyao目录第一章文献综述 (1)1水稻功能基因组学研究现状 (1)2突变体库的创建背景和创建方法 (3)2.1物理和化学诱变构建水稻突变体库 (3)2.2插入突变构建水稻突变体库 (4)3Ac/Ds转座机制及插入位点的鉴定 (6)3.1Ac/Ds的转座机制 (6)3.2克隆插入位点侧翼序列的方法 (8)3.3转座子拷贝数的测定 (10)4基于RACE技术分离克隆水稻基因 (14)4.1RACE技术的基本原理 (14)4.2新型的RACE技术 (16)4.3RACE技术的应用 (17)5水稻株高与离子转运体蛋白的研究进展 (18)6本研究的目的与意义 (20)第二章Ac/Ds插入水稻矮杆突变体侧翼序列扩增及相关标记基因生物信息学分析 (21)1材料 (21)1.1植物材料 (21)1.2引物信息 (21)2方法 (22)2.1突变体水稻的筛选 (22)2.2水稻基因组DNA的提取 (23)2.3Ac/Ds双元件在水稻基因组上插入的PCR检测 (24)2.4Ds插入位点旁侧序列扩增的TAIL-PCR检测 (25)2.5Ds插入位点的侧翼序列的TA克隆及序列测定 (27)3结果与分析 (30)3.1矮杆突变体与野生型水稻的表型特征观察 (30)3.2矮杆突变体基因组Ac/Ds的插入 (32)3.3矮杆突变体Ds插入位点的侧翼序列 (33)3.4Ds插入矮杆突变体水稻相关标记基因的初步生物信息学分析 (34)4讨论 (38)第三章Ds插入水稻矮杆突变体相关标记基因结构变化的生物信息学分析 (41)1材料 (41)1.1植物材料 (41)1.2引物信息 (41)2方法 (42)2.1水稻总RNA的提取 (42)2.2总RNA反转录成cDNA (44)2.3总RNA反转录成cDNA的质量检测 (44)2.4RACE技术扩增水稻相关基因cDNA末端 (45)2.5目的片段的TA克隆及序列测定 (47)2.6水稻Ds相关标记基因cDNA序列的初步生物信息学分析 (48)2.7qPCR检测Ds标记基因的组织表达水平 (49)3结果与分析 (50)3.1水稻总RNA提取方法的比较 (50)3.2水稻总RNA反转录成cDNA的质量检测 (51)3.3RACE技术扩增水稻Ds插入位点相关标记基因的结构的cDNA末端..513.4水稻Ds插入相关标记基因信息的初步生物信息学分析 (52)3.5Ds标记基因在突变体不同器官中的表达分析 (54)4讨论 (55)第四章小结与展望 (58)1全文小结 (58)2展望 (59)参考文献 (60)硕士在读期间发表的论文 (74)致谢 (75)第一章文献综述1水稻功能基因组学研究现状进入21世纪，随着农业产业的发展和全球经济一体化的逐步形成，土地资源短缺，农业环境污染，传统技术育种困难，种质资源发掘、基因组育种技术亟需创新等这些都是我国种业正面临前所未有的严峻挑战[1]。