盐碱法提取酵母核酸的工艺研究

实验三酵母核糖核酸的提取及测定—预习报告一、研究背景生物大分子物质通常是指动物植物微生物进行新陈代谢时所产生的蛋白质和核酸等有机化合物。

它不仅是生物科学工作者研究者的重要对象，且与化学、医学和食品等工业部门有密切关系。

在科研和医学方面，探讨结构与功能、防治某些疾病时常需要较纯的生物大分子物质。

然而这类物质往往与自然界存在的各种不同的化合物结合在一起或自身之间相互结合在一起，离体后稳定性较差，含量偏低，且提取的材料复杂，因此纯化的方法也很多。

微生物是工业上大量生产核酸的原料，其中酵母最为理想。

本次实验以干酵母粉为实验材料，提取RNA，并测定其含量。

二、研究目标掌握核酸分离纯化的基本设计思想及主要操作细节和生物制品开发的基本思路。

三、研究策略酵母细胞中RNA通常与蛋白质结合。

要提取RNA就要破细胞壁，让它释放出来。

浓盐法通过改变细胞膜的通透性释放出胞内物质，然后沸水浴使RNA水解酶失活。

再通过调节pH将RNA充分沉淀，洗涤，干燥，测量。

四、研究方案及可行性分析浓盐法是在加热条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的通透性，使RNA释放出来。

提取RNA时需注意掌握温度，直接在90~100℃浸提，避免在20~70℃之间的时间过长，磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用活跃的温度范围，会使RNA因降解而降低提取率。

洗涤沉淀时要反复抽提，离心以纯化RNA。

测定提取的核酸含量，只需测定组成核苷酸的任意一种组分即可。

碱基在260nm有光吸收，采用紫外吸收法可测定核酸含量。

五、具体实验设计1、所需主要材料：食品用干酵母粉；试剂：10%NaCl, 6MHCl , 95%乙醇，2%氨水，RNA沉淀剂（0.5g钼酸铵+193ml水+7ml70%过氯酸）；仪器设备：烘箱，离心机，天平，紫外分光光度计，移液器，恒温水浴锅，玻璃匀浆器，pH计。

主要器皿：研钵，离心管，容量瓶25ml 50ml；具塞试管；三角瓶；小烧杯。

2、具体操作步骤1.提取：称取7g酵母粉，于研钵中小心研磨成面粉状粉末，转移至三角瓶。

实验三酵母RNA的提制（浓盐法）一、目的学习和掌握从酵母中提制RNA的原理和方法，以加深对核酸性质的认识。

二、原理酵母含RNA 2.67％～10.0％，DNA很少（0.03％～0.516％），而且菌体容易收集，RNA 也易于分离，所以选用酵母为实验材料。

RNA提制过程是先使RNA从细胞中释放，并使它和蛋白质分离，然后将菌体除去。

再根据核酸在等电点时溶解度最小的性质，将pH调至2.0～2.5，使RNA沉淀，进行离心收集。

提取RNA的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。

前者利用稀碱溶解细胞壁，使RNA释放出来，这种方法提取时间短，但RNA在此条件下不稳定，容易分解；后者在加热的条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的透性，使RNA释放出来，此法易掌握，产品颜色较好。

三、仪器、试剂和材料1．仪器（1）量筒（50ml）（2）三角瓶（100ml）（3）烧杯（250ml，50ml，10ml）（4）布氏漏斗（40mm）（5）吸滤瓶（125ml）（6）表面皿（6cm）（7）751型分光光度计（8）离心机（4000r／min）（9）恒温水浴（10）药物天平（11）烘箱2．试剂（l）NaCl（化学纯）（2）6mol／L HCI（3）95％乙醇（化学纯）3．材料鲜酵母或干酵母；pHO.5～5.0的精密试纸。

四、操作步骤1．提取称取鲜酵母159或干酵母粉 2.5g，倒入100ml三角瓶中，加NaCl 2.5g，水25ml，搅拌均匀，置于沸水浴中提取lh。

2．分离将上述提取液用自来水冷却后，装入大离心管内，以4000r／min离心10min，使提取液与菌体残渣等分离。

3．沉淀RNA将离心得到的上清液倾于50ml烧杯内，并置入放有冰块的250ml烧杯中冷却．待冷至10℃以下时，用6mol／L HCI 小心地调节pH值至2.0～2.5（注意严格控制pH）。

调好后继续于冰水中静置10min，使沉淀充分，颗粒变大。

4．洗涤和抽滤上述悬浮液以4000r／min离心10min，得到RNA沉淀。

一、实验目的1. 掌握稀碱法分离酵母RNA的原理与操作过程。

2. 了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体方法。

二、实验原理酵母核酸中RNA含量较多，DNA含量则少于2%。

RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，有此可得粗RNA制品。

用碱液提取的RNA有不同程度的降解。

三、实验材料与试剂1. 实验材料：2g干酵母粉。

2. 试剂：0.04M NaOH溶液、石英砂、乙酸、95%乙醇、RNA酶抑制剂、DEPC水、RNA提取试剂盒、电泳试剂盒、凝胶成像系统等。

四、实验步骤1. RNA的提取（1）称取2g干酵母粉于研钵中，加入石英砂研磨。

（2）将研磨好的酵母粉转移至2mL离心管中，加入0.04M NaOH溶液1mL，沸水浴加热30分钟，经常搅拌。

（3）将加热后的离心管冷却至室温，加入乙酸数滴，使溶液pH值约为5.0。

（4）加入95%乙醇1mL，混匀，室温静置10分钟。

（5）将离心管置于4℃冰箱中，以12,000r/min离心10分钟。

（6）弃去上清液，加入DEPC水500μL，溶解RNA沉淀。

2. RNA组分鉴定（1）取50μL提取的RNA溶液，加入1μL RNA酶抑制剂，混匀。

（2）取5μL上述溶液，加入5μL电泳缓冲液，混匀。

（3）将混合液加入1%琼脂糖凝胶中，进行电泳。

（4）用凝胶成像系统观察电泳结果，鉴定RNA组分。

五、实验结果与分析1. 电泳结果显示，提取的RNA呈特征性条带，表明RNA提取成功。

2. 通过对RNA组分进行鉴定，发现提取的RNA主要由rRNA、mRNA和tRNA组成，符合酵母RNA的组分特点。

六、实验结论通过本实验，我们成功掌握了稀碱法分离酵母RNA的原理与操作过程，并了解了RNA的组分。

实验结果表明，提取的RNA成分符合酵母RNA的组分特点，说明实验操作正确。

七、实验讨论1. 在RNA提取过程中，注意防止RNA酶的污染，避免RNA降解。

2. 在实验操作过程中，严格控制pH值和温度，以保证RNA提取的纯度和完整性。

生物化学实验报告实验三酵母核糖核酸的提取及测定一、研究背景及目的RNA（核糖核酸）属酸性高分子化合物，是遗传信息的载体，由数量不等的核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成。

由于RNA在细胞内能够行使各种各样的生物功能，参与蛋白质生物合成、调控基因表达、作为核酶催化生化反应活性等，对维持生物体的正常发育有着重要作用。

RNA制剂是以RNA及其衍生物为材料，经加工制成的产品，主要包括从富含RNA 的生物体中的提取物、自溶物或者降解产物加工制成的各种商品。

核糖核苷酸与其衍生物作为一大类RNA制剂，在生物体内有着诸多的功能，例如：ATP是细胞内的能量通用货币，cAMP作为第二信使传递胞外信号，CoⅠ、CoⅡ、CoA、FAD作为酶的辅因子在催化反应中起重要作用，UDP等作为单糖载体在糖代谢中起着重要作用等。

此外，鸟苷酸（GMP）和肌苷酸（IMP）是强力助鲜剂，胞苷酸（CMP）和尿苷酸（UMP）可作为生产治疗癌症、肝炎及冠心病等药物的原料；在化妆品中加入核酸或其水解物，可促进皮肤蛋白合成，达到养护皮肤的作用；在农业上，RNA降解物具有促进作物生长增产的作用，因此RNA制剂被广泛应用于医药、食品、农业、日化、环境保护等各产业，具有广阔的商业前景，形成了一大新兴产业。

[1]可见，无论是科研工作还是商业产品的生产过程，都需要大量的纯品RNA作为原料。

但是RNA的活化能较高，不易直接合成，而天然材料中的RNA往往与细胞内的其他化合物混在一起，故采用廉价、合适的手段分离纯化得到RNA就显得至关重要。

目前，人们已经摸索出来了多种多样的方法，这些方法各有特点，但其基本的思路和程序大致相似，基本战略也是有规律可循的。

本实验中，我们需要了解RNA制剂开发应用的前景和基本思路，掌握RNA分离纯化的设计思想及主要的操作细节，并以酵母为材料学习RNA提取和测定的基本操作方法。

二、原理1.选材即选取富含RNA的生物材料，微生物由于其原料的易获得性被广泛应用于工业上大量生产RNA的原料，本实验中我们以食品用干酵母粉直接作为RNA提取的原料。

实验项目名称酵母RNA的提取与测定一、实验目的1.了解并掌握稀碱法提取 RNA。

2.学习地衣酚显色法测定RNA含量的基本原理和具体方法。

二、实验原理1. 细胞内大部分RNA均与蛋白质结合在一起，并且多以核蛋白的形式存在。

因此，分离制备RNA时，首先遇到的是必须使RNA与蛋白解离，并除去蛋白质。

2. 由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异。

一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。

其中苯酚法又是实验室最常用的。

组织匀桨用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层加人乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀出，此法能较好地除去DNA和蛋白质。

上述方法提取的RNA具有生物活性。

工业上常用碱法和浓盐法提取RNA，用这2种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核酸的原料，其工艺比较简单。

浓盐法是用有10%左右氯化纳溶液，90℃提取3~4 h , 迅速冷却，提取液经离心后，上清液用乙醇沉淀 RNA。

稀碱法使用稀碱（本实验用0.2% NaOH 溶液）使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀 RNA 或调pH 2.5 利用等电点沉淀。

酵母含 RNA 达2.67~10.0%，而 DNA 含量仅为0.03 - 0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。

DNA和RNA都有吸收紫外线的性质，最大吸收峰在260 nm波长处。

紫外吸收是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的性质，所有含嘌呤和嘧啶的物质，都具有吸收紫外线的特性。

因此，RNA含量测定，可用紫外吸收法。

紫外吸收法具有操作简便、快速、灵敏度高、对被测样品无损、用量少等优点，适合于核酸分离纯化过程的检测。

该法对纯品核酸准确度高，但由于有紫外吸收的物质对测定有干扰，对不纯核酸样品误差较大。

若样品内混杂大量的蛋白质和核苷酸等吸收紫外线的物质，应设法事先除去。

3.细胞破碎方法-机械物理法：可以用研磨和组织捣碎法。

盐碱法提取酵母核酸的工艺研究缪存美;庄廷杰;王志江【摘要】对盐碱法提取酵母核酸进行了研究.结果表明,最佳提取条件为提取温度85℃,提取pH为7.5,NaCl的含量为6.5%,提取时间180 min,对酵母核酸的平均提取率达到5.70%.【期刊名称】《广东微量元素科学》【年(卷),期】2010(017)001【总页数】4页(P42-45)【关键词】酵母核酸;提取;工艺研究【作者】缪存美;庄廷杰;王志江【作者单位】浙江万里学院生物与环境学院,浙江,宁波,315100;浙江万里学院生物与环境学院,浙江,宁波,315100;浙江万里学院生物与环境学院,浙江,宁波,315100【正文语种】中文【中图分类】TQ254.13多年来,国内外许多学者对核酸酵母的其食用价值、药用价值、农业价值以及产品加工进行了大量的研究,并取得了不少成就[1-4]。

核酸酵母产业已是发酵工业的重要一部分。

当前在核酸提取方面,主要采用浓盐法和稀碱法[5-6]。

本实验采用盐碱法对酵母核酸的提取进行了比较细致的研究,旨在确定核酸提取的最佳工艺条件,为核酸酵母的开发提供理论依据。

菌种:啤酒酵母由浙江万里学院生物系提供。

酵母→水洗 2次→离心分离沉淀酵母→2倍体积的 0.5%的碳酸氢钠溶液洗涤→水洗 2次→干净酵母→真空干燥。

处理后的酵母呈乳白色、无杂味、无机械杂质。

取 10 g酵母配成 10%的酵母溶液,加入 10%的 NaCl均匀搅拌,用 0.05 mol/L NaOH调节pH 8.0,之后在90℃下抽提 3 h,离心分离,取上清液,调节 pH至 7.0,经酒精 (95%)沉淀获得核糖核酸,用水定容至 100 mL,取 1 mL稀释 50倍,调 pH至7.0分别测定吸光度值 A260和A280,并计算 A260/A280值。

核糖核酸在 260 nm处具有紫外吸收,且在 260 nm处1μg/mL核糖核酸的消光值为 0.024。

式中ρ(RNA)为核糖核酸质量浓度,单位为μg/mL;A260为波长 260 nm处的吸光度值;L为比色皿厚度 (1 cm);N为稀释倍数;0.024为1μg/mL RNA的 A260。