分子机制-核酸检测-DNase I足迹分析

DNase I（RNase Free）使 用 说 明 书TaKaRa Code： D2215包 装：DNase I（RNase Free；5 U/μl） 1,000 Units10×DNase I Buffer 1 ml保 存： -20℃●制品说明本酶是将单链或双链DNA同等程度的随机分解，生成具有5′-P末端寡核苷酸的脱氧核糖核酸内切酶。

在Mg2+存在时，能在双链DNA上随机地产生切口；而在Mn2+存在下能将双链DNA同时切断，使DNA片段化。

由于DNase I（RNase Free）酶几乎完全除去了Protease及RNase，从而提高了在pH中性区域的稳定性，可以安全地用于RNA的制取。

●酶贮存溶液Tris-HCl（pH7.5 at 4℃） 20 mMNaCl 50 mMCaCl2 0.1 mMGlycerol 50 %●起 源：Bovine pancreas。

●活性定义以小牛胸腺DNA为底物，在25℃、pH5.0的条件为下，1分钟内使反应液的260 nm吸光度增加0.001所需要的酶量定义为1个活性单位（Kunitz Unit）。

●纯 度10 U的本酶和1μg的16S，23S rRNA在37℃、pH7.5的条件下反应4小时，RNA的电泳谱带不发生变化。

●用 途1）用T7或SP6 RNA Polymerase进行体外转录（In vitro transcription）时，合成RNA后，不必 更换Buffer，使用DNase I（RNase Free）即可将模板DNA降解。

2） 与DNA Polymerase I一起用于切口平移（Nick translation）。

3） 在Mn2+存在的条件下，为鸟枪法测序（Shot gun sequencing）制作DNA文库。

4） 用于足迹法（Foot printing）分析DNA-蛋白质相互作用。

●添附Buffer组成（保存：-20℃）10×DNase I BufferTris–HCl（pH7.5） 400 mMMgCl280 mMDTT 50 mM●使用例除去RNA中的基因组DNA1. 在微量离心管中配制下列反应液，全量50μl。

某理工大学《现代分子生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、分析题（5分，每题5分）1. 写出原核表达实验步骤。

答案：原核表达实验步骤如下：（1）按上述步骤提取该组织的RNA，反转录为cDNA。

（2）以cDNA为模板，用上述引物扩增出带酶切位点的A基因片段。

（3）用BamHI和EcoRI分别切割目的片段和载体，连接酶将A 基因和载体连接起来构成重组质粒。

（4）将重组质粒转入感受态的大肠杆菌BL21中，涂布，根据载体所携带的抗性标记筛选出稳定遗传重组质粒的单克隆。

（5）摇菌、扩大培养，待菌液生长到对数生长期，收集菌体，裂解、收集蛋白质。

（6）将总蛋白制备成溶液通过镍柱，由于A蛋白携带有His标签，可以被吸附在镍柱上，然后加缓冲液将吸附在镍柱上的A蛋白洗脱下来，即可得到A蛋白溶液。

解析：2、判断题（80分，每题5分）1. 动物细胞中线粒体有自己的基因组，其编码基因可以在线粒体中完成转录和翻译过程。

（）答案：错误解析：2. B型双螺旋是DNA的普遍构型，而Z型则被确定为仅存在于某些低等真核细胞中。

（）答案：错误解析：B型双螺旋是DNA的普遍构型，而Z型在高等真核生物中也有发现，往往与基因表达调控有关。

3. 细胞内DNA复制后的错配修复不需要消耗能量。

（）答案：错误解析：细胞内DNA复制后的错配修复需要水解ATP提供能量。

4. 一个基因就是一个转录单位。

（）答案：错误解析：转录单位是一段可被 RNA聚合酶转录成一条连续的mRNA的DNA，包括转录起始和终止信号。

转录单位不同于基因，转录单位可能同时包含一个基因，也可能同时包含几个基因，另外，转录单位还包含启动子，非编码序列等。

所以，转录单位包含的DNA范围比基因广。

5. tRNA转录后加工有剪接反应，它是由蛋白质催化的。

武汉大学2001年攻读硕士学位研究生入学考试试题一、解释概念(20分,每个4分)1.Satellite DNA-卫星DNA,又称串联重复序列，由2~6个核苷酸组成的重复单位组成的串联重复。

2.Replisome-复制体,是指由多种复制相关蛋白组成的复合物。

3.逆转座子，指另一类能够通过逆转酶和整合酶共同作用介导转座的转座子4.反式激活因子，一类能结合到顺式作用元件上形式激活作用的蛋白质5.衰减子，原核生物操纵子上一段能够显著减弱或终止转录作用的核苷酸序列衰减作用，指原核生物中根据底物浓度变化来调控基因转录进程的中断与否的一种调控机制。

三、问答题(50分)1.说出双链DNA复制起始有关的五种重要的酶或蛋白并简述它们的功能。

(15分)2.简述增强子的特点和性质及作用机制。

(10分)3.简述真核RNA聚合酶II的转录起始复合物装配过程和转录起始(15分)4.DNA限制性内切酶EcoRI是人们熟悉的常用内切酶,它是在大肠杆菌(E.coli)R株中发现的,它被广泛用于分子克隆操作和DNA分析。

pUC质粒是常用克隆载体之一,它的多克隆位点上有EcoRI、BamHI、KpnI、HindIII等酶切点。

假如要你把一段由EcoRI切割产生的外源DNA段克隆到pUC质粒中,并把重组质粒转化大肠杆菌R株来扩增,已知条件是所用的R 菌株中只有EcoRI一种限制性内切酶,你设计如何做才能确保成功?为什么?(10分)武汉大学2002年攻读硕士学位研究生入学考试试题三、问答:1、简述(或绘图说明)真核细胞RNA聚合酶II转录的起始需要哪些基本转录因子及其装配过程(15分)2、简述(或绘图说明)色氨酸操纵子弱化的机制(15分)3、在讨论基因家庭时经常提到胚胎、胎儿和成体形成的蛋白质,这些述语是指什么现象?可用什么术语来描述这一类基因家族(5分)4、你正在进行Southern blot分析,并刚刚完成凝胶电泳部分,下一步是将胶浸泡在NaOH溶液中使DNA变性为单链,为了节约时间,你跳过这一步,直接把DNA从胶上转到硝酸纤维素膜上,你将标记好的探针与膜杂交,却发现放射自显影结果是一片空白,哪里错了呢?(5分)武汉大学2003年攻读硕士学位研究生入学考试试题一、名词翻译,并简要解释(共10小题,每题4分,共40分)1.Domains and motifs结构域和结构基序，分别指的是反式作用因子中与蛋白质和DNA分子相互作用的两种蛋白质亚基。

Chapter I Introduction1)什么是基因？基因有哪些主要特点?基因是一段可以编码具有某种生物学功能物质的核苷酸序列。

①不同基因具有相同的物质基础。

②基因是可以切割的。

③基因是可以转移的。

④多肽与基因之间存在对应关系.⑤遗传密码是通用的.⑥基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。

2)翻译并解释下列名词genetic engineering遗传工程gene engineering基因工程：通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物获得新的遗传性状的操作。

gene manipulation基因操作：对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称.recombinant DNA technique重组DNA技术gene cloning基因克隆：是指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，其目的在于获得大量的基因拷贝，在技术上主要包括载体构建、大肠杆菌遗传转化、重组子筛选和扩大繁殖等环节。

molecular cloning分子克隆3)什么是基因工程？简述基因工程的基本过程？p2 p44)简述基因工程研究的主要内容?p55)简述基因工程诞生理论基础p2和技术准备有哪些p3？6)基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同？为什么？否，密码子简并性7)举例说明基因工程技术在医学、农业、工业等领域的应用。

医学:人胰岛素和疫苗农业:抗虫BT农药工业：工程酿酒酵母Chapter ⅡThe tools of trade1)什么是限制性核酸内切酶?简述其主要类型和特点？是一种核酸水解酶,主要从细菌中分离得到.类型特点p112)II型核酸内切酶的基本特点有哪些p12—14？简述影响核酸内切酶活性的因素有哪些p14？3)解释限制酶的信号活性？抑制星号活性的方法有哪些？4)什么是DNA连接酶p15？有哪几类p16?有何不同p16？5)什么叫同尾酶、同裂酶p12?在基因工程中有何应用价值？同裂酶：识别位点、切割位点均相同，来源不同.在载体构建方面往往可以取得巧妙的应用.应用较多的同裂酶比如Sma1和Xma1，它们均识别CCCGGG，但前者切后产生钝同尾酶：来源各异，识别序列各不相同，但切割后产生相同的粘性末端。

编号：2-6主题：DNase I足迹试验概述：DNase I足迹法于1978年引入科研领域，其原理与DNA的化学测序法相似，首先将待测双链DNA片段中一条链的一端选择性地进行标记，然后加入适当浓度的DNaseI，使在DNA链上形成缺口，经过变性后电泳分离，放射自显影，即形成以相差一个核苷酸为梯度的DNA条带。

但当DNA片段与相应的序列特异性DNA结合蛋白结合后，DNA结合蛋白可保护相应的DNA序列不受DNase I 的攻击，因此在放射自显影图谱上，DNA梯度条带在相应的DNA结合蛋白的结合区域中断，从而形成一空白区域，恰似蛋白质在DNA上留下的足迹，因而被形象地称作足迹法。

如果同时进行DNA化学测序，即可判断出结合序列的精确顺序，该技术至今仍然是最常用的方法，但是在实际应用中，首先应将序列特异蛋白进行一定程度的纯化，如硫酸铵分步沉淀，离子交换层析，凝胶过滤层析等，否则很难得到满意的结果。

因此在该足迹法的基础上又发展了固相DNaseI足迹法，它具有如下优点： (1)采用生物素进行末端标记，避免放射性同位素的掺人，减少危害; (2)省略了有机抽提、沉淀等蛋白纯化步骤，操作简便，效率高; (3)使用范围广，可适用于未经纯化的核蛋白粗提物内特异性DNA结合蛋白的研究。

DNase I足迹法常与EMSA法结合共同用于体外DNA-蛋白质相互作用的鉴定，但二者的侧重点不同. EMSA主要用于与特异性DNA结合的目标蛋白的检测，而DNase I足迹法在此基础上进一步证明了DNA元件和目标蛋白的特异结合，并能告知与该蛋白结合的相应DNA元件序列。

目的：鉴别RNA聚合酶等蛋白质在DNA上的结合位点，找到与特异性DNA结合的目标蛋白，而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位。

原理：将含有特定顺式元件的双链DNA片段进行单链单末端标记，与初步纯化的DNA结合蛋白在体外行结合作用，然后加入DNase I对DNA-蛋白质复合物进行随机切割，产生一系列不同长度的DNA片段，其相邻片段只相差一个核苷酸。

分⼦机制-核酸检测-DNaseI⾜迹分析主题：DNase I⾜迹试验概述：DNase I⾜迹法于1978年引⼊科研领域，其原理与DNA的化学测序法相似，⾸先将待测双链DNA⽚段中⼀条链的⼀端选择性地进⾏标记，然后加⼊适当浓度的DNaseI，使在DNA链上形成缺⼝，经过变性后电泳分离，放射⾃显影，即形成以相差⼀个核苷酸为梯度的DNA条带。

但当DNA⽚段与相应的序列特异性DNA结合蛋⽩结合后，DNA结合蛋⽩可保护相应的DNA序列不受DNase I 的攻击，因此在放射⾃显影图谱上，DNA梯度条带在相应的DNA结合蛋⽩的结合区域中断，从⽽形成⼀空⽩区域，恰似蛋⽩质在DNA上留下的⾜迹，因⽽被形象地称作⾜迹法。

如果同时进⾏DNA化学测序，即可判断出结合序列的精确顺序，该技术⾄今仍然是最常⽤的⽅法，但是在实际应⽤中，⾸先应将序列特异蛋⽩进⾏⼀定程度的纯化，如硫酸铵分步沉淀，离⼦交换层析，凝胶过滤层析等，否则很难得到满意的结果。

因此在该⾜迹法的基础上⼜发展了固相DNaseI⾜迹法，它具有如下优点： (1)采⽤⽣物素进⾏末端标记，避免放射性同位素的掺⼈，减少危害; (2)省略了有机抽提、沉淀等蛋⽩纯化步骤，操作简便，效率⾼; (3)使⽤范围⼴，可适⽤于未经纯化的核蛋⽩粗提物内特异性DNA结合蛋⽩的研究。

DNase I⾜迹法常与EMSA法结合共同⽤于体外DNA-蛋⽩质相互作⽤的鉴定，但⼆者的侧重点不同. EMSA主要⽤于与特异性DNA结合的⽬标蛋⽩的检测，⽽DNase I⾜迹法在此基础上进⼀步证明了DNA元件和⽬标蛋⽩的特异结合，并能告知与该蛋⽩结合的相应DNA元件序列。

⽬的：鉴别RNA聚合酶等蛋⽩质在DNA上的结合位点，找到与特异性DNA结合的⽬标蛋⽩，⽽且能告知⽬标蛋⽩结合在哪些碱基部位。

原理：将含有特定顺式元件的双链DNA⽚段进⾏单链单末端标记，与初步纯化的DNA结合蛋⽩在体外⾏结合作⽤，然后加⼊DNase I 对DNA-蛋⽩质复合物进⾏随机切割，产⽣⼀系列不同长度的DNA⽚段，其相邻⽚段只相差⼀个核苷酸。

生物医学工程1202班林可慧研究DNA-蛋白质相互作用的实验方法主要包括：一、DNase 1 足迹实验二、甲基化干扰实验三、凝胶阻滞实验四、体内足迹实验五、拉下实验一、DNase 1足迹实验1、概念:足迹实验（foot-printing assay），是一种用来检测被特定转录因子蛋白质特异性结合的DNA 序列的位置及其核苷酸序列结构的专门实验方法。

2、原理：当DNA分子中的某一区段同特异的转录因子结合之后便可以得到保护而免受DNaseI 酶的切割作用，而不会产生出相应的切割分子，结果在凝胶电泳放射性自显影图片上便出现了一个空白区，俗称为“足迹”。

3过程：(1).将待检测的双链DNA分子在体外用32P作5‘末端标记，并用适当的限制性内切酶切出其中的一个末端，于是便得到了一条单链末端标记的双链DNA(2).在体外同细胞蛋白质提取物（细胞核提取物也可以）混合，形成DNA-蛋白质复合体(3).在反应混合物中加入少量的DNase I,并控制用量使之达到平均每条DNA链，只发生一次磷酸二酯键的断裂：a、如果蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特定蛋白质，使DNase I消化之后，便会产生出距离放射性标记末端1个核苷酸，2个核苷酸，3个核苷酸------等等一系列前后长度均相差一个核苷酸的不间断的连续的DNA片段梯度群体；b、如果DNA分子同蛋白质提取物中的某种转录因子结合，被结合部位的DNA就可以得到保护免受DNase I酶的降解作用；(4).除去蛋白，加样在20%序列胶上进行电泳分离，实验分两组:a、实验组：DNA+蛋白质混合物b、对照组：只有DNA，未与蛋白质提取物进行温育(5).最后进行放射性自显影，分析实验结果。

4、结果判断:实验组凝胶电泳显示的序列，出现空白的区域表明是转录因子蛋白质结合部；与对照组序列比较，便可以得出蛋白质结合部位的DNA区段相应的核苷酸序列。

5、其他的足迹实验方法：除了DNase1足迹试验之外，目前还发展出了若干种其他类型的足迹实验，例如：a、自由羟基足迹实验；b、菲咯啉铜足迹实验；c、DMS(硫酸二甲酯)足迹实验DMS(硫酸二甲酯)足迹实验的原理DMS能够使DNA分子中裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶又会对甲基化的G 残基作特异性的化学切割。