第五章 高效液相色谱法(6h)

第五章 高效液相色谱法
高效液相色谱（High Performance Liquide Chromatography）还可称为高压液相色谱 （High Pressure Liquide Chromatography）、高速液相色谱（High Speed Liquide Chromatography）、高分 离度液相色谱（High Resolution Liquide Chromatography）或现代液相色谱 （Modern Liquide Chromatography）。
第二节 高效液相色谱法的分类 高效液相色谱法可依据溶质(样品) 高效液相色谱法可依据溶质(样品)在固定相和流动相 分离过程的物理化学原理分类。 分离过程的物理化学原理分类。 吸附色谱( (1)吸附色谱(Adsorption Chromatography) 用固体 ) 吸附剂作固定样 品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离。 品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离。
（3）检测灵敏度高 在高效液相色谱法中使用的检测 ） 器大多数都具有较高的灵敏度。 器大多数都具有较高的灵敏度。如被广泛使用的紫外 吸收检测器，最小检出量可达10-9g；用于痕量分析 吸收检测器，最小检出量可达 ； 的荧光检测器，最小检出量可达10-12g。 的荧光检测器，最小检出量可达 。 由于高压输液泵的使用， （4）分析速度快 由于高压输液泵的使用，相对于经 ） 典液相（ 色谱，其分析时间大大缩短， 典液相（柱）色谱，其分析时间大大缩短，当输液压 力增加时，流动相流速会加快， 力增加时，流动相流速会加快，完成一个样品的分析 时间仅需几分钟到几十分钟。 时间仅需几分钟到几十分钟。 高效液相色谱法除具有以上特点外， 高效液相色谱法除具有以上特点外，它的应用范围也 日益扩展。由于它使用了非破坏性检测器， 日益扩展。由于它使用了非破坏性检测器，样品被分 析后，在大多数情况下，可除去流动相， 析后，在大多数情况下，可除去流动相，实现对少量 珍贵样品的回收，亦可用于样品的纯化制备。 珍贵样品的回收，亦可用于样品的纯化制备。
(3)离子色谱 离子色谱(Ion Chromatography) 用高效微粒离子 离子色谱 交换剂作固定相，以具有一定pH值的缓冲溶液作流动 交换剂作固定相，以具有一定 值的缓冲溶液作流动 相，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上 表面带电荷基团进行可逆性离子交换能力的差别而实 现分离。 现分离。
第四节 高效液相色谱仪简介 高效液相色谱仪可分为分析型和制备型， 高效液相色谱仪可分为分析型和制备型，虽然它们的性能 各异、应用范围不同，但其基本组件是相似的， 各异、应用范围不同，但其基本组件是相似的，对分析型商品 仪器可有如下两种组合方式： 仪器可有如下两种组合方式： 完全紧凑的整体系统。其死体积小，灵敏度高， ①完全紧凑的整体系统。其死体积小，灵敏度高，体现高 效液相色谱仪总体实用的特点。 效液相色谱仪总体实用的特点。 ②独立部件的组合系统。其灵活性高，可根据不同的分析 独立部件的组合系统。 其灵活性高， 目的，组装成不同的联接方式。 目的，组装成不同的联接方式。 现在用微处理机控制的高效液相色谱仪， 现在用微处理机控制的高效液相色谱仪，其自动化程度很 即能控制仪器的操作参数(如溶剂梯度洗脱、流动相流量、 高 ， 即能控制仪器的操作参数 ( 如溶剂梯度洗脱 、 流动相流量 、 柱温、 自动进样、洗脱液收集、 检测器功能等) 柱温 、 自动进样 、 洗脱液收集 、 检测器功能等 ) ， 又能对获得 的色谱图进行收缩、放大、叠加，以及对保留数据和峰高、 的色谱图进行收缩、放大、叠加，以及对保留数据和峰高、峰 面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高效率、 面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高效率、功能齐全 的分析工具。 的分析工具。
第一节 高效液相色谱法的特点
高效液相色谱法具有以下特点。 高效液相色谱法具有以下特点。 （1）分离效能高 由于新型高效微粒固定相填 ） 料的使用，液相色谱填充柱的柱效可达 2×103~5×104块/米理论塔板数，远远高于气相 米理论塔板数， × × 米理论塔板数 色谱填充柱10 米理论塔板数的柱效。 色谱填充柱 3块/米理论塔板数的柱效。 米理论塔板数的柱效 由于液相色谱柱具有高柱效， （2）选择性高 由于液相色谱柱具有高柱效， ） 并且流动相可以控制和改善分离过程的选择性。 并且流动相可以控制和改善分离过程的选择性。 因此， 因此 ，高效液相色谱法不仅可以分析不同类型 的有机化合物及同分异构体， 的有机化合物及同分异构体， 还可分析在性质 上极为相似的旋光异构体， 上极为相似的旋光异构体 ，并已在高疗效的合 成药物和生化药物的生产控制分析中发挥了重 要的作用。 要的作用。
二、方法的局限性 第—，在高效液相色谱法中，使用多种溶剂作为流动相， ，在高效液相色谱法中，使用多种溶剂作为流动相， 当进行分析时所需成本高于气相色谱法，且易引起环境污染。 当进行分析时所需成本高于气相色谱法，且易引起环境污染。 当进行梯度洗脱操作时，它比气相色谱法的程序升温操作复杂。 当进行梯度洗脱操作时，它比气相色谱法的程序升温操作复杂。 第二， 第二，高效液相色谱法中缺少如气相色谱法中使用的通用 型检测器(如热导检测器和氢火焰离子化检测器) 型检测器(如热导检测器和氢火焰离子化检测器)。近年来蒸发 激光散射检测器的应用日益增多， 激光散射检测器的应用日益增多，有望发展成为高效液相色谱 法的一种通用型检测器。 法的一种通用型检测器。 第三，高效液相色谱法不能替代气相色谱法， 第三，高效液相色谱法不能替代气相色谱法，去完成要求 柱效高达10万块理论塔板数以上， 10万块理论塔板数以上 柱效高达10万块理论塔板数以上，必需用毛细管气相色谱法分 析组成复杂的具有多种沸程的石油产品。 析组成复杂的具有多种沸程的石油产品。 第四，高效液相色谱法也不能代替中、低压柱色谱法， 第四，高效液相色谱法也不能代替中、低压柱色谱法，在 200kPa kPa至 MPa柱压下去分析受压易分解 柱压下去分析受压易分解、 200kPa至1MPa柱压下去分析受压易分解、变性的具有生物活性 的生化样品。 的生化样品。 综上所述可知， 综上所述可知，高效液相色谱法也和任何一种常用的分析 方法一样，都不可能十全十美， 方法一样，都不可能十全十美，作为使用者在掌握了高效液相 色谱法的特点，应用范围和局限性的前提下， 色谱法的特点，应用范围和局限性的前提下，充分利用高效液 相色谱法的特点，就可在解决实际任务中发挥重要的作用。 相色谱法的特点，就可在解决实际任务中发挥重要的作用。
(2)分配色谱 分配色谱(Partition Chromatography) 用载带在固相基体上 分配色谱 的固定液作固定相，以不同极性溶剂作流动相， 的固定液作固定相，以不同极性溶剂作流动相，依据样品中各 组分在固定液上分配性能的差别来实现分离。 组分在固定液上分配性能的差别来实现分离。根据固定相和液 体流动相相对极性的差别， 体流动相相对极性的差别，又可分为正相分配色谱和反相分配 色谱。当固定相的极性大于流动相的极性时，可称为正相分配 色谱。当固定相的极性大于流动相的极性时， 色谱或简称正相色谱(Normal Chromatography)； 色谱或简称正相色谱(Normal Phase Chromatography)；若固定 相的极性小于流动相的极性时， 相的极性小于流动相的极性时，可称为反相分配色谱或简称反 相色谱(Reversed Phase Chromatography)。 相色谱 。
高效液相色谱仪的组成 1一贮液罐；2一搅拌、超声脱气器；3一梯度淋洗装置；4一 高压输液泵；5一流动相流量显示；6一柱前压力表；7一输液 泵泵头；8一过滤器；9一阻尼器；10一六通进样阀；11一色 谱柱；12一紫外吸收(或折光指数)检测器；13一记录仪(或数 据处理装置)；14一回收废液罐
一、高压输液泵 对高压输液泵的要求是： 对高压输液泵的要求是： ①泵体材料能耐化学腐蚀。通常使用普通耐酸不锈钢 （ Cr1Ni8Ti9）或优质耐酸不锈钢 ） 或优质耐酸不锈钢(Cr18Nil2Mo2)。为防止酸 、 。 为防止酸、 碱缓冲溶液的腐蚀， 碱缓冲溶液的腐蚀， 在离子色谱或亲和色谱分析中现已使用 由聚醚醚酮(PEEK)材料制成的高压输液泵。 材料制成的高压输液泵。 由聚醚醚酮 材料制成的高压输液泵 能在高压下连续工作。通常要求耐压40~50MPa·cm-2，能 ②能在高压下连续工作。通常要求耐压 连续工作。 在8～24h连续工作。 ～ 连续工作 输出流量范围宽。 对填充柱： ～ 分析型)； ③ 输出流量范围宽 。 对填充柱 ： 0.1～l0mL／min(分析型 ； ／ 分析型 1~100mL／min(制备型 。对微孔柱：10～1000uL／min(分析 制备型)。 ／ 制备型 对微孔柱： ～ ／ 分析 制备型)。 型)；1~9900uL／min(制备型 。 ； ／ 制备型 输出流量稳定，重复性高。高效液相色谱使用的检测器， ④输出流量稳定，重复性高。高效液相色谱使用的检测器， 大多数对流量变化敏感，高压输液泵应提供无脉冲流量。 大多数对流量变化敏感，高压输液泵应提供无脉冲流量。这 样可以降低基线噪声并获较好的检测下限。 样可以降低基线噪声并获较好的检测下限。流量控制的精密 度应小于1％，最好为0.5％，重复性最好为0.5％。 ％，最好为 ％，重复性最好为 度应小于 ％，最好为 ％，重复性最好为 ％。
(5)亲和色谱( (5)亲和色谱(Affinity Chromatography) 以 亲和色谱 ) 在不同基体上， 在不同基体上，键合多种不同特性的配位体 作固定相，用具有不同pH pH值的缓冲溶液作流 作固定相，用具有不同pH值的缓冲溶液作流 动相，依据生物分子(氨基酸、 蛋白质、 动相，依据生物分子(氨基酸、肽、蛋白质、 核碱、核苷、核苷酸、核酸、酶等) 核碱、核苷、核苷酸、核酸、酶等)与基体上 键联的配位体之间存在的特异性亲和作用能 力的差别， 力的差别，而实现对具有生物活性的生物分 子的分离。 子的分离。
(4)体积排阻色谱 体积排阻色谱(Size Exclusion Chromatography) 用 体积排阻色谱 化学惰性的多孔性凝胶作固定相， 化学惰性的多孔性凝胶作固定相，按固定相对样品中 各组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。 各组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。以水溶 液作流动相的体积排阻色谱法， 液作流动相的体积排阻色谱法，称为凝胶过滤色谱 (Gel Filtration Chromatography)；以有机溶剂作流动 ； 相的体积排阻色谱法，称为凝胶渗透色谱法 相的体积排阻色谱法，称为凝胶渗透色谱法(Gel Permeation Chromatography)。 。