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果皮中酵母菌的分离与纯化一、实验目的应用酵母菌的生理生化和生态学的特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。
二、实验原理酵母菌常见于含糖比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。
多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为4.5-6.0.酵母菌生长迅速，容易分离培养。
在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。
因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化。
三、器材和用品1、苹果皮、葡萄皮等。
2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g（煮开10min后过滤取汁），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。
3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，不加琼脂加乳酸，按1000ml培养基加入5ml乳酸，pH为5.5左右。
4、无菌吸管、无菌培养皿、涂布棒、美兰染液、显微镜、接种环等。
四、实验方法1、接种：取果皮（不需冲洗）5克，加入到100ml无菌水中，充分搅拌后，用无菌吸管取1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h-48h，可见培养液变浑浊。
2、加富培养：用无菌吸管取上述培养液1ml，注入另1管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h-48h。
3、分离纯化:用1ml的无菌吸管单独吸取上述培养液至9ml的无菌水中便是10-1如此稀释10-2、10-3。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用1ml的无菌吸管吸取10-3培养液至培养基表面，用无菌的玻璃刮产迅速涂抹均匀，而后做好标记放置恒温箱培养大约24-48小时（培养皿倒置），菌落长出后，观察菌落，并镜检菌体，一般一个单独的菌落可视为一个细胞发育而来，是纯培养，如果结果复杂，未得纯培养，可进行再次分离培养（划线法），直到纯化为止（注意保藏菌种），对纯化菌种再次固体培养24h-48h，观察菌落特征（特征:菌落质地是否为奶酪状、粘液状。
专题一传统发酵技术的应用课题1 果酒和果醋的制作1．果酒制作的原理（1）人类利用微生物发酵制作果酒，该过程用到的微生物是，它的代谢类型是，其大量繁殖时的方程。
进行发酵的方式式是。
（2）果酒制作条件传统发酵技术所使用的酵母菌的来源是。
酵母菌生长的最适温度是； PH呈；（3）红色葡萄酒呈现颜色的原因是：酒精发酵过程中，随着的提高，红色葡萄皮的进入发酵液，使葡萄酒呈色。
（4）在、的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其它微生物都因无法适应这一环境而受到抑制。
2．果醋的制作原理（1）果醋发酵菌种是，新陈代谢类型。
（2）当氧气和糖源充足时醋酸菌将糖分解成，当糖源不足时醋酸菌将变为再变成醋酸，其反应式。
3．操作过程应注意的问题（1）为防止发酵液被污染，发酵瓶要用消毒。
（2）葡萄汁装入发酵瓶时，要留出大约的空间，为什么。
（3）制作葡萄酒时将温度严格控制在。
制葡萄醋的过程中，将温度严格控制在，并注意适时充气，为什么。
4．酒精的检验（1）试剂：。
（2）条件及现象：在条件下，反应呈现。
5.制作果酒、果醋的实验流程挑选葡萄→→→→↓↓果酒果醋6．你认为应该先洗葡萄还是先除去枝梗，为什么？。
7.每次排气时只需拧松瓶盖，不要完全揭开瓶盖；制醋时，再将瓶盖打开，盖上一层纱布，进行葡萄醋的发酵，其目的是。
8.排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接，其目的是。
课题2 腐乳的制作1.制作原理（1）．经过微生物的发酵，豆腐中的蛋白质被分解成小分子的和，脂肪被分解成和，因而更利于消化吸收。
（2）．腐乳的制作过程中起主要作用的微生物是。
它是一种丝状。
（3）．现代的腐乳生产是在严格的条件下，将优良菌种直接接种在豆腐上，这样可以避免其他菌种的，保证产品的质量。
2. 腐乳制作的实验流程：让豆腐长出→→→密封腌制。
3.实验注意事项（1）在豆腐上长出毛霉时，温度控制在，自然条件下毛霉的菌种来自空气中的。
（2）将长满毛霉的豆腐块分层加盐，加盐量要随着摆放层数的加高而，近瓶口的表层要。
一种保藏酵母菌的方法技术领域本发明涉及一种保藏酵母菌的方法，属于酵母菌的保藏技术领域。
背景技术酵母为单细胞真菌，是子囊菌、担子菌等几科单细胞真菌的通称。
酵母无害，容易生长，可将大分子物质分解成细胞新陈代谢易于利用的小分子物质，属于异养生物。
酵母菌是人类文明史中被应用得最早的微生物，其既可用于酿造生产，又是遗传工程和细胞周期研究的模式生物，受到广大科研工作者的青睐。
酿酒酵母在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主，毕赤酵母作为宿主的外源基因表达系统近年来发展迅速，应用也最为广泛，此外，汉逊酵母中较高的目的蛋白表达量使得其也日益应用于大规模生产中。
随着大量新型酵母工程菌株的构建，酵母工程菌的培养与保存成为了影响其蛋白表达的重要因素：菌种保存方法得当，复苏后酵母生长状态良好，目的蛋白表达量高，产量大大提高。
传统的酵母菌保藏方法主要有两种，一，酵母菌保存于含有一定比例甘油的培养基中，于低温或液氮中保存；二，将酵母中加入脱脂奶粉等保护剂，进行冻干保存。
传统的方法，可以使得酵母成功地复苏培养，逐级放大生产，实现目的蛋白的表达与收获。
然而，传统的保藏方式会造成酵母菌的大量死亡，尤其随着保存时间的增加，酵母的活菌率呈现明显的下降趋势，影响了复苏后的酵母扩大培养。
发明内容本发明的目的在于提供一种提高酵母菌复苏时活菌率的保藏酵母菌的方法、利用该方法保藏的酵母工程菌的目的蛋白表达量也能够获得显著提高。
本发明提供的一种保藏酵母菌的方法，是在酵母菌液中加入甘油和琼脂，混匀后迅速置于液氮中冷冻，之后于-20℃以下长期保藏。
其中，酵母菌液中甘油的终浓度为12％-18％，琼脂的终浓度为0.02％-0.1％，所述％为质量百分比。
优选地，酵母菌液中甘油的终浓度为14％-16％，琼脂的终浓度为0.03％-0.07％，所述％为质量百分比。
更优选地，酵母菌液中甘油的终浓度为15％，琼脂的终浓度为0.05％，所述％为质量百分比。
酵母菌的冷冻保藏方法
酵母菌的冷冻保藏方法可以分为以下几个步骤：
1. 选择合适的培养基：酵母菌的冷冻保存需要使用特定的培养基。
一般常用的培养基有YEPD（yeast extract peptone dextrose），YPD（yeast extract peptone glucose）等。
2. 准备冷冻培养基：根据所使用的培养基配方准备适量的冷冻培养基，并添加适量的甘油（最常用浓度为20%）作为保护剂。
3. 收集酵母菌：从已培养的酵母菌液体培养物或固体培养物中取出适量的酵母菌。
4. 制备冻存管：在已准备好的冷冻培养基中加入酵母菌，混匀后加入冻存管中。
每个冻存管一般加入适量的酵母菌液体培养物（一般为1-2 mL），然后密封。
5. 冷冻：将密封的冻存管放入低温冰箱或液氮罐中冷冻保存。
温度一般可以设置为-80℃或更低的温度。
6. 保存：将冷冻保存的酵母菌定期检查，并在需要时重新接种到新的培养基上进行培养。
需要注意的是，冷冻保存的酵母菌应该尽可能快地进行解冻，并立即接种到适当的培养基上进行培养，以确保存活率。
果酒发酵知识点总结一、果酒发酵原理果酒发酵的基本原理是利用酵母菌将果汁中的果糖和葡萄糖等成分转化为酒精和二氧化碳，从而使果汁变成果酒。
发酵过程中，酵母菌所需要的条件是：含糖量，酸度和营养物质。
当果汁中含糖量适合时，酵母菌会开始发酵，产生酒精和二氧化碳，最终形成果酒。
在果酒发酵过程中，有几个关键的环节需要特别注意。
首先是控制发酵温度，一般来说，较低温度下的发酵可以产生口感更加清爽的果酒，而较高温度下的发酵则会产生更丰富的香气。
其次是控制发酵速度，过快的发酵速度可能会导致果酒中的香味流失，过慢的发酵速度则会使果酒产生异味。
最后，需要注意的是果酒发酵过程中的氧气供应，过多或者过少的氧气供应都会影响果酒的口感和质量。
二、果酒发酵过程中的酵母菌酵母菌是果酒发酵过程中不可或缺的关键因素。
在果酒制作过程中，有很多不同种类的酵母菌可供选择。
这些酵母菌在发酵过程中会产生不同的风味和口感。
要选择合适的酵母菌应根据果酒的类型和特点来决定。
一般来说，常用的酵母菌有酿酒酵母、泡沫酵母、发酵毛毛虫等。
酿酒酵母是最常用的酵母菌，它能够在不同的发酵条件下进行发酵，从而产生不同口感的果酒。
泡沫酵母则是一种产生香气浓郁的酵母菌，适合用于果酒中。
而发酵毛毛虫是一种对氧气要求较高的酵母菌，能够在适宜的条件下产生清爽口感的果酒。
三、果酒发酵过程中的发酵条件在果酒发酵的过程中，控制发酵条件是非常重要的。
发酵条件主要包括控制酒精度，促进酵母菌发酵，控制氧气供应等关键环节。
果酒的酒精度要根据果酒的类型和口感来决定。
一般来说，果酒的酒精度在5%-15%之间为最佳，过高或者过低的酒精度会影响果酒的口感。
为了促进酵母菌的发酵，适当的添加一些维生素和氨基酸等营养物质可以提高果酒的发酵速度和品质。
此外，果酒发酵过程中的氧气供应也是非常重要的，适量的氧气供应可以促进酵母菌的生长和发酵，从而使果酒质量更加优良。
四、果酒发酵过程中的发酵设备在果酒发酵过程中，发酵设备是非常关键的。
微生物菌种保藏方法
微生物菌种的保藏是非常重要的，因为这些菌种可能用于各种实验和研究中。
以下是一些常见的微生物菌种保藏方法：
1. 冷冻保存：将菌种在液氮或-80的冰箱中冷冻保存。
这是最常见的保藏方法，能够长期保存菌株并保持其遗传稳定性。
2. 干燥保存：将菌种在无菌室中取出，用无菌纸或吸水纸吸干，然后放入无菌瓶中密封保存。
干燥保存适用于某些孢子或芽孢的微生物，比如放线菌、链霉菌等。
3. 明胶斜培养基保存：将菌种接种在含有明胶的固体培养基上，然后密封保存。
这种方法适用于某些菌株，如革兰氏阳性菌和厌氧菌。
4. 低温保存：将菌种保存在4的冰箱中。
这种保存方式可以在短时间内保持菌株的活性，但不能长期保存。
5. 液氮保存：将菌种在锅内预冷冷冻过的无菌玻璃管中加入10%甘油或蔗糖，然后立即在液氮中保存。
这种方法适用于大多数微生物，并且可以长期保存。
食用菌菌种保藏的6种方法
菌种保藏的目的是通过降低菌种的代谢活力，使其处于休眠状态，减缓衰亡速度，保持菌种原有优良性状，防止杂菌污染；当恢复生活条件时，菌种能在很短时间内恢复生机，迅速生长繁殖。
母种的保藏有如下方法：
1.斜面冰箱保藏法：把生长丰满健壮的斜面母种，把棉塞在管口剪平，用蜜蜡封口或换用胶塞，存放于摄氏4度冰箱内保存。
高温菌在16摄氏度为宜。
有效期3—6个月。
2.石蜡油保藏法：斜面母种注入经二次灭菌后，在摄氏40度温箱2天蒸发水分而冷却了的石蜡油至斜面顶尖1—1.5厘米处，再用蜜蜡封管口或换用胶塞，直立于摄氏4度冰箱或室温存放。
保存期可1—2年。
3.孢子保藏法：用2×0.5×0.8厘米经灭菌的滤纸条吸附上孢子，可参考孢子分离法，然后把带孢子的纸条放入无菌试管内，置干燥器内2—3天吸干水分，再改用胶塞。
在冰箱或室温内可保存多年。
4.菌丝球保藏法：常用经灭菌的生理盐水、无菌水、蒸馏水、营养液等装入试管约5毫升作媒介，把经过液体培养至对数生长期的菌丝球4—5个，移入媒介内，用胶塞封口，冰箱摄氏4度或室温可保存1—2年。
5.液氮保藏法：常用经灭菌10%甘油蒸馏水或10%二甲基亚砜蒸馏水为保护剂，注入斜面母种管，刮下菌丝体成悬浮液或孢子液，吸取菌液0.5—0.8毫升注入已灭菌安瓿管，
熔封管口，置液氮冷冻器内，每分钟降摄氏1度，1小时内使其温度降至摄氏负35度，其后迅速降至气相摄氏负150度，液相摄氏负196度保存。
保存期可超过10年。
6.自然基质保藏法：此法多用于原种保藏。
在一些欠设备的地区，也可作母种保藏法。
酵母菌菌种保藏技术规程1范围本规程规定了酵母菌菌种保藏的技术和程序。
本规程适用于酵母菌菌种的保藏。
2术语和定义下列术语和定义适用于本规程2.1定期移植法subculturing亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜的斜面培养基上，最适条件下培养，待得到健壮的菌体后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的一种短期菌种保藏方法。
2.2蒸馏水法preservation in distilled water指将欲保藏的菌种细胞悬浮于无菌蒸馏水中，密封后置于4～6℃保存的一种菌种保藏方法。
2.3液体石蜡法preservation in liquid paraffin亦称矿物油保藏法，定期移植保藏法的辅助方法。
指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养至待得到健壮的菌体后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。
2.4－80℃冰箱冻结法preservation at －80℃指将菌种悬浮于保护剂中，在－80℃冰箱中冻结保存的一种长期菌种保藏方法。
2.5液氮超低温冻结法preservation in liquid nitrogen指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置于－196℃的液氮或－150℃左右的液氮气相中保存的一种长期菌种保藏方法。
2.6真空冷冻干燥法freeze-drying指将欲保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存后保存的一种长期菌种保存方法。
3保藏准备工作3.1菌种待保藏的酵母菌菌种必须进行分离纯化，得到纯培养后再进行保藏。
3.2工具、材料接种针或接种环、吸管、镊子、75%酒精棉球、酒精灯、试管架、量筒、烧杯、平皿、标签、波美计等。
3.3器皿3.3.1试管选用平口试管，规格一般为15×150mm。
3.3.2安瓿管制安瓿管的材料应为中性玻璃，质地软硬度要适当。
管的内径为8mm，长度不小于100mm。
果酒酵母发酵及菌种保藏选取1-2种酿酒酵母进行小型酿酒实验，在品尝合格并符合规定的感官及理化指标后，选用常用菌种保藏方法对有价值的菌种进行保藏。
1.实验目的和内容1）掌握果酒酿造的原理并对筛选果酒酵母菌种进行发酵性能测定（起酵时间、产酒精度、耐受性能）。
2）用选育果酒酵母进行小型酿酒实验，掌握果酒酿造一般工艺流程。
3）了解并掌握菌种保藏的常用方法及其优缺点。
4）学习几种常用菌种保藏方法：斜面传代保藏方法、液体石蜡保藏方法、沙土管保藏方法、冷冻干燥保藏方法。
2.实验原理果酒发酵：果浆或果汁中的葡萄糖和果糖在酵母菌的作用下，最后生成酒精和二氧化碳。
可用以下反应式来说明：果酒发酵是一个极其复杂的生物化学现象。
在每一步反应过程中都有酶的参与，除了最后生成酒精、二氧化碳和少量的甘油、高级醇类、醛类物质之外，还会生成二磷酸己糖、磷酸甘油醛、丙酮酸、乙醛等许多中间产物。
果酒的发酵分主发酵和后发酵两个阶段，主发酵是将发酵液的糖分变成酒精，后发酵是继续分解残糖为酒精，加速酒的转化，使酒更加稳定。
用人工培养的酵母发酵的称为人工发酵，利用天然酵母发酵的称为自然发酵。
按照工艺的不同又可分为渣汁混合发酵和渣汁分离发酵两种形式。
微生物具有容易变异的特性，因此经过分离纯化选育的酿酒酵母要经历长期的保存必须要用实验方法对其保藏，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。
保藏方法大致可分为以下几种：1）传代培养保藏法又称斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4-6℃冰箱内保存。
2）液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。
果酒酵母发酵及菌种保藏选取1-2 种酿酒酵母进行小型酿酒实验，在品尝合格并符合规定的感官及理化指标后，选用常用菌种保藏方法对有价值的菌种进行保藏。
1. 实验目的和内容1）掌握果酒酿造的原理并对筛选果酒酵母菌种进行发酵性能测定（起酵时间、产酒精度、耐受性能）。
2）用选育果酒酵母进行小型酿酒实验，掌握果酒酿造一般工艺流程。
3）了解并掌握菌种保藏的常用方法及其优缺点。
4）学习几种常用菌种保藏方法：斜面传代保藏方法、液体石蜡保藏方法、沙土管保藏方法、冷冻干燥保藏方法。
2. 实验原理果酒发酵：果浆或果汁中的葡萄糖和果糖在酵母菌的作用下，最后生成酒精和二氧化碳。
可用以下反应式来说明：果酒发酵是一个极其复杂的生物化学现象。
在每一步反应过程中都有酶的参与，除了最后生成酒精、二氧化碳和少量的甘油、高级醇类、醛类物质之外，还会生成二磷酸己糖、磷酸甘油醛、丙酮酸、乙醛等许多中间产物。
果酒的发酵分主发酵和后发酵两个阶段，主发酵是将发酵液的糖分变成酒精，后发酵是继续分解残糖为酒精，加速酒的转化，使酒更加稳定。
用人工培养的酵母发酵的称为人工发酵，利用天然酵母发酵的称为自然发酵。
按照工艺的不同又可分为渣汁混合发酵和渣汁分离发酵两种形式。
微生物具有容易变异的特性，因此经过分离纯化选育的酿酒酵母要经历长期的保存必须要用实验方法对其保藏，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。
保藏方法大致可分为以下几种：1）传代培养保藏法又称斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4-6 C冰箱内保存。
2）液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。
3）载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。
4）寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。
病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。
5）冷冻保藏法可分低温冰箱（-20至-30C, -50至-80C）、干冰酒精快速冻结（约-70C）和液氮（-196C）等保藏法。
6）冷冻干燥保藏法先使微生物在极低温度（-70C左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。
有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。
保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。
保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。
3. 实验材料和用具样品：新鲜水果及压榨汁。
试剂：亚硫酸钠、乙醇、无菌水、化学纯液体石蜡、五氧化二磷、脱脂奶粉、10%HCl 、干冰、95%乙醇、食盐、无水氯化钙、河沙、瘦黄土（有机物含量少的黄土）或者红土；器皿：三角烧瓶（250 mL）、无菌试管、无菌吸管（1 mL 及 5 mL）、无菌滴管、接种环、40 目及100目筛子、干燥器、安瓿管、冰箱、冷冻真空干燥装置、酒精喷灯、滤纸条（0.5X 1.2 cm）冰箱，低温冰箱（-30 C）,液氮冷冻保藏器，玻璃涂棒，血细胞计数板，显微镜，紫外线等（15W ），磁力搅拌器，台式离心机，震荡混合器等。
4. 操作步骤4.1 自选酵母发酵性性能的检测试验：用选育菌种发酵果酒4.1.1 果酒酿造的工艺流程鲜果T分选T破碎、除梗T果浆T分离取汁T澄清T清汁T发酵T倒桶T贮酒T过滤T冷处理T调配T过滤T成品4.1.2 工艺简述1 ）发酵前的处理前处理包括水果的选别、破碎、压榨、果汁的澄清，果汁的改良等。
①破碎、除梗：破碎要求每粒种子破裂，但不能将种子和果梗破碎，否则种子内的油酯、糖苷类物质及果梗内的一些物质会增加酒的苦味。
破碎后的果浆立即将果浆与果梗分离，防止果梗中的青草味和苦涩物质溶出。
破碎机有双辊压破机、鼓形刮板式破碎机、离心式破碎机、锤片式破碎机等。
②二氧化硫处理：二氧化硫在果酒中的作用有杀菌、澄清、抗氧化、增酸、使色素和单宁物质溶出、还原作用、使酒的风味变好等。
使用二氧化硫有气体二氧化硫及亚硫酸盐，前者可用管道直接通入，后者则需溶于水后加入。
发酵基质中二氧化硫浓度为60-100mg/L。
此外，尚需考虑下述因素：原料含糖高时，二氧化硫结合机会增加，用量略增；原料含酸量高时，活性二氧化硫含量高，用量略减；温度高，易被结合且易挥发，用量略减；微生物含量和活性越高、越杂，用量越高；霉变严重，用量增加。
2）果汁的调整①糖的调整：酿造酒精含量为10%-12%的酒，果汁的糖度需17-20 ° Bx。
如果糖度达不到要求则需加糖，实际加工中常用蔗糖或浓缩汁。
②酸的调整：酸可抑制细菌繁殖，使发酵顺利进行；使红葡萄酒颜色鲜明；使酒味清爽，并具有柔软感；与醇生成酯，增加酒的芳香；增加酒的贮藏性和稳定性。
干酒易在0.6%-0.8%，甜酒0.8%-1% —般pH大于3.6或可滴定酸低于0.65%时应该对果汁加酸。
3）酒精发酵发酵分主（前）发酵和后发酵，主发酵时，将果汁到入容器内，装入量为容器容积的4/5，然后加入3%-5%的酵母，搅拌均匀，温度控制在20-28 C,发酵时间随酵母的活性和发酵温度而变化，一般约为3-12天。
残糖降为0.4%以下时主发酵结束。
然后应进行后发酵，即将酒容器密闭并移至酒窑，在12-28 C下放置1个月左右。
发酵结束后要进行澄清，澄清的方法和果汁相同。
4）成品调配果酒的调配主要有勾兑和调整。
勾兑即原酒的选择与适当比例的混合；调整即根据产品质量标准对勾兑酒的某些成分进行调整。
勾兑，一般先选一种质量接近标准的原酒作基础原酒，据其缺点选一种或几种另外的酒作勾兑酒，加入一定的比例后进行感官和化学分析，从而确定比例。
调整，主要有酒精含量、糖、酸等指标。
酒精含量的调整最好用同品种酒精含量高的酒进行调配，也可加蒸馏酒或酒精；甜酒若含糖不足，用同品种的浓缩汁效果最好，也可用砂糖，视产品的质量而定；酸分不足可用柠檬酸。
5）过滤、杀菌、装瓶过滤有硅藻土过滤、薄板过滤、微孔薄膜过滤等。
果酒常用玻璃瓶包装。
装瓶时，空瓶用2-4%的碱液在50C以上温度浸泡后，清洗干净，沥干水后杀菌。
果酒可先经巴氏杀菌再进行热装瓶或冷装瓶，含酒精低的果酒，装瓶后还应进行杀菌。
4.1.3 发酵性能测定测定一个发酵周期内酒精度及含糖量变化，绘制发酵曲线，并对自制果酒进行感官评定，分析测定理化指标（糖度、酒度、酸度）。
还原糖、总糖的测定：直接滴定法。
总酸的测定：中和滴定法。
酒度的测定：蒸馏法。
5. 菌种保藏（下列各法可根据实验室具体条件与需要选做）见实验十二。
6. 实验结果分析1）绘制发酵周期糖度及酒精度变化曲线。
2）对酒样作感官品评，并作理化分析，测定葡萄酒的酒精、残糖、总酸。
7. 问题和讨论1）菌种保藏中，石蜡油的作用是什么？2）经常使用的细菌菌株，使用那种保藏方法比较好？3）简述果酒发酵主要影响因素。
附：总糖和还原糖的测定（一）一一费林试剂比色法1. 实验目的掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用直接滴定法测定还原糖的方法。
2. 实验原理斐林氏溶液与还原糖共沸，其中斐林氏溶液中的Cu2+被还原糖还原为Cu20 （砖红色）时，反应达到终点，过量的还原糖使次甲基蓝指示剂蓝色褪去，显露出Cu2O 的红色即为终点。
3. 实验材料和用具1）试剂费林甲液：称取68.29g硫酸铜（CuSO4?5H2O）,溶于蒸馏水中并稀释到1000ml。
费林乙液：称取346g酒石酸钾钠及100g NaOH，溶于蒸馏水中，完全溶解后，用蒸馏水稀释到1000ml，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。
0.25%葡萄糖标准溶液：准确称取 2.500g经98-105 C干燥至恒重的无水葡萄糖，加蒸馏水溶解后移入1000ml容量瓶中，加入5ml浓HCI （防止微生物生长），用蒸馏水稀释到1000ml。
2）器具电热恒温水浴锅，调温电炉，250ml 锥形瓶，滴定管。
4. 操作步骤1） 标定预备试验：吸取费林溶液 A 、B 各5.00 mL 于250 mL 三角瓶中，加 50 mL 水，摇 匀，在电炉上加热至沸， 在沸腾状态下用制备好的葡萄糖标准溶液滴定， 当溶液的蓝色将消 失呈红色时， 加 2 滴次甲基蓝指示液， 继续滴至蓝色消失， 记录消耗的葡萄糖标准溶液的体 积。
2） 标定正式试验：戏取费林溶液 A 、 B 各 5.00 mL 于 250 mL 三角瓶中，加 50 mL 水和比 预备试验少 1 mL 的葡萄糖标准溶液，加热至沸，并保持 2 min ，加 2 滴次甲基蓝指示液， 在沸腾状态下于 1 min 内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。
计算式中：F ――费林溶液 A 、B 各5 mL 相当于葡萄糖的克数，g ；m ——称取葡萄糖的质量，g ；V ――消耗葡萄糖标准溶液的总体积， mL 。
3） 葡萄酒样品还原糖测定：准确吸取一定量的样品（ V1 ）于 100 mL 容量瓶中，使之所含还原糖量为 0.2〜0.4g ,加水定容至刻度。
吸取费林溶液A 、B 各5.00 mL 于250 mL 三角 瓶中，加50 mL 水和一定量的试样（试样所含还原糖量为 0.2-0.4g ），加热至沸，并保持2 min , 加 2 滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于 1 min 内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗 的葡萄糖标准溶液的总体积。
按式（ 4）计算。
4） 葡萄酒样品总糖测定：准确吸取一定量的样品（ V1 ）于100mL 容量瓶中，使之所含总糖量为0.2〜0.4 g ，加5 mL 盐酸溶液，加水至20 mL ,摇匀。
于68 ± 1C 水浴上水解 15 min , 取出，冷却。
用 200 g ／L 氢氧化钠溶液中和至中性， （加入 2 滴酚酞，用 NaOH 溶液滴定至 微红色）。
调温至20C,加水定容至刻度（V2）。
吸取费林溶液 A 、B 各5.00 mL 于250 mL 三角瓶中，力口 50 mL 水和一定量的试样（试样所含总糖量为 0.2-0.4g ），加热至沸，并保持2 min ，加2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于1 min 内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。
