解读单克隆抗体制备过程中的两次筛选及考查例解

2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体【作业】一、选择题1.关于动物细胞融合的说法，不正确的是()A．动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程B．动物细胞融合后形成的具有原来两个或多个动物细胞遗传信息的单核细胞称为杂交细胞C．常用的诱导动物细胞融合的因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电激、紫外线照射D．细胞融合技术突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能解题分析A项为动物细胞融合的含义；B项是融合后细胞的特点；C项中紫外线照射常用于人工诱变，可诱发基因突变，而不是诱导细胞融合的因素，常用的诱导动物细胞融合的物理因素是离心、振动和电激；D项为动物细胞融合的意义。

答案 C2.动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是()A．诱导融合的方法完全相同B．所用的技术手段完全相同C．所采用的原理完全相同D．都能形成杂种细胞解题分析两种细胞工程所用的技术手段不完全相同，植物体细胞杂交时要先去除细胞壁后诱导原生质体融合，而动物细胞融合时，要先使细胞分散后再诱导细胞融合，B错误；诱导的方法，除动物细胞的融合常用灭活的病毒作诱导剂外，其他的二者基本相同，A错误；二者采用的原理不同，动物细胞融合的原理是细胞膜的流动性，最终形成的是杂交细胞，植物体细胞杂交还用到细胞的全能性，最终形成杂种植株，C错误。

答案 D3.动物细胞融合属于动物细胞工程的技术手段之一，下列有关动物细胞融合的叙述正确的是()A．动物细胞融合产生的细胞称为重组细胞B．融合后形成的细胞为单核或多核细胞C．常用的诱导融合的生物诱导剂是聚乙二醇、灭活的病毒等D．也称细胞杂交，可由两个或多个动物细胞结合成一个细胞答案 D解析动物细胞融合产生的细胞称为杂交细胞，核移植产生的细胞称为重组细胞，A错误；融合后形成具有两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，B错误；诱导动物细胞融合的生物诱导剂是灭活的病毒，聚乙二醇属于化学诱导剂，C错误；动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程，D正确。

单克隆抗体的第二次筛选原理今天来聊聊单克隆抗体的第二次筛选原理，这可真是个挺有趣的事儿呢。

我先给你讲个生活中的小现象吧，就好比我们从一群混杂着各种不同类型小珠子的盒子里，挑出某一种特定颜色和形状的珠子。

单克隆抗体制备的过程有点类似，不过这可比挑珠子复杂太多啦。

在单克隆抗体产生的过程中，我们先由骨髓瘤细胞和经过免疫的B淋巴细胞融合形成杂交瘤细胞。

这个时候就像是一个大杂烩，里面融合的细胞多种多样，有正常的B淋巴细胞之间的融合、骨髓瘤细胞之间的融合，还有没用的没融合的骨髓瘤细胞和B淋巴细胞呢。

这就像是混在一起的不同颜色、大小、材质的多种珠子一样。

于是就需要进行筛选啦。

第一次筛选是用特定的培养基，把没融合的骨髓瘤细胞和融合后细胞中那些不正常的淘汰掉，其实就是选出我们想要的包含杂交瘤细胞这个大概范围的“珠子”。

这就要说到第二次筛选了。

老实说，我一开始也不明白为什么已经筛选过一次了还需要第二次筛选呢？原因是这样的，在第一次筛选留下的杂交瘤细胞中，它们产生的抗体不一定都能完全符合我们的要求：不是所有的杂交瘤细胞都产生了那种我们想要的特异性很强的单克隆抗体。

就好比在一堆形状相近的珠子里，有的只是稍微有点相似，但不是完全一样。

打个比方吧，假如把我们要的能产生特定作用单克隆抗体的杂交瘤细胞想象成是出色的歌手，其他的杂交瘤细胞产生的抗体可能就像是那些只能偶尔唱出一两个高音或者根本走调的歌手。

第二次筛选就是要把那些真正出色的“歌手”找出来，也就是产生特异性抗体的杂交瘤细胞。

这个筛选方法呢，一般是通过克隆化培养和专一抗体检测阳性，找到那个能产生我们所需特异性抗体的单个杂交瘤细胞。

说到这里，你可能会问，那这个在实际生活中有啥用呢？作用可大啦。

在医学上治疗癌症方面，像赫赛汀是一种单克隆抗体药物。

它就是针对癌细胞表面的特定蛋白这种“坏蛋分子”产生作用的，就像精确制导的导弹一样，只打击癌细胞，而不会误伤正常细胞，这都得益于单克隆抗体特异性很强的这个特性，所以二次筛选准确选出能产生这种特异性抗体的细胞很关键。

单克隆抗体制备过程中经过两次筛选制备单克隆抗体的过程一般包括以下步骤：免疫原的制备、免疫小鼠、脾细胞融合、杂交瘤筛选和克隆、筛选单克隆杂交瘤、扩增和纯化单克隆抗体。

首先，免疫原的制备是制备单克隆抗体过程的第一步。

免疫原可以是纯化的蛋白质、多肽、细胞表面抗原等。

免疫原的选择和制备需要根据实验的目的和需求进行设计。

第二步是免疫小鼠。

免疫小鼠是制备单克隆抗体的常用动物模型。

通常选择BALB/c小鼠作为实验动物，并使用免疫佐剂增强免疫效果。

小鼠需要进行免疫，例如通过皮下注射、肌肉注射等途径将制备好的免疫原注射到小鼠体内。

第三步是脾细胞融合。

在获得免疫反应满意的小鼠后，需要从其脾脏中获得淋巴细胞。

将脾细胞与合适的骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。

融合的方法包括传统的体外融合和新型的凭借细胞融合特性的电融合等。

第四步是杂交瘤筛选和克隆。

将融合得到的细胞悬浮液进行稀释，使得每个孔中只存在一个细胞。

然后需要在含有细胞导入剂的选择培养基中培养杂交瘤细胞。

导入剂可以使得杂交瘤细胞在含有肿瘤抗原的培养基中进行生长，而非杂交瘤细胞则会死亡或生长缓慢。

通过这样的选择，可以筛选出产生特定单克隆抗体的杂交瘤细胞。

第五步是筛选单克隆杂交瘤。

通过酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法，筛选出产生特定抗原结合特异性的单克隆杂交瘤细胞。

这一步骤可以帮助确定那些产生目标抗原结合特异性抗体的杂交瘤细胞。

经过初步筛选和单克隆筛选之后，通常会得到一定量的单克隆抗体，然而这些抗体还需要经过进一步的扩增和纯化。

扩增单克隆抗体的过程涉及到培养大量的单克隆杂交瘤细胞，并进行培养和收集细胞上清液。

最后一步是纯化单克隆抗体。

通过蛋白质A/G亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等技术手段，将目标单克隆抗体从细胞上清液中纯化出来。

在整个制备单克隆抗体的过程中，经过两次筛选是确保获得特异性抗原结合能力的单克隆杂交瘤细胞的重要步骤。

只有通过这样的筛选过程，才能获得具有较高亲和力和特异性的单克隆抗体。

单克隆抗体制备过程中的两次筛选动物细胞工程中动物细胞融合的主要应用是制备单克隆抗体。

在单克隆抗体制备过程中，有两次筛选，这地方学生很容易弄混了。

第一次筛选的目的是筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选的目的是筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法并不相同。

第一次筛选：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。

普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。

其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。

在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。

另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。

因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。

对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。

惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。

第二次筛选：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。

单克隆抗体制备过程中经过两次筛选单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。

第一次筛选的原理与方法:细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。

普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A)和胸腺嘧啶核苷酸（T）。

其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径"），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。

在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”.另一条途径是应急途径或补救途径(“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可.因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S 途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力,一般10d左右会死亡.对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型(HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径",且“D 途径"又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。

惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞,既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT 培养液中选择性存活下来，并不断增殖。

第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞,因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HA T培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。

解读单克隆抗体制备过程中的两次筛选在单克隆抗体制备中两次提到筛选问题，那么两次筛选的目的和方法到底是什么。

关键词选择性培养基多孔培养板单克隆抗体制备过程中两次提到了筛选，对于两次筛选中的目的和方法许多人也存在疑惑，那么到底是如何筛选的呢？现总结如下：第一次筛选: 首先在（效应）B淋巴细胞和骨髓瘤细胞进行杂交时可能出现的情况应该先弄清楚，（一）可能的情况有：1 （效应）B淋巴细胞和（效应）B淋巴细胞的融合2 (效应）B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合（即杂交瘤细胞）3 骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞的融合（即瘤瘤细胞）4 单个骨髓瘤细胞5 单个（效应）B淋巴细胞（二）筛选的目的————获得杂交瘤细胞（三）筛选的方法用选择性培养基来完成，即HAT培养基。

含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶，其中氨基喋呤可阻断DNA合成的主要途径。

主要途径阻断后，依靠应急途径即在HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）和TK（胸苷激酶）作用下，利用胸腺嘧啶和次黄嘌呤合成DNA，缺少其中一种，DNA合成不能发生。

用于杂交的骨髓瘤细胞系均由经有毒药物诱导而成选择产生的代谢缺陷型细胞，细胞内均无TK或HGPRT，所以单个或融合骨髓瘤细胞在HAT培养液中将死亡。

B细胞虽然有HGPRT和TK，但在体外通常培养条件下，尤其是在单个细胞环境下难于长期存活和增殖传代。

因此只有杂交瘤细胞才能在HAT培养液中生长繁殖。

所以通过以上方法可以选择出杂交瘤细胞，但虽然都是杂交瘤细胞，但可能是同一抗原的不同抗原决定基刺激产生的。

所以产生抗体是不纯的。

如果不进一步提纯，这样得到的是多克隆抗体。

所以就有了第二次筛选。

第二次筛选要想获得单克隆抗体，所以必须得到由一个细胞分裂而成的一个细胞群，由这样的细胞群产生的抗体才是真正意义的单克隆抗体。

(一) 筛选的目的筛选只针对某一种特定的抗原决定簇产生抗体的杂交瘤细胞，即得到由一个细胞分裂而成的一个细胞群并且能产生所需抗体（二）筛选的方法1、分离单个细胞置入多孔培养板的每个孔中培养2、检测每孔细胞是否产生所注射抗原的抗体（即教材插图中提到的选出能产生特定抗体的细胞群）所以筛选的条件是两层意思：单个细胞单孔培养保证每个孔中的细胞在产生抗体时是针对同一抗原的同一抗原决定簇产生的的，但每个孔中细胞却不一定都能产生抗体，把那些不产生抗体的细胞淘汰，对能分泌针对抗原某一决定簇抗体的阳性细胞选择下来继续克隆，从而保证大量的生产所需抗体。

单克隆抗体制备知识点总结一、流程：二、说明：1、对小鼠的处理是：注射特定的抗原蛋白2、单克隆抗体制备过程中的三个“两”（1）诱导融合的两种细胞名称及作用：①骨髓瘤细胞；无限增殖②B淋巴细胞（效应B细胞、浆细胞）；产生特定抗体（2）两次筛选的目的及方法：①第一次：筛选出杂交瘤细胞；选择培养基②第二次：筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞；克隆化培养及专一抗体检测（3）培养杂交瘤细胞的两个场所：①体外培养：从培养液中提取（该方法缺点：设备复杂，要有严格的条件限制，产量低，成本高。

）②体内培养：从小鼠腹水中提取（最常用的方法）（4）单克隆抗体制备所用到的两种技术：动物细胞培养、动物细胞融合（5）两个原理：细胞增殖、细胞膜流动性3、动物细胞融合特有的方法是：灭活的病毒。

（融合率低，有一定局限性。

）4、第二次筛选出的杂交瘤细胞的特点：①无限增殖②产生所需抗体5、单克隆抗体的优点:灵敏度高，特异性强，可大量制备6、单克隆抗体的用途：①作为诊断试剂：能准确地识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。

②用于治疗疾病和运载药物：主要用于癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于其他疾病的治疗。

“生物导弹”＝“瞄准装置”（单克隆抗体）＋“杀伤性弹头”（药物）7、抗体的传统生产方法：向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从血清中分离所需抗体。

缺点是：产量低、纯度低，特异性差、灵敏度低。

练习：1、科研人员将抗癌药物连接在单抗上制成“生物导弹”用于癌症治疗。

“生物导弹”由两部分组成，一是“瞄准装置”，二是“杀伤性弹头”，分析下列有关描述，其中不正确的是[]A．“瞄准装置”由识别肿瘤的单克隆抗体组成B．“弹头”由放射性同位素、化学药物或毒素等物质构成C．“弹头”中的药物有选择杀伤肿瘤细胞的功能D．“生物导弹”的制备应用了细胞工程技术2、下图是单克隆抗体制备流程阶段示意图（1）单克隆抗体制备过程用到了技术。

单克隆抗体制备两次筛选的原理一、引言单克隆抗体是一种具有高度特异性和亲和性的抗体，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和治疗等领域。

制备单克隆抗体的关键步骤之一就是筛选，而为了获得更高亲和力和特异性的抗体，通常需要进行两次筛选。

本文将介绍单克隆抗体制备两次筛选的原理及其意义。

二、第一次筛选原理第一次筛选是为了从混合的抗体群体中筛选出特异性较高的单克隆抗体。

筛选的关键是对目标抗原进行免疫反应，然后通过适当的方法分离和检测抗体。

1. 免疫反应：通常采用的方法是将目标抗原免疫到动物体内，激发免疫反应。

免疫反应的方式可以是免疫原注射或者抗原与适当的载体融合，然后注射到动物体内。

2. 分离抗体：在免疫反应完成后，可以从动物体内采集到血清或者细胞，其中含有大量的抗体。

通过一系列的分离步骤，如离心、过滤、层析等，将目标抗原特异性较高的抗体分离出来。

3. 检测抗体：得到抗体后，需要进行检测以确定其特异性。

常用的方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组化和免疫印迹等。

这些方法可以通过检测抗体与目标抗原的结合情况来评估抗体的特异性。

三、第二次筛选原理第一次筛选得到的抗体是一种多克隆抗体，包含多个亲和力和特异性不同的抗体。

第二次筛选的目的是从第一次筛选得到的抗体中筛选出特异性和亲和力更高的单克隆抗体。

1. 单克隆化：将第一次筛选得到的抗体进行单克隆化处理。

常用的方法有杂交瘤技术和限制稀释法。

杂交瘤技术是将抗体产生的B细胞与肿瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，进而筛选出单克隆抗体。

限制稀释法是将抗体稀释到一定程度，使得每个孔只有一个抗体分子，然后进行培养，最终得到单克隆抗体。

2. 亲和度筛选：通过亲和层析等方法对单克隆抗体进行筛选，选择亲和度更高的抗体。

亲和层析是将抗体与亲和基质结合，然后通过洗脱的方式分离出亲和度较高的抗体。

这一步骤可以进一步提高抗体的特异性和亲和力。

四、意义与应用单克隆抗体制备两次筛选的原理可以提高抗体的特异性和亲和力，使得抗体在生物医学研究、临床诊断和治疗等领域具有更广泛的应用。

单克隆抗机造备历程中筛选纯接瘤细胞的本理战要领之阳早格格创做单克隆抗机造备历程中，有二次筛选历程，第一次是选出纯接瘤细胞（用采用培植基），第二次是进一步选出能爆收咱们需要的抗体的纯接瘤细胞.第一次筛选的本理战要领：细胞混合后，纯接瘤细胞的采用性培植是第一次筛选的闭键.一致采与的HAT采用性培植液是正在一般的动物细胞培植液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤战胸腺嘧啶核苷酸.其一居室细胞中的DNA 合成油二条道路：一条道路是死物合成道路（“D道路”），即由氨基酸及其其余小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供本料.再此合成历程中，叶酸动做要害的辅酶介进那一历程，而HAT培植液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，不妨阻断DNA合成的D道路.另一条道路是应慢道路（“S道路”），她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷变化酶战胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤战胸腺嘧啶死成相映的核苷酸，二种酶缺一不可.果此，正在HAT培植液中，已混合的效力B 细胞核二个效力B细胞混合的D道路被氨基蝶呤阻断，随S道路平常，但是果缺累正在体中培植液中删殖的本领，普遍10天安排会牺牲.对付于骨髓瘤细胞以及自己混合细胞而止，由于常常采与的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷变化酶缺陷型细胞，果此自己不S 道路，且D道路又被氨基蝶呤阻断，所有正在HAT培植液中也不克不迭删殖而很快牺牲.惟有骨髓瘤细胞与效力B细胞相互混合产死的纯接瘤细胞，既具备效力B细胞的S道路，又具备骨髓瘤细胞正在体中培植液中少久删殖的个性，果此能正在HAT培植液中采用性存活下去，本去不竭删殖.第二次筛选的本理战要领：正在单克隆抗体的死产历程中，由于效力B细胞的特同性是分歧的，经HAT培植液第一次筛选出的纯接瘤细胞爆收的抗体存留好别，必须对付纯接瘤细胞举止第二次筛选，选出能爆收特定抗体的纯接瘤细胞.二次筛选常常采与有限密释克隆细胞的要领，将纯接瘤细胞多倍密释，接种正在多孔的细胞培植板上，是每孔细胞不超出一个，通过培植让其删殖，而后检测各孔上浑液中的细胞分泌的抗体，上浑液可与特定抗本分离的培植孔为阳性孔.阳性孔中的细胞还不克不迭包管是去自单个细胞，继承举止有限密释，普遍沉复3-4次，曲至确疑每孔中删殖的细胞为单克隆细胞.第二次筛选也是审定的历程.。

单克隆抗体的制备和基因工程中的二次筛选
杨涌
【期刊名称】《中学生物教学》
【年(卷),期】2009()4
【摘要】单克隆抗体的制备和基因工程中检测并筛选获得了目的基因的受体细胞都有二次筛选，二者既是高中生物学教学的重点和难点，也是高考的热点。

单克隆抗体的制备的第一次筛选一般用HAT选择性培养基筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选最常用有限稀释法，并用ELISA法测定，选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。

基因工程中检测并筛选获得了目的基因的受体细胞的二次筛选都要用标记基因．第二次筛选还要用影印法。

【总页数】3页(P53-55)
【关键词】筛选;HAT培养基;有限稀释法;ELISA法;抗性基因;影印法
【作者】杨涌
【作者单位】四川省南溪一中
【正文语种】中文
【中图分类】S852.43;Q78
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1.解读单克隆抗体制备过程中的两次筛选及考查例解 [J], 朱秀芹
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3.抗HIV-2 gp36基因工程抗原单克隆抗体的制备和鉴定 [J], 赵正历;王润田;王平;王从印;张征峥;邓郁青
4.单克隆抗体制备过程中的筛选问题 [J], 顾文波
5.对一道高考试题的商榷——兼谈单克隆抗体制备过程中的两次筛选 [J], 周树胜因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

单克隆抗体二次筛选目的
单克隆抗体的二次筛选是为了确认初步筛选出的阳性细胞株中，是否存在单一的克隆细胞株，其所产生的抗体具有特异性和稳定性。

在初步筛选中，我们可能会得到一些阳性细胞株，但这些细胞株中
可能存在多个克隆细胞株，它们分泌的抗体可能具有不同的特异性
和亲和力。

因此，二次筛选的目的是要从中筛选出单一的克隆细胞株，确保所得的单克隆抗体具有较高的特异性和亲和力。

在进行单克隆抗体的二次筛选时，我们通常会进行单细胞克隆化，即将阳性细胞株进行限稀释，使得每个细胞在培养皿中独立生长，形成单个克隆细胞株。

接着，我们会对每个克隆细胞株进行抗
体的表征，包括抗体的特异性、亲和力和稳定性等方面的检测。

通
过这些检测，我们可以筛选出表现最佳的单克隆细胞株，从而确保
最终获得的单克隆抗体具有较高的特异性和稳定性。

此外，单克隆抗体的二次筛选也可以帮助我们评估不同克隆细
胞株产生的抗体在不同条件下的表现差异，比如在不同培养基、不
同温度或不同培养时间下的抗体产量和特异性等。

这些信息对于后
续的抗体生产和应用具有重要的指导意义。

总之，单克隆抗体的二次筛选的目的是为了确认单一的克隆细胞株，筛选出具有较高特异性和稳定性的单克隆抗体，为后续的抗体生产和应用奠定基础。

课本中的图解谈到了在筛选培养基选择了杂交瘤细胞之后，专一抗体检验阳性细胞需进行多次克隆后检查，其机制和原理，教参与课本都没有解释清楚，经查询专业医药生产文章得知以下解释：筛选培养基得到的专一阳性克隆需再次克隆的原因：可以简单理解为：1.可能含有不分泌抗体的细胞或有多株分泌抗体的细胞2.刚融合的细胞不稳定一般再经三次克隆选择后，才能达到100%阳性克隆。

细解做法为：第一次筛选培养（HAT）：去除无关细胞，得到杂交瘤细胞。

将融合的细胞悬浮于HAT培养基中，加入到96孔板内，根据情况2-3天换液一次，每次吸去二分之一到三分之二培养液，再加入等量新鲜培养液。

7-14天改用HT培养液，14天以后用普通的RPMI1640完全培养液。

因为杂交瘤数量很少，多半不易存活，所以通常要加入饲养细胞才能使其繁殖，常用小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞。

能释放某些生长刺激因子，并能满足杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。

（有的死，有的活，活的有些可以用单一抗体检验阳性，但阳性孔可能由1~多个细胞克隆得到）第二次筛选：初筛阳性克隆可能含有不分泌抗体的细胞或有多株分泌抗体的细胞，且刚融合的细胞不稳定，故应尽早进行克隆。

克隆后的细胞集团生物学特性完全相同。

（将其单个分开）融合后的杂交瘤细胞要经过三次克隆化才能达到100%的阳性克隆。

常用方法：有限稀释法和软琼脂法。

有限稀释法，把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔板中，理论上每孔一个细胞，第一次克隆化时用HT培养液，以后的克隆化可以用不含HT的RPMI1640培养液。

也要加入饲养细胞。

软琼脂法，在培养液中加入0.5%左右的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体的，可用毛细管将小球吸出，团块经打碎后，移入96孔板继续培养。

单克隆抗体多次筛选的原理单克隆抗体多次筛选的原理单克隆抗体是一种可以识别和结合到特定抗原的抗体分子。

在制备单克隆抗体的过程中，需要经过多次筛选，以确保获得高亲和力和高特异性的单克隆抗体。

下面将介绍单克隆抗体多次筛选的原理。

第一次筛选：免疫原与抗体结合在制备单克隆抗体的第一次筛选中，需要将免疫原与小鼠或兔子等动物的免疫系统接触，激发其产生抗体。

然后从动物体内收集血清，将其与免疫原结合，筛选出与免疫原结合能力较强的抗体。

第二次筛选：抗体与免疫原结合在第一次筛选后，需要将抗体与免疫原结合，筛选出与免疫原结合能力最强的抗体。

这一步通常采用ELISA等技术进行。

第三次筛选：亲和力筛选在第二次筛选后，需要对抗体进行亲和力筛选，以筛选出具有高亲和力的抗体。

亲和力是指抗体与抗原结合的强度，亲和力越高，结合越紧密，抗原的识别和结合能力就越强。

第四次筛选：特异性筛选在第三次筛选后，需要对抗体进行特异性筛选，以筛选出具有高特异性的抗体。

特异性是指抗体只能识别和结合到目标抗原，而不会与其他抗原结合。

通常采用Western blot等技术进行特异性筛选。

第五次筛选：克隆化在第四次筛选后，需要对抗体进行克隆化，以获得单克隆抗体。

克隆化是指将抗体分离成单个细胞，并培养成单个细胞克隆。

通过克隆化，可以获得具有相同特异性和亲和力的单克隆抗体。

总结单克隆抗体的制备需要经过多次筛选，以确保获得高亲和力和高特异性的单克隆抗体。

在筛选过程中，需要进行免疫原与抗体结合、抗体与免疫原结合、亲和力筛选、特异性筛选和克隆化等步骤。

通过多次筛选，可以获得高质量的单克隆抗体，用于科研和临床应用。

单克隆抗体‎制备过程中‎经过两次筛‎选单克隆抗体‎制备过程中‎，总共有两次‎筛选，第一次筛选‎出杂交瘤细‎胞，第二次筛选‎出能产生特‎异性抗体的‎杂交瘤细胞‎，两次筛选的‎原理和方法‎是不相同的‎。

第一次筛选‎的原理与方‎法：细胞融合后‎，杂交瘤细胞‎的选择性培‎养是第一次‎筛选的关键‎。

普遍采用的‎H A T选择‎性培养液是‎在普通的动‎物细胞培养‎液中加入次‎黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶‎核苷酸（T）。

其依据是细‎胞中的DN‎A合成有两‎条途径：一条途径是‎生物合成途‎径（“D途径”），即由氨基酸‎及其他小分‎子化合物合‎成核苷酸，为DNA分‎子的合成提‎供原料。

在此合成过‎程中，叶酸作为重‎要的辅酶参‎与这一过程‎，而HA T培‎养液中氨基‎喋呤是一种‎叶酸的拮抗‎物，可以阻断D‎N A合成的‎“D途径”。

另一条途径‎是应急途径‎或补救途径‎（“S途径”），它是利用次‎黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸‎核苷转移酶‎（HGPRT‎）和胸腺嘧啶‎核苷激酶（TK）催化次黄嘌‎呤和胸腺嘧‎啶核苷生成‎相应的核苷‎酸，两种酶缺一‎不可。

因此，在HA T培‎养液中，未融合的效‎应B细胞和‎两个效应B‎细胞融合的‎“D途径”被氨基喋呤‎阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在‎体外培养液‎中增殖的能‎力，一般10d‎左右会死亡‎。

对于骨髓瘤‎细胞以及自‎身融合细胞‎而言，由于通常采‎用的骨髓瘤‎细胞是次黄‎嘌呤—鸟嘌呤磷酸‎核苷转移酶‎缺陷型（HGPRT‎）细胞，因此自身没‎有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋‎呤阻断，所以在HA‎T培养液中‎也不能增殖‎而很快死亡‎。

惟有骨髓瘤‎细胞与效应‎B 细胞相互‎融合形成的‎杂交瘤细胞‎，既具有效应‎B细胞的“S途径”，又具有骨髓‎瘤细胞在体‎外培养液中‎长期增殖的‎特性，因此能在H‎A T培养液‎中选择性存‎活下来，并不断增殖‎。

第二次筛选‎的原理和方‎法：在实际免疫‎过程中，由于采用连‎续注射抗原‎的方法，且一种抗原‎决定簇刺激‎机体形成相‎对应的一种‎效应B淋巴‎细胞，因此，从小鼠脾脏‎中取出的效‎应B淋巴细‎胞的特异性‎是不同的，经HA T培‎养液筛选的‎杂交瘤细胞‎特异性也存‎在差异，所以必须从‎杂交瘤细胞‎群中筛选出‎能产生针对‎某一预定抗‎原快定簇的‎特异性杂交‎瘤细胞。

单克隆抗体制‎备中杂交瘤细‎胞的两次筛选‎(资料)单克隆抗体制‎备过程中，总共有两次筛‎选，第一次筛选出‎杂交瘤细胞，第二次筛选出‎能产生特异性‎抗体的杂交瘤‎细胞，两次筛选的原‎理和方法是不‎相同的。

第一次筛选的‎原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的‎选择性培养是‎第一次筛选的‎关键。

普遍采用的H‎A T选择性培‎养液是在普通‎的动物细胞培‎养液中加入次‎黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核‎苷酸（T）。

其依据是细胞‎中的DNA合‎成有两条途径‎：一条途径是生‎物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及‎其他小分子化‎合物合成核苷‎酸，为DNA分子‎的合成提供原‎料。

在此合成过程‎中，叶酸作为重要‎的辅酶参与这‎一过程，而HAT培养‎液中氨基喋呤‎是一种叶酸的‎拮抗物，可以阻断DN‎A合成的“D途径”。

另一条途径是‎应急途径或补‎救途径（“S途径”），它是利用次黄‎嘌呤—鸟嘌呤磷酸核‎苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核‎苷激酶（TK）催化次黄嘌呤‎和胸腺嘧啶核‎苷生成相应的‎核苷酸，两种酶缺一不‎可。

因此，在HAT培养‎液中，未融合的效应‎B细胞和两个‎效应B细胞融‎合的“D途径”被氨基喋呤阻‎断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体‎外培养液中增‎殖的能力，一般10d 左‎右会死亡。

对于骨髓瘤细‎胞以及自身融‎合细胞而言，由于通常采用‎的骨髓瘤细胞‎是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核‎苷转移酶缺陷‎型（HGPRT）细胞，因此自身没有‎“S 途径”，且“D途径”又被氨基喋呤‎阻断，所以在HAT‎培养液中也不‎能增殖而很快‎死亡。

惟有骨髓瘤细‎胞与效应B细‎胞相互融合形‎成的杂交瘤细‎胞，既具有效应B‎细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤‎细胞在体外培‎养液中长期增‎殖的特性，因此能在HA‎T培养液中选‎择性存活下来‎，并不断增殖。

第二次筛选的‎原理和方法：在实际免疫过‎程中，由于采用连续‎注射抗原的方‎法，且一种抗原决‎定簇刺激机体‎形成相对应的‎一种效应B淋‎巴细胞，因此，从小鼠脾脏中‎取出的效应B‎淋巴细胞的特‎异性是不同的‎，经HAT培养‎液筛选的杂交‎瘤细胞特异性‎也存在差异，所以必须从杂‎交瘤细胞群中‎筛选出能产生‎针对某一预定‎抗原快定簇的‎特异性杂交瘤‎细胞。

教学链接单克隆抗体的制备及考查例解山东省泗水县第一中学(273200)　王廷伟 单克隆抗体的制备技术是1975年英国科学家C・M ilstein和G・Kohler发明的,这是免疫学上的一次伟大革命。

该项技术打破了过去只能在动物体内获得抗体的方法,成功地在体外用细胞培养的方法来快速制备大量的单一抗体,而且所得抗体纯度高,与抗原结合的特异性强,便于人为处理和质量控制。

因此在医学领域,单克隆抗体在疾病防控、临床诊断、临床治疗及疾病机制研究等方面起着巨大的推动作用。

鉴于上述原因,C・M ilstein和G・Kohler在1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖。

1　单克隆抗体的概念及其制备原理111　单克隆由一个细胞经过无性繁殖(多次有丝分裂)形成的一个细胞群,叫一个克隆,即单克隆。

112　单克隆抗体由一个效应B淋巴细胞经过无性繁殖形成的一个细胞群产生的化学性质单一、特异性强的抗体,即单克隆抗体。

113　单克隆抗体制备的原理11311　免疫原理。

利用效应B淋巴细胞能够产生特异性抗体的特性。

11312　细胞融合原理。

利用病毒对宿生细胞的穿透性使效应B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合的特性。

11313　动物细胞的培养技术。

对杂交瘤细胞进行体内、体外培养。

2　单克隆抗体制备的流程211　选择融合的细胞单克隆抗体是由制造该抗体的免疫B细胞(效应B细胞)与癌细胞融合后形成的杂种瘤细胞产生的。

该杂种瘤细胞既具有癌细胞无限增殖的特性,又具有效应B淋巴细胞产生专一抗体的特性。

21111　免疫B淋巴细胞的选择。

要制备针对某一目标抗原的单克隆抗体,必须用高纯度(纯度越高越好)的该目标抗原刺激实验动物(小白鼠)。

由于脾是B淋巴细胞聚集的重要场所,无论以何种免疫方式刺激,脾脏内皆会出现明显的抗体应答反应。

因此,小鼠脾细胞内含大量的效应B淋巴细胞(针对该目标抗原的)。

事实上,实验小鼠在注射该目标抗原前,其体内由于已经存在很多病原体(如病毒、细菌等),这些抗原引起的免疫反应已经产生了大量的效应B淋巴细胞(脾脏内含大量的针对各种抗原的效应B淋巴细胞)。

解读单克隆抗体制备过程中的两次筛选及考查例解“单克隆抗体的制备”是选修三“动物细胞工程”这一章的重点内容，虽然高考对选修教材要求层次相对较低，但两次筛选过程仍时有考查。

课本中对第一次筛选这样叙述：“根据这个设想，他们首先将抗原注射入小鼠体内，然后从小鼠脾脏中获得能产生抗体的B 淋巴细胞，与小鼠骨髓瘤细胞在灭活的仙台病毒或聚乙二醇的诱导下融合，再在特定的选择性培养基中，筛选出杂交瘤细胞。

”学生在预习中多次会问及这是什么样的选择培养基，怎样选择。

在诱导剂作用下，培养基中会出现三种细胞，B 淋巴细胞与B 淋巴细胞融合，骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞融合，以及B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，未融合的B淋巴细胞、未融合的瘤细胞，以及细胞的多聚体形式等。

正常的B 淋巴细胞在培养基中存活仅5~7 天，不需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去，而未融合瘤细胞则需进行特别的筛选去除。

在普通动物培养基中加入次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺密啶脱氧核苷酸制成HAT 培养基，这是根据细胞中的DNA 合成途径有两条：一条途径是生物合成途径（“D 途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA 分子合成提供原料。

此过程中，叶酸作为重要辅酶参与此过程，而HAT 培养液中氨基蝶呤是叶酸的拮抗物，可以阻断DNA 合成的“D 途径”，氨基蝶呤这种独特的拮抗叶酸作用，也广泛用于医学领域，如治疗一些顽固性疾病、类风湿性关节炎、牛皮癣等，效果显著。

DNA的另一条合成途径是应急途径（“S 途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷酸转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶，催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。

因此，在HAT 培养液中，未融合的效应B 细胞和两个融合的效应B 细胞融合的“D 途径”被氨基蝶呤阻断，虽“S 途径”正常，但因缺乏体外培养液中增殖的能力，一般10d 左右死亡。

对于骨髓瘤细胞及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷酸转移酶缺陷型细胞，因此，自身无“S 途径”，且“D 途径”又被氨基蝶呤阻断，所以HAT 培养液中也不能增殖而很快死亡。