卟啉衍生物TMPyP4与单链DNA的结合机理研究_张慧娟

第 ３０ 卷
要课题还很少受到关注． 作者首先通过圆二色谱手段，研究了端粒 ＤＮＡ
５′－ＴＴＡＧＧＧ－３′（简 写 为 Ｓ６）没 有 金 属 离 子 存 在 的 缓 冲液中的结构，结 果 表 明 其 仍 以 单 链 形 式 存 在．在 此 基 础 上 ，通 过 稳 态 吸 收 、稳 态 荧 光 和 时 间 分 辨 荧 光 光谱深入 研 究 了 水 溶 性 的 卟 啉 衍 生 物 ｍｅｓｏ－四 （４－ （Ｎ－甲基吡 啶 基））卟 啉 （ＴＭＰｙＰ４）与 单 链 Ｓ６ＤＮＡ 的相互作用机理．
１ 仪器与试剂
圆 二 色 谱 （ＣＤ）实 验 在 Ｊｏｂｉｎ－Ｙｖｏｎ 公 司 生 产 的 ＣＤ６谱仪上进行，仪 器 配 有 控 温 水 浴．实 验 中 采 用 １ｃｍ 样品池进行测定，扫描波长范围２２０～５００ｎｍ， 扫 描 间 隔 １ｎｍ，所 有 实 验 数 据 均 是 在 扣 除 相 应 缓 冲 溶 液 的 背 景 信 号 基 础 上 得 到 的 ．稳 态 吸 收 光 谱 和 荧 光光谱分别在 Ｈｉｔａｃｈｉ Ｕ－３３１０光谱仪和 Ｈｉｔａｃｈｉ Ｆ－ ２５００荧光光谱仪上进行，时间分 辨 荧 光 光 谱 实 验 仪 器参见文献［９］，实验中激发波长为 ４００ｎｍ，检测波 长 范 围 为６３０～７５０ｎｍ．为 了 避 免 激 光 的 干 扰 ，使 用 了４３０ｎｍ 以 下 的 截 止 滤 光 片，实 验 中 仪 器 响 应 函 数 半 峰 宽 为 ３０ｐｓ，所 有 光 谱 测 量 均 是 在 室 温 下 进 行 的．
１３６７
的结果如图２（ｂ）所示，由曲线的斜率得到结合常 数 ｋｉ 为１．５１×１０６（ｍｏｌ／Ｌ）－１，结合位点数为１．２．
溶 液 中 呈 现 裂 分 不 明 显 的 双 峰，随 着 体 系 中 Ｓ６ ＤＮＡ 浓 度 的 逐 渐 增 加，两 个 振 动 带 的 裂 分 逐 渐 明 显，同时 ＴＭＰｙＰ４ 的荧光迅速淬灭．由于分子所处 的环境发生变化，通 常 会 导 致 荧 光 光 谱 的 形 状 发 生 改 变 ．例 如 ：由 极 性 溶 剂 到 非 极 性 溶 剂 的 变 化 ，由 亲 水性环境到疏水性 环 境 的 改 变，都 可 能 使 化 合 物 的 荧光峰出现明 显 裂 分 的 现 象．因 此，这 里 卟 啉 荧 光 光谱的裂分 显 然 是 由 于 和 ＤＮＡ 结 合 后，卟 啉 分 子 所处的环境从水溶液变 为 ＤＮＡ 的 疏 水 性 环 境 引 起 的．而卟啉荧光 强 度 的 淬 灭，是 由 于 发 生 了 由 卟 啉 的激发单重态向 ＤＮＡ 分子 中 鸟 嘌 呤 碱 基 的 电 荷 转 移 反 应［９］．ＣＤ 谱、稳 态 吸 收 光 谱 结 果 都 表 明 ＴＭＰｙＰ４与 单 链 Ｓ６ ＤＮＡ 的 相 互 作 用 没 有 导 致 ＤＮＡ 的 结 构 发 生 明 显 变 化，但 是 二 者 间 的 结 合 对 ＴＭＰｙＰ４ 的 荧 光 性 质 影 响 很 大 ．为 了 进 一 步 研 究 结 合机理，作 者 借 助 了 时 间 分 辨 荧 光 光 谱 进 行 深 入 研究．
构型发生 明 显 变 化．而 ＴＭＰｙＰ４ 由 于 不 含 不 对 称 碳原子，其本身没有 ＣＤ 谱 信 号，随 着 ＤＮＡ 的 逐 渐 加入，在４３５ｎｍ 处 出 现 较 弱 的 诱 导 ＣＤ 谱 信 号，表 明 ＴＭＰｙＰ４与 ＤＮＡ 发生 了 相 互 作 用，二 者 之 间 近 距离的接触使处在 ＤＮＡ 不 对 称 环 境 中 的 卟 啉 分 子 出现了诱导 ＣＤ 谱信号．
Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｍｅｓｏ－Ｔｅｔｒａｋｉｓ（４－ （Ｎ－Ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｕｍｙｌ）） Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ＴＭＰｙＰ４ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ ５’－ＴＴＡＧＧＧ－３’
ＺＨＡＮＧ Ｈｕｉ－ｊｕａｎ１， ＣＨＥＮ Ｘｕ－ｋｕｎ１， ＰＡＮＧ Ｓｉ－ｐｉｎｇ２
收 稿 日 期 ：２００９－０９－０７ 基 金 项 目 ：国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 （２０９０３０１１，２０７７２０１１） 作 者 简 介 ：张 慧 娟 （１９７６— ）女 ，博 士 ，副 教 授 ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｊｚｈａｎｇ＠ｉｃｃａｓ．ａｃ．ｃｎ．
１３６６
北京理工大学学报
得到 Ｈ 最大值为３１％．进一步对４２２ｎｍ 处的数据
进行式（２）所示 Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析 ， ［７，１２］
ｒ／Ｃｆ ＝ｋｉ（ｎ－ｒ）．
（２）
式中：ｋｉ 为 结 合 常 数；ｎ 为 结 合 位 点 数 目．线 性 拟 合
第 １１ 期
张慧娟等：卟啉衍生物 ＴＭＰｙＰ４与单链 ＤＮＡ 的结合机理研究
化，例 如 钾 离 子、钠 离 子 浓 度 的 改 变，ｐＨ 值 的 变 化 等［５－６］，使得癌细胞内能 否 形 成 Ｇ４ 结 构 还 是 悬 而 未 决．基于此，开展药物与端粒 ＤＮＡ 单链之间的相互 作用研究有着重要的意义．
卟啉类衍生物是一类在肿瘤治疗领域倍受人们 关注的药物分 子．为 了 研 究 抗 肿 瘤 机 理，科 学 家 们 广泛开展了卟啉衍生物 与 各 种 不 同 结 构 的 ＤＮＡ 分 子 如 碱 基、双 链 和 四 链 体 等 识 别 作 用 的 研 究 ． ［７－１０］ 然而，卟啉衍 生 物 与 单 链 ＤＮＡ 的 相 互 作 用 这 一 重
（１．北京理工大学 生命学院，北京 １０００８１；２．北京理工大学 材料学院，北京 １０００８１）
摘 要：通过圆二色谱、稳态 吸 收 光 谱、稳 态 荧 光 光 谱 和 皮 秒 时 间 分 辩 荧 光 光 谱 研 究 了 ｍｅｓｏ－四 （４－（Ｎ－甲 基 吡 啶 基））卟啉（ＴＭＰｙＰ４）与端粒 ＤＮＡ ５′－ＴＴＡＧＧＧ－３′（Ｓ６）的 结 合 机 理．稳 态 光 谱 实 验 结 果 表 明，在 没 有 金 属 离 子 的 Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲溶液中，Ｓ６ＤＮＡ 以单 链 的 形 式 存 在 ，ＴＭＰｙＰ４ 与 单 链 ＤＮＡ 的 结 合 常 数 为 １．５１×１０６（ｍｏｌ／Ｌ）－１，饱 和结合数为１．２．通过时间分辨荧光光谱 对 二 者 相 互 作 用 的 机 理 进 行 了 进 一 步 研 究，推 测 了 ＴＭＰｙＰ４ 与 单 链 Ｓ６ ＤＮＡ 之间的结合模式． 关键词：ＴＭＰｙＰ４；单链 ＤＮＡ；光谱学手段；结合机理 中 图 分 类 号 ：Ｑ ６７ 文 献 标 志 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１００１－０６４５（２０１０）１１－１３６５－０５
实验中使用 的 ｍｅｓｏ－四 （４－（Ｎ－甲 基 吡 啶 基 ））卟 啉 ＴＭＰｙＰ４参照文献［１１］合成．单链 ＤＮＡ 购自上 海英骏生物技术有限公司北 京 分 公 司，经 ＰＡＧＥ 纯 化，纯度＞９９％．其序列为 ５′－ＴＴＡＧＧＧ－３′（Ｓ６），其 浓度以单链 Ｓ６ＤＮＡ 作为一个结构单元来计算．实 验中所用缓冲 液 为 １０ ｍｍｏｌ·Ｌ－１的 Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ
＝７．２．
２ 结果与讨论
２．１ 圆 二 色 谱 图１（ａ）给 出 了 Ｓ６ＤＮＡ 在 没 有 任 何 金 属 离 子
的缓冲溶液中的 ＣＤ 谱信号，在２５６ｎｍ 处有一个正 峰，同时在２３８和２８２ｎｍ 处 有 两 个 负 峰，该 信 号 与 文献［９］报道的 单 链 ＤＮＡ ５′－（ＴＡＧＧＧ）４－３′结 果 一 致，这里将其 归 属 为 单 链 ＤＮＡ 在 溶 液 中 自 由 卷 曲 形成的碱 基 堆 积 信 号．固 定 ＴＭＰｙＰ４ 的 浓 度 （５．１ ×１０－６ ｍｏｌ·Ｌ－１），向体系 中 逐 渐 滴 加 Ｓ６ＤＮＡ，得 到的 ＣＤ 谱信号见图１（ｂ）（ＤＮＡ 的浓度增加如图中 箭头方向所示，下同）．作 者 发 现 图 中 单 链 ＤＮＡ 自 由状态的信号没有 变 化，只 是 随 着 浓 度 的 增 加 逐 渐 增强．这表明 ＴＭＰｙＰ４ 的 存 在 没 有 引 起 单 链 ＤＮＡ
而且在４３１ｎｍ 处出现了一个明显的等吸收点，表明
结合 过 程 中 ＴＭＰｙＰ４ 对 应 着 较 为 简 单 的 从 非 结 合
态向结合态之间的 变 化．根 据 Ｓｏ 计 算 式
Ｈ ＝ （Ａｆｒｅｅ －Ａｂｏｕｎｄ）／Ａｆｒｅｅ ×１００％， （１）
端粒 ＤＮＡ 是位于染色 体 末 端 的 一 段 富 含 鸟 嘌 呤 的 序 列 ，它 由 一 段 双 链 部 分 和 一 段 单 链 部 分 组 成 ． 富含鸟嘌呤的单链端粒 ＤＮＡ 有 潜 在 的 形 成 鸟 嘌 呤 四链体（Ｇ４）结 构 的 能 力［１］，而 Ｇ４ 结 构 的 形 成 与 稳 定能够 抑 制 端 粒 酶 的 活 性，进 而 抑 制 癌 细 胞 的 增 殖［２］．因此，药物小分 子 对 ＤＮＡ Ｇ４ 结 构 的 识 别 及 稳定作用被广为报道［３－４］．但 是，目 前 还 没 有 人 体 细 胞内能够形成 Ｇ４结构的直接证据．在癌变细胞中， 由于 ＤＮＡ 所处的微环境与 正 常 细 胞 相 比 发 生 了 变
图１ ＣＤ 谱 Ｆｉｇ．１ ＣＤ ｓｐｅｃｔｒａ
２．２ 稳 态 吸 收 光 谱
在没 有 金 属 离 子 存 在 的 缓 冲 溶 液 中，以 Ｓ６
ＤＮＡ 滴 定 ＴＭＰｙＰ４（５．８×１０－６ ｍｏｌ· Ｌ－１ ），从
图２（ａ）给出的 吸 收 光 谱 结 果 可 以 看 出，Ｓｏｒｅｔ吸 收
带从４２２ｎｍ 红移至４３２ｎｍ，发生了１０ｎｍ 的红移，
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｍｅｓｏ－ｔｅｔｒａｋｉｓ （４－（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｕｍｙｌ））ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ （ＴＭＰｙＰ４）ａｎｄ ｔｈｅ ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＤＮＡ ５′－ＴＴＡＧＧＧ－３′（Ｓ６）ｈａｓ ｂｅｅｎ ｅｘｐｌｏｒｅｄ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒｕｍ，ｓｔｅａｄｙ－ｓｔａｔｅ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ，ｓｔｅａｄｙ－ｓｔａｔｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｉｃｏｓｅｃｏｎｄ ｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍｓ．ＤＮＡ ａｄｏｐｔｓ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｎｙ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ．Ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｎｕｍｂｅｒ ｂｅｔｗｅｅｎ ＴＭＰｙＰ４ａｎｄ Ｓ６ＤＮＡ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｓ １．５１×１０６（ｍｏｌ／Ｌ）－１ ａｎｄ １．２，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｓｔｅａｄｙ－ｓｔａｔｅ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ． Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ， ｏｎ ｔｈｅ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｓ ｃａｎ ｂｅ ｐｒｅｓｕｍｅｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＴＭＰｙＰ４；ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ；ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ；ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ