第十八章高效液相色谱法

高效液相色谱技术
高效液相色谱(HPLC)技术是一种用于分离、纯化、定性和定量分析溶液中化合物的技术。

它是在液相色谱技术基础上发展起来的，具有分离能力强、分辨率高、灵敏度高、分析速度快等优点。

HPLC技术的核心是色谱柱和溶液泵。

色谱柱是分离样品的重要部分，根据不同的分离目标可以选择不同类型的柱子，例如反相柱、离子交换柱、大小分子排阻柱等。

溶液泵用于将样品溶液以一定的流速推动通过色谱柱，保持流动相的恒定。

高效液相色谱技术主要包括以下几个步骤：
1. 样品预处理：将待分析样品进行处理，如提取、浓缩、溶解等，以便于后续的分析。

2. 进样：将样品注入到进样装置中，通过自动或手动控制，精确地给定进样体积。

3. 分离：在色谱柱中根据样品分离目标的性质和柱上固定相的特性，通过流动相的带动将样品分离。

4. 检测：利用检测器检测样品的浓度或质量，并将信号转化为电信号输出。

5. 数据处理：通过对检测器输出信号的处理和计算，得到对样品的定性和定量分析结果。

高效液相色谱技术在许多领域得到广泛应用，如药学、环境监测、食品安全等。

它能够对样品中的化合物进行高效、灵敏、准确的分离和分析，为科研和工业生产提供了强有力的工具。

高效液相色谱法1 简述高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵人装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离侧定的色谱方法。

注人的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进人检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

1.1 对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪，由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成，仪器应按现行国家技术监督局“液相色谱仪检定规程”定期检定并符合有关规定。

色谱柱内径一般为3.9～4.6μm，填充剂粒径为3～10μm。

超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度的高效液相色谱仪。

1.1.1色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。

常见的载体有硅胶、聚合物符合硅胶和聚合物等；常见的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。

正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。

常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。

氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。

离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。

有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。

手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。

色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。

温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。

为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。

最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。

反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶(如氛基键合硅烷和氨基键合硅烷等)也有使用。

正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。

高效液相色谱法定义
高效液相色谱法是一种分离和分析混合物的方法。

它基于混合物在流动相和固定相之间的分配差异来实现分离。

高效液相色谱法使用高压输液系统将流动相泵入色谱柱中，待分析的混合物通过进样器注入流动相中，然后在色谱柱中进行分离。

色谱柱通常填充有特殊的固体吸附剂或化学键合相，混合物中的成分在流动相和固定相之间分配，根据其分配系数的差异而分离。

分离后的成分依次通过检测器进行检测，常见的检测器包括紫外-可见检测器、荧光检测器、电化学检测器等。

检测到的信号被记录下来，通过对信号的分析和比较，可以确定混合物中各成分的含量和性质。

高效液相色谱法具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高、适用范围广等优点，广泛应用于药物分析、环境监测、食品分析、生物化学等领域。

第十八章 高效液相色谱法15.外标法测定黄芩颗粒剂中黄芩苷含量：色谱柱为Zirchrom C8柱（20cm ×4.6mm ，5um ）；流动相为乙腈-甲醇-水（含0.5%三乙胺，磷酸调pH3.0）（28：18：54）；以黄芩苷对照品配成浓度范围为10.3～144.2ug/ml 的对照品溶液。

进样，测得黄芩苷峰面积，以峰面积和对照品浓度求得回归方程为：A=1.168×105c-1.574×103，r=0.9998.精密称取黄芩颗粒0.1255g ，置于50ml 量瓶中，用70%甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取1ml 于10ml 量瓶中，30%甲醇定容到刻度，摇匀即得供试品溶液。

平行测定供试品溶液和对照品溶液（61.8ug/ml ），得峰面积分别为4250701，5997670. 解：标样标样A A c =c 599767042507018.6110/=样c %4.17%1001255.01050%6=⨯⨯=-样c w 16．校正因子法测定复方炔诺酮片中炔雌醇的含量：ODS 色谱柱；甲醇-水（60：40）流动相；检测器UV280nm ；对硝基甲苯为内标物。

（1）校正因子的测定：取对硝基甲苯（内标物）、炔诺酮和炔雌醇对照品适量，用甲醇制成10ml 溶液，进样10ul ，记录色谱图。

重复三次。

测得含0.0733mg/ml 内标物、0.600mg/ml 炔诺酮和0.035mg/ml 炔雌醇的对照品溶液平均峰面积列于表18-6。

（2）试样测定：取本品20片，精密称定，求出平均片重（60.3mg/片）。

研细后称取732.8mg （约相当于炔诺酮7.2mg ），用甲醇配制成10ml 供试品溶液（含内标物0.0733mg/ml ）。

测得峰面积列于表18-6。

表18-6 复方炔诺酮片中各成分及内标物平均峰面积（u v ·s ）解：02.3)10587.6/(100733.0)10043.1/(10035.0A /m A /m f 55s s =⨯⨯⨯⨯==醇醇醇 试样含炔雌醇的量：)mg (449.010841.610387.1100733.002.3A A m f m 55s s =⨯⨯⨯⨯⨯=⋅⋅=醇醇醇 每片含炔雌醇的量：)/mg 0369.0(3.608.732449.0片=⨯ 17．测定生物碱试样中黄连碱和小檗碱的含量，称取内标物、黄连碱和小檗碱对照品各0.2000g 配成混合溶液。

一、主要内容1．基本概念（1）化学键合相：利用化学反应将有机基团键合在载体表面形成的固定相。

（2）化学键合相色谱法：以化学键合相为固定相的色谱法。

（3）正（反）相色谱法：流动相极性小（大）于固定相极性的液相色谱法。

（4）抑制型（双柱）离子色谱法：用抑制柱消除流动相的高电导本底，以电导为检测器的离子交换色谱法。

（5）手性色谱法：利用手性固定相或手性流动相添加剂分离分析手性化合物的对映异构体的色谱法。

（6）亲合色谱法：利用或模拟生物分子之间的专一性作用，从复杂生物试样中分离和分析特殊物质的色谱方法，是基于组分与固定在载体上的配基之间的专一性亲和作用而实现分离的色谱法。

（7）梯度洗脱：在一个分析周期内程序控制改变流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等。

（8）静态流动相传质阻抗Csm：由于组分的部分分子进入滞留在固定相微孔内的静态流动相中，因而相对晚回到流路中，引起的峰展宽。

（9）键合相的含碳量：键合相碳的百分数，可通过对键合硅胶进行元素分析测定。

（10）键合相的覆盖度：参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。

（11）封尾：在键合反应后，用三甲基氯硅烷等对键合相进行钝化处理，减少残余硅醇基，即封尾。

（12）溶剂的极性参数P'：表示溶剂与三种极性物质乙醇（质子给予体）、二氧六环（质子受体P'）和硝基甲烷（强偶极体）相互作用的强度。

用于度量分配色谱的溶剂强度。

P'越大，溶剂的极性越强，在正相分配色谱中的洗脱能力越强。

（13）溶剂的强度因子S：常为反相键合相色谱的溶剂洗脱能力的度量。

（14）三维光谱－色谱图：用DAD检测器检测，经过计算机处理，将每个组分的吸收光谱和试样的色谱图结合在一张三维坐标图上，即获得三维光谱-色谱图。

2．基本理论（1）速率理论在HPLC中表达式为：H=A+C m u+C s m u 用于指导实验条件的选择。

A、Cm和Csm均随固定相粒度dp变小而变小，因此保证HPLC高柱效的主要措施是使用小粒度的固定相。