从线粒体角度探讨辅助生殖技术安全问题_陈燕 (1)

·综述·从线粒体角度探讨辅助生殖技术安全问题*陈燕1，2综述，蔡学泳2审校（1．广州医科大学，广州510000；2．深圳市第二人民医院，深圳518000）【摘要】线粒体对于细胞的生长至关重要，线粒体基因组（mtDNA）突变率高，线粒体数量及DNA拷贝数的改变将会影响卵母细胞的正常功能。

辅助生殖技术在生命形成最关键、最易受外界影响的受精和胚胎早期发育阶段进行了干预，可能对卵母细胞及胚胎线粒体造成影响。

本文将从高龄因素、控制性超排卵与体外成熟、卵母细胞及胚胎冷冻与复苏、显微操作四个角度对卵母细胞DNA缺失及能量代谢产生的影响，以及如何减少辅助生殖过程中对人卵母细胞及胚胎线粒体损伤等方面进行探讨。

【关键词】线粒体；mtDNA；辅助生殖技术；卵母细胞中图分类号：Ｒ715．5文献标志码：A文章编号：1004－7379（2015）09－0711－03DOI：10．13283/j．cnki．xdfckjz．2015．09．020线粒体对细胞的生长至关重要，线粒体基因组（mtDNA）是一个16．6kb的环形、双链DNA，序列中几乎全部为编码序列，是人类细胞中唯一的核外遗传物质。

mtDNA的复制从启动至终止与细胞氧化磷酸化代谢过程紧密相关。

mtDNA由于缺少组蛋白的保护及有效的修复系统，突变率高、进化快。

mtDNA的突变率约是核DNA的20倍［1］。

mtDNA的任何改变都可能造成细胞能量代谢的降低和自由基的增多，影响细胞功能。

卵母细胞线粒体功能成熟影响着卵子的发育潜能。

胚胎线粒体100%来源于卵母细胞，对胚胎发育起着至关重要的作用［2］。

线粒体不仅为卵母细胞的成熟、受精及随后的胚胎发育提供能量，还与卵母细胞激活、钙振荡、凋亡等生命过程密切相关。

辅助生殖技术（assisted reproductive technolo-gy，AＲT）是指在体外操作配子和胚胎帮助不孕夫妇受孕的一组方法。

AＲT对配子和胚胎进行各种操作，是否造成线粒体的累积损伤从而累及出生子代的发育健康，值得探讨。

本文将从高龄因素、控制性超排卵与体外成熟、卵母细胞及胚胎冷冻与复苏、显微操作四个角度对卵母细胞DNA缺失及能量代谢产生的影响进行探讨，以及如何减少辅助生殖过程中对人卵母细胞及胚胎线粒体损伤。

1线粒体缺陷与生殖功能障碍线粒体的缺陷可导致疾病的发生，包括不孕症和生殖功能障碍。

研究表明，mtDNA的异常与不孕有着明确的关系［3］，无精症患者体内存在特定的mtDNA突变或缺失［4］。

在非正常线粒体内不能启动ATP的产生，导致纺锤体、染色体形成异常，进而影响受精。

卵母细胞线粒体功能失调可导致受孕率降低，引起植入前胚胎发育延迟及停滞。

在进行IVF所收集的卵母细胞中，与正常组相比，受精失败的卵母细胞内mtDNA显著减少，mtDNA拷贝数低的卵母细胞所形成的囊胚率也显著降低［5］。

抑制卵母细胞成熟过程中线粒体新陈代谢的能力，将对卵母细胞及胚胎造成不利影响。

葛红山等［6］利用小鼠建立氧化磷酸化抑制模型，验证线粒体氧化磷酸化功能在卵子成熟、受精和发育过程中的具体作用，发现线粒体能量缺乏显著降低卵子的核成熟率、ＲOS生成、纺锤体/染色体结构完整率和囊胚形成率。

可见线粒体数量及功能正常对于受精、着床、囊胚形成及胚胎发育等生殖过程有着重要作用。

2辅助生殖过程中影响人卵母细胞及胚胎线粒体结构和功能的因素2．1高龄因素对线粒体的影响随着年龄的增加，卵巢储备下降，卵泡线粒体数量发生急剧变化，线粒体自由基活性增强，mtDNA发生突变，线粒体Ca2+震荡不能触发ATP的产生，影响正常的生理功能，从而导致与年龄相关的卵巢功能衰退和不孕。

有研究证实，高龄妇女卵子mtDNA突变率及缺失显著高于年轻妇女［7］。

Hamatani等［8］比较了5 6周小鼠与42 45周小鼠的卵母细胞，发现530个基因有显著差异，其中包括参与线粒体功能的基因（mt-Atp6、Sod1、Hspa4、Nfkbia等）。

利用基因工程改造的polgA敲除小鼠，所编码的mtDNA聚合酶催化亚基存在缺失，mtDNA突变累积在9个月大时，小鼠出现卵巢早衰［9］。

该实验证明了mtDNA突变与老化存在因果关系。

高龄妇女的辅助受孕结局一直不佳，与卵子出现不可逆转的老化现象密切相关。

卵细胞质移植、生殖泡移植、纺锤体移植和原核移植等技术可挽救卵子的老化或突变，使其获得一定数量功能完整的线粒体，提高卵子的发育潜能。

2．2控制性超排卵与体外成熟对线粒体的影响体外成熟（in vitro maturation，IVM）通过模拟体内卵母细胞的成熟环境，使从卵巢采集的未成熟卵母细胞在体外达到最后成熟。

117现代妇产科进展2015年09月第24卷第09期Prog Obstet Gynecol，Sep．2015，Vol.24，No.09 *深圳市科创委基金（No：JCYJ20120830023841）IVM卵母细胞mtDNA拷贝数、ATP和ＲOS产量等都显著低于体内成熟卵母细胞，线粒体分布也会发生改变。

控制性超排卵（controlled ovarian hyperstimulation，COH）通过注射大剂量外源性促性腺激素（Gonadotropins，Gn）获得多个卵泡，为移植胚胎提供多个选择。

Gn刺激强度和时相的改变影响卵母细胞的成熟及其分裂，非生理性COH抑制了卵母细胞线粒体复制和氧化磷酸化过程［10］。

促性腺激素的注射和IVM 的培养可改变一些与线粒体复制、线粒体功能相关的基因，如Tfam、NＲF1［11］。

在猴子、仓鼠及牛的卵母细胞中发现，大剂量Gn会对mtDNA的拷贝数和结构、线粒体代谢和分布产生损害，导致卵母细胞发育潜能降低［12－13］。

由此可见，非生理性COH和IVM可减少含有正常分布线粒体的卵母细胞数，同时减少了mtDNA的拷贝数，诱发mtDNA的突变和氧化应激损伤，增加了非正常细胞骨架的百分比，对卵母细胞造成损伤，影响卵母细胞胞质成熟。

有研究显示，IVM操作并未增加婴儿染色体异常率、畸形率，儿童智力及发育也未见异常［14］。

但目前随访数量不足，仍需大样本追踪随访。

2．3胚胎及卵母细胞冷冻与复苏对线粒体的影响冷冻保存是辅助生殖技术的重要环节，冷冻-解冻过程中出现的低温、胞内pH、电解质浓度的改变会影响卵母细胞线粒体的超微结构，使线粒体处于应激状态，出现氧自由基损伤，进而影响线粒体功能。

目前研究发现，冷冻保存的体内成熟卵母细胞的染色体核型及纺锤体正常，但皮质颗粒向外释放，滑面内质网囊泡出现肿胀，受精率或囊胚率低［15］。

Nazmara 等［16］研究发现，GV期和MII期小鼠卵母细胞经玻璃化冷冻及复苏后并未影响卵母细胞的发育潜能及ATP含量，但对体外成熟卵母细胞线粒体分布有一定影响。

MII期牛卵母细胞经冷冻后并未影响其ATP含量［17］。

Lei等［18］发现，玻璃化冷冻对于染色体及纺锤体未产生显著影响，但干扰了线粒体功能。

玻璃化冷冻后的牛卵母细胞ATP含量低于新鲜组，在复苏后能较好的恢复，但不能达到新鲜组水平［19］。

玻璃化冷冻后的人GV期卵母细胞的ATP含量低于新鲜组［20］。

目前的研究结果存有差异，可能与样本的种类、基因、年龄、促排卵的方式、培养基及检测方法等相关。

胚胎及卵母细胞冷冻与复苏对线粒体的影响还需更多深入的研究。

2．4显微操作对线粒体的影响卵胞浆内单精子显微注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）是男性不育症较有效的治疗方法，ICSI具有更多侵入性操作，并且绕过了正常受精时精子的自然选择过程，使婴儿出生缺陷率增加，其安全性问题越来越受到重视。

研究显示，ICSI操作可改变卵母细胞遗传和功能的完整性，显著增加小鼠体内外成熟卵母细胞ＲOS水平，导致不同程度的组蛋白变异体H2AX磷酸化［21］。

ICSI可能会将mtDNA缺陷或疾病遗传给后代。

目前没有证据能证明ICSI会增加因父系mtDNA传递所导致的mtDNA 疾病风险［22］。

胚胎移植前遗传学诊断（preimplantation genet-ic diagnosis，PGD）是在人类辅助生殖技术的基础上从配子或体外受精所形成的胚胎中取出一部分细胞进行遗传学分析诊断。

PGD为有严重且不可治愈的遗传性疾病的夫妇提供了一种新的选择。

目前相关报道多关注于PGD与线粒体疾病、胞浆置换等方面，对于线粒体的复制、拷贝数及其它线粒体指标关注较少，需从线粒体角度进一步研究子代安全性问题。

3人卵母细胞及胚胎在辅助生殖操作过程中的线粒体损伤预防3．1辅助生殖操作时的预防和保护卵母细胞线粒体状态易受非生理性操作的影响，AＲT作用于配子成熟及胚胎早期发育敏感时期，可能会影响线粒体DNA的复制和线粒体功能的完整性。

尤其是ICSI跨越了自然选择过程，易受精子质量、实验操作技术及实验条件的影响。

PGD为创伤性操作，对卵母细胞及胚胎在各个水平都可能造成损伤。

目前聚合酶连反应和荧光原位杂交诊断技术对PGD诊断有较大风险，需更准确的诊断技术，如微阵列比较基因组杂交技术、单核苷酸多态性分析等。

行IVF-ICSI、PGD等操作时，需模拟人体生理环境，选择合适的培养基，为精子、卵母细胞及胚胎提供合适的体外生长环境，同时应尽量缩短对卵子或胚胎的体外操作时间。

COH与一些生殖疾病相关，如卵巢过度刺激综合征的发生、非整倍体及异常基因组概率的增加［23］。

COH治疗时需重视患者卵巢高反应，运用低剂量超排卵、微刺激、渐减等个体化方案，减少对卵巢的刺激及不良反应，减少对线粒体的损伤，优化卵母细胞质量。

IVM卵子的线粒体分布不同于体内成熟卵子，在IVM过程中通过降低氧含量可提高卵母细胞的发育潜能［24］。

玻璃化所需的高浓度的冷冻保护剂可能会对卵子及胚胎产生较高的毒性，需进一步观察有效性和安全性，寻找更安全的试剂。

AＲT实验室是体外受精、胚胎培养和移植、冷冻等过程的重要场所，建立完善的实验室质量检测系统，最大限度的避免产生过量的活性氧，采取有效技术及质量控制措施，规范实验室操作程序，优化实验室环境，保证AＲT安全，保护后代健康。

3．2药物预防和保护AＲT操作过程中，活性氧可产生于细胞内、细胞外或对配子操作的各个环节中。

多种抗氧化剂，如抗坏血酸、尿酸、异黄酮、牛磺酸、亚牛磺酸、α-生育酚可作为培养基添加剂降低氧化应激损伤及DNA损伤风险［25］。

线粒体营养剂可保护线粒体免受氧化损伤，改善线粒体功能。

文献报道，维生素C及E能延缓繁殖期小鼠与年龄相关的衰退［26］。

α-硫辛酸、辅酶Q10、白藜芦醇等营养剂及抗氧化剂均能有效改善神经源性及心血管性疾病［27］。

辅酶Q10是主要的细胞抗氧化剂，随着年龄的增加，其含量逐渐减低，辅酶Q10的缺失及突变可引起线粒体功能的紊乱。