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从土壤中筛选产淀粉酶的菌株(四川化工职业技术学院食品1131)总述：查资料可知在土壤中从在多种可产淀粉酶的菌种，并且芽孢杆菌是不错的菌种，因此，采集土样，对土壤中的芽孢杆菌进行分离纯化，就可得到理想菌株。
在菌株的初选过程中采用涂布平板法，把配好的培养基灭菌后倒成平板，再把稀释好的土样涂布到平板上，置于适宜的条件下进行培养。
24h后对其进行鉴定，鉴定的方法是在培养好的菌株上滴加淀粉溶液，周围出现透明圈的为产淀粉酶的菌株，并且透明圈与菌落直径的比值越大，说明菌种越纯或菌株的生产性能越高。
然后再进行复选，复选时采用平板划线法或斜面划线法，挑取的菌落为透明圈与菌落直径比值较大的，进行多步筛选就可得到较纯的菌株。
实验流程待测数据：透明圈直径菌落直径摘要：查资料可知枯草芽孢杆菌能产生淀粉酶，因此从四川化工职业技术学院的土壤中筛选产淀粉酶的细菌菌株，利用五点取样采集土样，再用涂布平板法对菌株进行初步培养，在培养出的菌落周围滴淀粉溶液，对周围出现透明圈的菌落在进行平板划线培养，在地如淀粉溶液鉴定，对周围出现透明圈的菌落进行斜面划线培养，就可得到较纯的产淀粉酶的菌株。
引言：芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一。
早在1835年，Ehrenberg所描述的“Vibriosubtilis”即是现在大家熟悉的“枯草芽孢杆菌”，它是由Cohn于1872年正式命名的，现作为芽孢杆菌属(Bacillaceae)的模式菌株[1]。
从生物学特性来讲，枯草芽孢杆菌具有典型的芽孢杆菌特征，其细胞呈直杆状，大小(0.8-1.2)μm×(1.5-4.0)μm，单个，革兰氏染色阳性，着色均匀，可产荚膜，运动(周生鞭毛)；芽孢中生或近中生，小于或等于细胞宽，呈椭圆至圆柱状；菌落粗糙，不透明，扩张，污白色或微带黄色；能液化明胶，胨化牛奶，还原硝酸盐，水解淀粉，为典型好氧菌[2]。
1997年，Kunst F.等人首先完成了枯草芽孢杆菌的完整基因组序列测定，并将结果发表在《Nature》杂志上[3]。
功能微生物（淀粉酶产生菌）的筛选、培养与选育22100934 程雅楠摘要：以产淀粉酶细菌的筛选和选育为目标，通过培养基制备及灭菌、菌种的分离筛选与纯化、菌种的鉴定、培养条件的优化以及淀粉酶产生菌的紫外诱变育种等五个过程，并测定了诱变后菌株的16s序列，初步掌握了对某菌种进行筛选、选育及诱变的必需步骤。
关键词：产淀粉酶细菌筛选选育诱变育种淀粉酶是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一，为了提高淀粉酶的生产水平，首先通过淀粉培养基从土壤中筛选出产淀粉酶的活性菌株，对菌株初步鉴定后进行紫外线诱变，筛选出产量高、性状优良的突变菌株。
淀粉酶主要来源于植物和微生物，并通过发酵完成生产，因此筛选出高产、稳定的淀粉酶产生菌是淀粉酶生产的尤为重要。
此次试验试图从土壤中分离出产淀粉酶的细菌，通过紫外线诱变育种等条件优化来得到高产、稳定的淀粉酶产生菌株。
以达到加深对菌种选育的认识、掌握紫外线诱变育种的原理和方法、掌握初步纯化淀粉酶的方法的实验目的。
1材料和方法1.1材料1.1.1 来源：南师大北区教学楼附近的土壤。
1.1..2培养基：淀粉培养基的配制①固体培养基膏 3g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，可溶性淀粉2g/L，琼脂 20g/L，pH7.0～7.2。
②液体培养基：牛肉膏 3g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，可溶性淀粉2g/L，琼脂 20g/L，pH7.0～7.2。
优化条件培养基配制：①淀粉3g/L，蛋白胨 10g/L，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g， pH 4.0 。
②淀粉3g/L，蛋白胨 10g/L， K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g， pH 7.2 。
碳源培养基：①淀粉 3g，蛋白胨 10g，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，去离子水 1000mL pH 7.2。
产淀粉酶菌株的分离及筛选摘要：【实验目的】1学习从土壤等环境中分离微生物的技术。
2了解产淀粉酶菌株的分离方法。
3观察产淀粉酶菌的形态特点，并分析不同条件下酶的特性。
【实验原理】淀粉酶广泛在于动植物和微生物中，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂.。
【实验目的】1学习从土壤等环境中分离微生物的技术。
2了解产淀粉酶菌株的分离方法。
3观察产淀粉酶菌的形态特点，并分析不同条件下酶的特性。
【实验原理】淀粉酶广泛在于动植物和微生物中，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。
淀粉酶种类繁多，特点各异，可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域。
在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程均有重要价值，如添加高温淀粉酶可提高啤酒质量，中温蒸煮条件下添加适当耐高温a-淀粉酶可提高糖化率及酒精出酒率，降低甲醇含量，提高酒精质量，同时可提高设备利用率等。
淀粉酶在面包焙烤过程中分解淀粉产生的可溶性糖被酵母转化成酒精和CO2气体，不仅能增加面包体积，同时还有改善面包表皮色泽、提高面包软度、延长保质期的作用，对面包冷却和冷冻也有重要作用。
由于微生物数量多，繁殖快，工业生产主要采用向生物发酵法大量生产该制剂。
本实验从土壤中分离的淀粉酶产生菌从温度、pH值两方面探讨其产酶的最适条件。
通过平板培养法，从样品中初步分离出淀粉产生菌株，再通过单菌落培养从而获得比较纯的菌种。
然后对其进行二级扩大培养，最终测定液体培养基菌液中被酶分解得到的葡萄糖含量来讨论菌株的最适条件（温度、pH值等），为工业街道淀粉酶及饲料添加剂提供候选菌株。
【仪器、材料和试剂】（一）仪器1、恒温培养箱2、高压蒸气灭菌锅3、摇床4、恒温水浴锅5、生物显微镜6、电子天平（二）材料样品一：存放过久发霉的麦芽和周围粉尘样品二：米饭生产线附近草坪上的土壤（三）试剂与器材1、锥形瓶（50ml、100ml、500ml等）2、培养皿（25个左右）3、大小试管（30个左右）4、移液枪（1000μl、100μl）及大小枪头若干5、酒精灯、接种针等6、牛肉膏或酵母膏7、蛋白胨8、NaCl9、可溶性淀粉10、琼脂11、卢戈氏碘液11、草酸铵结晶紫12、碘液13、95%酒精14、蕃红染色液15、蒽胴试剂（现配）16、葡萄糖标准液(0.1 g/L)实验环节1 产淀粉酶菌株的初筛【实验步骤】1、称取一个样品5g，倒入盛有45mL无菌水带塞的三角锥形瓶中，摇床振荡30min制成样品悬液记为10-1土壤稀释液；2、用无菌移液管吸取10-1的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中吹吸数次混匀即为10-2稀释液，照此方法分别制成10-2~10-9稀释液；3、分别取10-5、10-6、10-7、10-8、10-9土壤稀释液各0.5mL，涂布于平板培养基表面，一个稀释度涂布接种2块平板，37℃下恒温培养16h ；4、待长出菌落后滴加卢戈氏碘液，挑取有明显淀粉水解圈的单菌落，作为初筛菌株。
“产淀粉酶菌株的筛选”设计方案产淀粉酶菌株的筛选是一项重要的研究工作，它可以满足很多工业和农业领域的需求。
下面是一个设计方案，包含步骤、实验条件和分析方法。
1.步骤（1）菌株的收集和培养首先，需要收集不同环境中的样品，如土壤、水体、植物表面等。
将样品分离培养在富含淀粉的琼脂培养基中。
培养过程中，需保持适宜的温度（通常在30℃左右）和适宜的pH（通常为6-7）。
（2）淀粉酶活性筛选将分离培养基中的菌株进行淀粉酶活性筛选。
取一小部分菌株涂抹到含有淀粉的琼脂培养基上，培养一段时间后在培养皿上观察是否产生明显的透明圈。
透明圈的出现表示淀粉酶活性较高的菌株。
（3）淀粉酶活性检测和比较从产生透明圈的培养皿中挑取具有高活性的菌落，进行淀粉酶活性检测。
可采用碘液滴加法，在含淀粉的琼脂培养基上，滴上一滴碘液，观察出现的蓝色溶解圈的明暗程度，可以初步评估淀粉酶活性的强弱。
（4）纯化和鉴定筛选出具有较高淀粉酶活性的菌株后，通过纯化和鉴定，进一步确定其产淀粉酶的能力以及体外条件如温度和pH对淀粉酶活性的影响。
可采用离心、柱层析等技术对菌株进行纯化。
通过测量在不同条件下的淀粉酶活性，确定最适宜的条件。
2.实验条件（1）培养条件：温度为30℃，pH为6-7（2）培养基：含淀粉和琼脂的培养基。
（3）检测条件：培养基含有淀粉，通过碘液滴加法观察形成的蓝色溶解圈明暗程度。
3.分析方法（1）测量淀粉酶活性采用I2-KI法测定淀粉酶活性。
将一定量的菌株培养液加入含淀粉的缓冲液中，反应一段时间后，加入碘液和KI溶液，混匀后通过测量吸光度来确定淀粉转化的程度。
（2）蛋白质含量测定通过BCA方法测定菌株培养液中的蛋白质含量。
将菌株培养液样品与BCA试剂混合，在一定温度下测量吸光度来确定蛋白质含量。
（3）酶动力学参数分析采用酶动力学参数分析方法，如麦克斯韦–玛尔特尔方程等，通过测定在不同底物浓度下的淀粉酶活性，来确定酶的最适底物浓度、最适酶浓度以及酶的最大反应速率。
生物技术综合实验——淀粉酶产生菌的初步筛选一、实验目的学习从自然界中筛选分离淀粉酶产生菌株。
二、实验内容淀粉酶产生菌的筛选和分离。
三、实验原理在筛选培养基平板上，可溶性淀粉被目的菌株产生的淀粉酶水解，形成透明圈。
不同种类的微生物产生的淀粉酶的种类和活力各不相同，对可溶性淀粉的水解能力各不相同，所形成的水解圈与菌落大小比值故而不同，因而根据其比值可初步断定其对可溶性淀粉的水解能力。
许多细菌和霉菌产生淀粉酶，特别是一些芽孢杆菌，因此，本实验将土壤样品加热处理后，将其接种到筛选培养基平板进行培养，根据平板的水解圈做初筛，从中筛选出产淀粉酶活性较好的菌株进行保藏。
四、实验材料和用具1、材料：土壤样品2、试剂：牛肉膏蛋白胨筛选培养基平板（含可溶性淀粉1%）、45mL无菌水瓶3、仪器及用具：恒温培养箱、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、摇床、酒精灯、牙签、移液枪、试管、涂布器、量筒等。
五、操作步骤（一）准备材料1、筛选固体培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入可溶性淀粉（1%），配制600mL，制备30个平板。
2、含45mL水的三角瓶5瓶，200ul枪头及枪头盒3盒，牙签3瓶，涂布器3包，灭菌处理。
（二）菌种分离1、土壤采集选取采集地点地表植被根系周围的土壤，首先去除地表浮土，然后挖取2-5cm深的土壤样品，每个样品约取20g土壤，装入塑料袋内，备用。
2、制备菌悬液取5g土壤样品置于含45ml无菌水的三角瓶中，用振荡器震荡10分钟，在90度水浴锅中处理15分钟。
3、涂布平板培养与分离吸取100ul悬浮液，用涂布器涂布于筛选培养基平板，待液体充分被吸收后，置于37℃培养箱中培养48h。
每组做2个平板。
（三）菌种初步筛选在平板中加入少量卢戈氏碘液，观察菌落形成透明水解圈情况，用无菌牙签挑取产水解圈的菌落，转接到新的筛选培养基中，每个平板上接种16个菌种，每组接种2个平板，置于37℃培养24h。
在平板内加入卢戈氏碘液，根据单菌落透明圈直径与菌落直径比值(H/C)大小进行初筛，选择水解圈直径与菌落直径比值大的菌株，从中选取淀粉酶活力相对较高的菌株。
第24卷第3期沈阳化工大学学报JOURNALOFSHENYANGUNIVERSITYOFCHEMICALTECHNOLOGY2010.09Vo.l24 No.3Sep.2010文章编号: 1004-4639(2010)03-0203-06土壤中淀粉酶产生菌的筛选及产酶条件优化雷晓燕(沈阳化工大学环境与生物工程学院,辽宁沈阳110142)摘要: 为筛选淀粉酶的高产菌株,利用淀粉水解圈作为筛选模型,从淀粉厂附近土壤中筛选得到产淀粉酶能力较强的细菌B5.对其产酶条件进行优化,最终得到最佳碳源为质量分数为2 0%的淀粉,最佳氮源为质量分数为0 5%的酵母膏加质量分数为0 5%的蛋白胨,最适初始pH值为6 0,最适培养温度为37 ,最适溶氧量为50mL摇瓶装15mL培养基,最佳产酶时间为48h,培养基中同时补充质量分数为0 05%的MgSO4、质量分数为0 05%的CaCl2和质量分数为0 005%的FeSO4时可大幅提高酶活力.菌株B5液体发酵产酶活力最高可达158 89U/g,该淀粉酶最适反应温度为42 ,最适反应pH值为5 0.关键词: 淀粉酶; 水解圈; 酶活力中图分类号: Q939 9 文献标识码: A淀粉酶(Amylase)是水解淀粉和糖原的酶类的总称,广泛存在于动植物和微生物中,是最早实现工业生产并且迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种[1]但适合商业生产需要的菌株仍然很少,在淀粉酶生产过程中选择适合的菌株是最重要的前提条件.本文以土壤作为原料,从中筛选出具有产淀粉酶能力的出发菌株,并对所得的出发菌株进行产酶条件的考察和优化,进一步提高其产酶能力,为使其最终能应用于工业生产、带来经济效益做大量的准备工作..特别是20世纪60年代以来,由于酶法生产葡萄糖,以及用葡萄糖生产异构糖浆的大规模工业化,淀粉酶的需要量越来越大,几乎占整个酶制剂总产量的50%以上[2].淀粉酶根据其作用方式可分为淀粉酶(EC3 2 1 1)与淀粉酶(EC3 2 1 2). 淀粉酶广泛分布于动物(唾液、胰脏等)、植物(麦芽、山萮菜)及微生物中[3]1 实验材料与方法1 1 材料1 1 1 菌种细菌B5,由沈阳某淀粉厂附近土壤中筛选得到.1 12 培养基(1)斜面培养基:可溶性淀粉,质量分数2 0%;蛋白胨,质量分数0 5%;NaC,l质量分数0 5%;KH2PO4,质量分数0 1%;KNO3,质量分数0 1%;琼脂,质量分数2 0%;水100mL;pH值6 0.(2)分离平板培养基:可溶性淀粉,质量分.微生物的许多种类都能产生淀粉酶,Buchanan和Tamuri等人描述了数百种嗜热真菌和上千种细菌可产生淀粉酶,仅Bacillus属48个种中就有32个种能产生淀粉酶.淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域[5][4].因为淀粉酶的用途广泛,各国在对淀粉酶产生菌的筛选方面都做了大量的研[6-8]究工作,目前所得淀粉酶活力最高可达到260U/mL左右.虽然不少微生物能产生淀粉酶,收稿日期: 2009-02-09作者简介: 雷晓燕(1972-),女,陕西绥德人,讲师,硕士,主要从事生物技术教学和科研工作.204沈阳化工大学学报 2010年数2 0%;酵母膏,质量分数0 5%;蛋白胨,质量分数0 5%;NaC,l质量分数05%;KH2PO4,质量分数0 1%;琼脂,质量分数2 0%;水100mL;pH值6 0.(3)种子培养基:可溶性淀粉,质量分数2 0%;酵母膏,质量分数0 5%;蛋白胨,质量分数0 5%;NaC,l质量分数0 5%;KH2PO4,质量分数0 1%;水100mL;pH值6 0. (4)产酶液体培养基:可溶性淀粉,质量分数2 0%;酵母膏,质量分数0 5%;蛋白胨,质量分数0 5%;NaC,l质量分数0 5%;KH2PO4,质量分数0 1%;CaCl2 2H2O,质量分数0 05%;MgSO4 7H2O,质量分数0 05%;FeSO4 7H2O,质量分数0 005%;水100mL;pH 值6 0.1 1 3 主要试剂培养基成分为市售分析纯和生化试剂.1 1 4 主要仪器DHP 420电热恒温培养箱(光明医疗仪器厂),LDZX 40B!型立式自动电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂),ZD 85气浴恒温振荡器(常州国华电器有限公司),WD900微波炉(顺德市格蓝仕电器实业有限公司),HNP 1水平流形超净工作台(南通沪南科学仪器有限公司),101 2A型数显式电热恒温干燥箱(上海阳光实验仪器有限公司),FA1104分析天平(上海精科天平有限公司),BC/BD 428A卧式冷藏冷冻转换柜(青岛海尔特种电冰柜有限公司),SP 2000722型可见分光光度计(上海莱奥光学仪器有限公司).1 2 方法1 2 1 菌种筛选初筛:从沈阳某淀粉厂附近采集土样,称取5g土样,放入装有45mL无菌水的三角瓶中,震荡20min后静置5min,然后进行浓度梯度稀释-6-4-5-6到10,分别在10、10、10浓度下各取1mL土壤稀释液制成混菌平板,将培养皿放入37 培养箱中培养24h.取出培养好的平皿,在长出的菌落上滴加碘液,菌落周围如有无色透明圈出现,说明淀粉被水解,即该菌株能产生淀粉酶,编号保存.复筛:从冰箱中取出所有初筛得到的菌株,转接试管斜面活化,37 下恒温培养24h.将所有菌种分别点种到分离培养基平板上进行培养,待菌落长成后向菌落上滴加碘液,比较淀粉水解圈大小,挑取d0/d1(d0为水解圈直径,d1为菌落直径)较大的菌株连续进行3次平板点种培养,选取d0/d1值最大的菌株作为本实验出发菌株.1 2 2 淀粉酶活力的测定[9]发酵液4000r/min离心20min,取上清液,即为粗酶液.取5mL质量分数为0 5%的可溶性淀粉溶液,在37 水浴中预热10min,加入适当稀释的酶液0 5mL,准确反应5min后,用5mL浓度为0 1mol/L的HCl终止反应.取0 5mL反应液与5mL稀碘液显色,在620nm处测吸光度.以0 5mL蒸馏水代替0 5mL 反应液为空白,以不加酶液(加同体积的缓冲液)的管为对照.酶活定义:在37 、pH=6 0条件下,5min内水解1mg淀粉的酶量为一个活力单位.酶活力根据以下公式计算: 酶活=(R0-R)/R0∀50∀D∀4.式中,R0、R分别表示对照和反应液的光密度,D为粗酶液的稀释倍数.调整D使(R0-R)/R在0 2~0 7之间,4为转换系数,无单位.1 2 3 最佳碳源的确定取出发菌株活化,然后取一环接入种子培养基中培养,于24h后分别取1mL培养液,加入到2 0%淀粉,2 0%麦芽糖,2 0%乳糖,2 0%蔗糖,2 0%葡萄糖5种不同碳源的产酶培养基中,于37 摇床培养48h.分别离心收集粗酶液,测定其淀粉酶活力,根据所测定的结果确定最佳碳源.1 2 4 最佳氮源的确定取出发菌株活化,然后取一环接入种子培养基中培养,于24h后分别取1mL培养液,加入到氮源分别为0 5%(质量分数,下同)牛肉膏,0 5%酵母膏,0 5%蛋白胨,0 5%牛肉膏+0 5%蛋白胨,0 5%酵母膏+0 5%蛋白胨5种不同氮源的产酶培养基中.于37 摇床培养48h.分别离心收集粗酶液,测定其淀粉酶活力,根据所测定的结果确定最佳氮源.第3期雷晓燕:土壤中淀粉酶产生菌的筛选及产酶条件优化 2051 2 5 最佳培养基初始pH值的确定取出发菌株活化,然后取一环接入种子培养基中培养,24h后分别取1mL培养液,加入到pH值分别为5 0、6 0、7 0、8 0、9 0,碳源和氮源已优化的产酶培养基中,37 下培养48h.分别离心收集粗酶液,测定其淀粉酶活力,根据所测定的结果确定最佳培养基的初始pH值.1 2 6 最佳培养温度的确定取出发菌株活化,然后取一环接入种子培养基中培养,24h后分别取1mL培养液,加入碳源、氮源和pH值已优化的产酶培养基中,分别于33 、35 、37 、39 、41 下培养48h.分别离心收集粗酶液,测定其淀粉酶活力,根据所测定的结果确定最佳培养温度.1 2 7 最佳溶氧量的确定取出发菌株活化,然后取一环接入种子培养基中培养,24h后分别取1mL培养液,接入已优化碳源、氮源和pH值的产酶培养基中培养,产酶培养基的装液量分别为10mL、15mL、20mL、25mL、30mL,37 下培养48h,分别离心收集粗酶液,测定其淀粉酶活力,根据所测定的结果确定最佳溶氧量.1 2 8 最佳产酶时间的确定取出发菌株活化,然后取一环接入种子培养基中培养,24h后分别取1mL培养液,接入已优化碳源、氮源和pH值的产酶培养基中培养,分别于0h,12h,24h,36h,48h,60h 取样,测定发酵液的酶活力,根据所测定的结果确定最佳产酶时间.1 2 9 离子对产酶的影响通过向培养基中添加质量分数为0 05%的MgSO4、质量分数为0 05%的CaCl2和质量分数为0 005%的FeSO4等不同离子进行产酶实验,培养48h,测定酶活力,根据测定结果确定最适添加的离子.1 2 10 酶反应最适pH值的确定分别用pH值为4 0、5 0、6 0、7 0、8 0、9 0的缓冲溶液配制可溶性淀粉液,将在最适条件下培养获得的粗酶液分别在以上各种pH值条件下测定其淀粉酶活力,根据所测得的结果确定淀粉酶反应的最适pH值.1 2 11 酶反应最适温度的确定将在最适条件下培养获得的粗酶液分别在27 、32 、37 、42 、47 、52 等各种不同温度下测定淀粉酶活力,根据所测得的结果确定淀粉酶反应的最适温度.2 实验结果2 1 初筛结果土样经稀释并在淀粉培养基平板上培养后,共挑选出24株能水解淀粉的细菌,分别将24株细菌接种到斜面培养基上,编号为B1~B24,菌株产生水解圈的情况如图1所示.图1 淀粉酶产生菌产生的淀粉水解圈Fig.1 Hydrolysiscircleofstarchproducedby astrainwhichcanproduceamylase2 2 复筛结果将所有初筛得到的菌种分别点种到淀粉培养基平板上进行培养,待菌落长成后向菌落上滴加碘液,比较淀粉水解圈大小,挑取d0/d1(d0为水解圈直径,d1为菌落直径)较大的5株菌株连续进行3次平板点种培养,最终选取d0/d1值最大的菌株B5作为本实验出发菌株.将B5菌株接多支斜面,经培养后于低温保存.复筛结果见表1.表1 复筛结果Table1 Resultsofre screening编号12345水解圈直径d0/cm2 402 901 701 901 90菌落直径d1/cm1 301 801 001 200 60d0/d11 851 611 701 583 17206沈阳化工大学学报 2010年2 3菌株产酶条件的优化发酵过程中影响菌株生长、产酶的主要因素为:碳源、氮源、发酵培养基的初始pH值、发酵温度、溶氧量、金属离子及产酶时间.对上述因素进行全面考察,以确定菌株的最佳产酶条件.2.3.1 碳源对细菌B5产酶能力的影响分别在5种含不同碳源的发酵培养基中培养细菌B5,37 摇床培养48h.经过对发酵液中淀粉酶活力的测定,可知碳源为质量分数为2 0%的淀粉时细菌B5产酶活力最高,测定结果见图2.37 下培养48h,测定不同pH值下淀粉酶活力,结果见图4,根据所测定的结果确定最佳培养基的初始pH值为6 0.图4 培养基初始pH值对菌株B5产酶能力的影响Fig.4 TheimpactofinitialpHonBacteriumB5inproducingamylase2 3 4 培养温度对菌株B5产酶能力的影响将出发菌株B5分别在5种不同温度下进行培养,48h后离心收集粗酶液,测定淀粉酶活力,结果见图5.由图5结果可以看出,37 培养时菌株B5产酶能力最强.图2 碳源对细菌B5产酶的影响Fig.2 TheimpactofcarbonsourceonBacteriumB5inproducingamylase2 3 2 氮源对细菌B5产酶能力的影响分别在含5种不同氮源的发酵培养基中培养细菌B5,37 摇床培养48h.经过对发酵液中淀粉酶活力的测定,可知氮源为质量分数0 5%酵母膏+质量分数0 5%蛋白胨时细菌B5产酶活力最高,测定结果见图3.图5 培养温度对菌株B5产酶能力的影响Fig.5 Theimpactofculturetemperatureon BacteriumB5inproducingamylase2 3 5 溶氧量对菌株B5产酶能力的影响将菌株B5在不同溶氧情况下进行培养,48h后离心收集粗酶液,测定淀粉酶活力,结果见图6.由图6可以看出,50mL摇瓶中装液量为15mL时为最佳溶氧量.图3 氮源对菌株B5产酶能力的影响Fig.3 Theimpactofnitrogensourceon BacteriumB5inproducingamylase图6 溶氧对菌株B5产酶能力的影响Fig.6 Theimpactofdissolvedoxygenon BacteriumB5inproducingamylase2 3 3 培养基初始pH值对菌株B5产酶能力的影响将碳源和氮源已优化的产酶培养基pH值7892 3 6 最佳产酶时间的确定B5在不第3期雷晓燕:土壤中淀粉酶产生菌的筛选及产酶条件优化 207同时间点取样测定酶活力,结果如图7所示.由图7可见以看出,菌株B5的最佳产酶时间是48h.由图9可以看出,pH值为5 0时淀粉酶活力最强.2 4 2 酶反应最适温度的确定分别在各种不同温度下测定菌株B5所产淀粉酶的酶活力,结果见图10.由图10可以看出,在42 时酶活力最强,此时酶活力可达158 9U/mL.图7 菌株B5淀粉酶最佳产生时间的确定结果Fig.7 ThedeterminationofoptimaltimeinproducingamylasebyBacteriumB52 3 7 离子对产酶的影响2+2+2+Mg、Ca、Fe是很多种酶的激活剂并且可以提高酶活力,为测定这几种离子对菌株B5所产淀粉酶是否有提高酶活力的作用,向培养基中单一或混合添加几种离子进行发酵产酶实验,酶活测定结果见图8.由图8可以看出,同时添加3种离子对菌株B5产酶能力有较大的影响.图10 酶反应最适温度的测定结果Fig.10 Thedeterminationofoptimalreaction temperatureofamylase在最适条件下菌株B5所产淀粉酶活力从最初的92 6U/mL提高到158 9U/mL,酶活力提高效果明显.3 结论实验中筛选出的细菌B5具有产淀粉酶的能力,菌株产酶能力通常会受到菌株培养时碳源、氮源、培养基初始pH值、培养温度、溶氧、离子等许多因素的影响,另外菌株所产酶的活力也图8 离子对菌株B5产酶的影响Fig.8 TheimpactofiononBacteriumB5inproducingamylase会受到酶发挥作用时最适温度和最适pH值的影响.综合考察以上各种影响因素对酶活力的影响后,确定菌株B5产淀粉酶的最适培养条件以及淀粉酶发挥作用时的最适条件.以淀粉厂附近土样为原料,通过淀粉水解圈筛选模型筛选得到一株产淀粉酶活力较强的细菌B5.通过对B5产酶条件的考察得出:培养基中最佳碳源为质量分数2%的淀粉,最佳氮源为质量分数0 5%的酵母膏加质量分数0 5%的蛋白胨,最适初始pH值为6 0,最适培养温度为37 ,最适溶氧量为50mL摇瓶装15mL培养基,最佳产酶时间是48h,培养基中同时补充质量分数0 05%的MgSO4、质量分数0 05%的CaCl2和质量分数0 005%的FeSO4时可大幅提高酶活力.该淀粉酶最适反应温度为42 ,最适反应pH值为5 0.菌株B5液2 4 菌株B5所产淀粉酶酶学性质的研究2 4 1 酶反应最适pH值的确定分别用不同pH值的缓冲溶液配制可溶性淀粉液,测定淀粉酶活力,结果见图9.图9 酶反应最适pH值的确定结果Fig.9 ThedeterminationofoptmialreactionpHofamylase体发酵产酶活力最高可达158 9U/mL,该菌株如果再进一步进行诱变处理酶活力还有提升空208沈阳化工大学学报 2010年[6] ShojiH,SugimotoT,HosoiK,eta.lSimultaneous间.本实验方法简便、直观,可快速、高效地筛选出淀粉酶产生菌. ProductionofGlucoamylaseandAcidStable am ylaseUsingNovelSubmergedCultureofAspergillusKawachiiNBRC4308[J].JournalofBios cienceandBioengineering,2007,103(2):203-205.[7] NagamineK,MurashimaK,KatoT,eta.lModeof amylaseProductionbytheShochuKojiMoldAspergillusKawachii[J].Bioscience,BiotechnologyandBiochemistry,2003,67(10):2194-2202.[8] SivaramakrishnanS,GangadharanD,NampoothiriKM,eta.lAmylasefromMicrobialSources###AnOverviewonRecentDevelopments[J].FoodTech nolBiotechno,l2006,44(2):173-184.[9] 沈萍.微生物学[M].2版.北京:高等教育出版社,2002:63-65.参考文献:[1] 谷军. 淀粉酶的生产与应用[J].生物技术,1994,4(3):1-5.[2] 白坤,于德贵,周冬颖. 淀粉酶的性质及其液化作用[J].中国酿造,1995(5):1-5.[3] 张强,刘成君,蒋芳,等.耐高温淀粉酶产生菌的分离鉴定及发酵条件与酶性质研究[J].食品与发酵工业,2005,31(2):34-37.[4] 罗志刚,杨景峰,罗发兴. 淀粉酶的性质及应用[J].食品研究与研发,2007,28(8):1-18.[5] 张丽苹,徐岩,金建中.酸性淀粉酶的研究与应用[J].酿酒,2002,29(3):4-15. ScreeningofBacteriumProducingAmylasefromtheSoiland OptmiizationoftheConditionforEnzymeProductionLEIXiao yan(ShenyangUniversityofChemicalTechnology,Shenyang110142,China)Abstrac:tInordertoscreenabacteriumwhichcanproduceamylase,starchhydrolysiscircleisusedinthise xperimentasascreeningmode.lTheStrainB5isachievedbyscreeningfromthesoilnearthestar chfactory.Aftertheoptimizationofthecondition,thecapabilityofB5isimproved.Theoptimal conditionis:carbonsourceisstarch2 0%;nitrogensourceisyeastextract0 5%andpeptone0 5%;theinitialpHis60;andtheoptimumincubationtemperatureis37 ;theappropriateloadis15mLculturemediumi n50mLflask;theoptimaltimeforproducingamylaseis48h;when0 05%MgSO4,005%CaCl2,and0005%FeSO4isaddedtothemedium,theamylaseactivitycanbeimprovedgreatly.Theamylase activ ityofStrainB5inliquidfermentationcanreachashighas15889U/mL.Theoptimalreactiontemperatureofamylaseis42 ,andtheoptimumreactionpHofamylaseis50.Theexperimentalmethodissim pleandintuitive,andcanbeusedtoscreenamylase producingstrainquicklyandefficiently.Keywords: amylase; hydrolysiscircle; enzymeactivity。
α-淀粉酶产生菌的筛选鉴定及其发酵条件的优化
李鑫玲;孙晓菲;李欣
【期刊名称】《食品研究与开发》
【年(卷),期】2016(037)012
【摘要】从土壤样本中分离出一株产α-淀粉酶的菌株，经形态学初步鉴定为热红短芽孢杆菌。
对该菌株产酶条件进行了优化，确定其最佳碳源为麸皮，最佳氮源为明胶，最佳pH值为10，最佳初始装液量为60 mL。
【总页数】3页(P163-165)
【作者】李鑫玲;孙晓菲;李欣
【作者单位】河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471003;河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471003;河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471003
【正文语种】中文
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高温淀粉酶高产菌株筛选及产酶条件优化作者：易征璇赵彤师旋王征李立恒来源：《现代农业科技》2014年第07期摘要为筛选高温淀粉酶高产菌株，利用淀粉酶水解圈作筛选模型，从稻田中采集土样，筛选得到产淀粉酶能力较高的菌株E10。
为提高菌株产酶能力，进行了碳源种类及浓度，氮源种类及浓度，无机盐种类及浓度，pH值，种龄及接种量、温度、时间的单因素试验，并对发酵培养基及发酵条件进行了L9（34）正交优化试验。
结果表明：最佳产酶发酵培养基为2.0%麸皮、0.1%硝酸钾、0.25%氯化钙，最适初始pH值为6.0。
最适产酶条件为种龄24 h，接种量7 mL，于36 ℃下培养48 h。
在优化条件下，菌株产酶活力可达180.94 IU/mL。
关键词高温淀粉酶；高产菌株；筛选；发酵条件中图分类号 TQ925+.1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）07-0240-04Screening of High-yield Strain Producing Thermostable Amylase and Optimization of Enzyme ProductionYI Zheng-xuan ZHAO Tong SHI Xuan WANG Zheng LI Li-heng *（College of Bioscience and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha Hunan 410128）Abstract In order to screen a high-yield strain producing thermostable amylase，starch hydrolysis circle was employed as a screening model. The E10 strain achieved from the paddy field soil has high capacity of enzyme production. In order to improve the capability of enzyme production of E10，the single factor experiments was conducted for the kinds and concentrations of carbon source，the kinds and concentrations of nitrogen source，the kinds and concentrations of inorganic salt，pH value，seed age，inoculate volume，temperature and time，then the L9（34） orthogonal optimization test for the fermentation medium and conditions was carried out. The results showed that the best fermentation medium of the enzyme production of E10 was 2.0% wheat bran，0.1%KNO3，0.25% CaCl2，initial pH value of 6.0. The optimal fermentation conditions of the enzyme production of E10 were 24 hours of seed age，7 mL of inoculates volume，36 ℃ of culture temperature，48 hours of time. Under the optimized conditions，the enzyme production of E10 reached 180.94 IU/mL.Key words thermostable amylase；high-yield strain；screening；fermentation condition淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物中，是最早实现工业生产并且迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种[1]。
产淀粉酶菌株的筛选实验报告一、实验背景淀粉酶是一种常见的酶，广泛存在于微生物和植物中。
淀粉酶能够水解淀粉分子，将其分解成糖类分子，如葡萄糖、麦芽糖等。
淀粉酶广泛应用于食品、医药、环保等领域中。
制备高效的产淀粉酶菌株，对实现产业化生产具有重要意义。
二、实验目的通过筛选不同菌株的淀粉酶产量，选出产淀粉酶效果较好的菌株，为后续工业化生产提供依据。
三、实验步骤及方法1. 菌株的选取本实验选取了3株常见的淀粉酶产生菌株，分别为Bacillus subtilis、Aspergillus niger、Trichoderma reesei。
2. 菌株的培养将3株菌株接种到琼脂培养基中，经过静置培养后，选取菌落较为圆润、生长状态良好的菌落，移植至含有淀粉质的液体培养基中，进行淀粉酶产量的筛选实验。
3.淀粉酶活性的测定分别取3组接种液，以葡萄糖和淀粉为基质，分别加入菌液，进行淀粉酶活性测定。
具体步骤如下：(1)准备含1%淀粉质的液体培养基和0.5%葡萄糖液体培养基。
(2)将接种液投入含1%淀粉质的液体培养基中，加入0.1mol/L乙酸钠溶液，pH为5.6，放置于37℃水浴中反应30min，加入 1%伊红色溶液备用。
(3)将接种液投入含0.5%葡萄糖的液体培养基中，加入0.1mol/L乙酸钠溶液，pH为5.6，放置于37℃水浴中反应30min，加入1%伊红色溶液备用。
(4)通过比较加入菌液前后溶液颜色的深浅，计算出淀粉酶的酶活力。
4. 结果记录及分析根据上述实验步骤，在不同的液体培养基中测定了3株菌株的淀粉酶活性，并记录结果如下表所示：表1.不同菌株的淀粉酶活性| 菌株名称 | 淀粉酶酶活力 || ------------------ | --------------- || Bacillus subtilis | 0.19 U/mL || Aspergillus niger | 0.21 U/mL || Trichoderma reesei | 0.23 U/mL |根据上表结果可以看出，3株菌株在淀粉酶产量方面的效果有所不同。
实验1 淀粉酶产生菌（细菌）的筛选一、实验目的掌握完整的分离纯化淀粉酶产生菌的方法和技术二、基本原理土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养几天，细菌或者是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。
将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。
故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。
在培养基上滴碘液，淀粉被分解掉的部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断菌种产淀粉的能力。
三、材料与器材1、菌源校园土样2、培养基：淀粉培养基：蛋白胨10g，NaCl 5g，牛肉膏5g，可溶性淀粉2g，蒸馏水1000ml，琼脂15~20g，121℃高压灭菌锅灭菌20 min，待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒摇瓶若干。
3、器材培养皿若干个、1ml移液管1根、刮铲1把、锥形瓶若干个、高压灭菌锅、超净工作台、试管若干、摇床四、实验步骤1、选定采土点后，铲去表土层2-3cm，取3-10cm深层土壤10g，装入灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。
土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌相的变化。
2、称取土样10g，放入盛有90mL蒸馏水并带有玻璃珠的锥形瓶中，振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将细胞分散。
3、初筛：用一支1mL移液管从中吸取0.1mL土壤悬液加入盛有淀粉培养基的培养皿中，重复两次。
后置于培养箱中培养。
检测：培养出菌落后向培养皿均匀的喷洒碘液，有明显的透明圈的菌落即为活性较高的淀粉酶产生菌。
4、复筛：选取步骤3活性较高的淀粉酶产生菌菌落移植进盛有淀粉培养基的摇瓶中，放于摇床中培养。
测定：把所有摇瓶中的菌株发酵液用琼脂平板法测定一遍（同步重复2~3块板），将其中活性圈大而清晰的菌株发酵液进一步采用精确检测法测定，选出较优良的菌株2~3株，并移植进斜面中培养。
淀粉酶和蛋白酶产生菌产酶发酵条件的优化1 材料与方法1.1 材料1.1.1菌种：枯草芽孢杆菌菌( Bacillus subtilis)1.1.2 培养基1.1.2.1 淀粉酶种子培养基：蛋白胨1%（5g），牛肉膏0.3%-0.5%（1.5g），NaCl 0.5%（2.5g），可溶性淀粉0.2%（1g）(也有0.5%，1%，2%)，琼脂2%（10g），加自来水约500mL，加热溶解，调pH 7.0，加自来水定容至500mL。
分装于5个250mL三角瓶中，每瓶100mL（50mL移液管吸取或量筒精确量取），8层纱布封口后，0.1 M Pa灭菌20min。
1.1.2.2 淀粉酶摇瓶发酵培养基：玉米粉2.0 %（40g），黄豆饼粉1.5 %（30g），CaCl2 0.02 %（0.4g），MgSO4 0.02 %（0.4g），NaCl 0.25 %（5g），K2HPO4 0.2 %（4g），柠檬酸钠0.2%（4g），硫酸铵0.075 %（1.5g），Na2HPO40.2 %（4g），加自来水约2000mL，煮30min后4层纱布过滤后，滤液加自来水定容至2000mL（略多几十毫升，怕装不了40瓶），调pH值7. 0。
分装于40个150mL三角瓶中，每瓶50 mL（50mL移液管吸取或量筒精确量取），8层纱布封口后，0.1 M Pa灭菌20min。
（注：40瓶够做时间和温度的，PH另配2000ml）1.1.2.3 蛋白酶种子培养基：葡萄糖0.05%，NaCl 0.5%，K2HPO40.05%，KH2PO4 0.05%，干酪素1%，加自来水约500mL，加热溶解，调pH 7.0，加自来水定容至500mL。
分装于5个250三角瓶中，每瓶100mL（50mL移液管吸取或量筒精确量取），8层纱布封口后，0.1 M Pa灭菌20min。
具体配置：酪蛋白（即干酪素）先用0.2N NaOH溶解，倒入热水中加热搅拌至完全溶解；再加入其他药品，继续加热至完全融化；适量1N HCl调pH。
实验三淀粉酶产生菌产酶条件的优化一、目的和要求1.掌握紫外分光光度计的工作原理和操作方法2. 掌握掌握用DNS法测淀粉酶活的方法，了解淀粉水解圈初筛原理。
3.掌握培养基的配置原则，熟悉用正交实验优化产酶培养基的方法4.了解炭源、氮源、通气量、底物含量、温度、发酵初始pH值等理化因素对芽孢杆菌产酶的影响。
二实验原理一般使用的培养基包括适合于代谢产物生成和菌体生成所需要的碳源、氮源、无机盐、PH和其他物质等以有利于最终代谢物的产生。
研究各个成分对在终产物的影响采用单因素的方法实验处理和次数比较多，考虑不到所有成分的综合影响，需要采用数理统计的方法优化培养基的成分。
正交试验设计可以以比较少的实验处理数来判断出培养基的成分的最佳组合。
由于 2 h 之内酶的稳定性较好, 使得酶活大小与水解圈直径大小呈正相关, 并且此方法灵敏度高, 酶活大于 1 u/ mL 时即可进行比较。
由于菌落水解圈法是一个常用的方法, 其他胞外水解酶产生菌的初筛可能也存在类似的现象, 因此尝试使用通过对比H/C大小来优化产酶条件.淀粉酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解a —1，4—葡萄糖苷键生成葡萄糖。
碱性条件下，还原糖于3、5—二硝基水杨酸被还原为3—氨基—5—硝基水杨酸，还原糖则被氧化成糖酸及其他物质。
在一定范围内，还原糖的量与棕色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系，可在722型分光光度计540nm波长测定棕红色物质的吸光度值。
查标准曲线计算，可求出菌液中还原糖的含量，从而求出淀粉酶的活力，优化产酶条件。
三实验材料：蛋白胨、牛肉膏、可溶性淀粉、Nacl、无菌水、琼脂、发酵液、碘液0.2mol/LpH6.8 PBS缓冲液PBS母液的配制：0.2M Na2HPO4：称取71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于1000ml 水0.2M NaH2PO4：称取31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml 水各种浓度PB(pH=7.4)的配制：先配0.2M PB (pH=7.4，100ml)：取19ml 0.2mol/L的NaH2PO4，81ml 0.2mol/L 的Na2HPO4, 即可。
从土壤中分离和筛选产淀粉酶活性的芽孢杆菌及部分鉴定试验一、实验目的1、通过本实验的学习，学习掌握从环境中分离产淀粉酶菌株以及菌株初步鉴定的方法；2、巩固微生物分离纯化、细菌生理生化鉴定,对所学习过的微生物学实验方法进行综合技能训练；3、培养综合利用微生物学、生物化学等相关知识，自行设计、实施并判断实验结果的能力。
4、根据所学知识自主设计实验方案，在实验方案通过审核后组织实施，最终要求获得产淀粉酶的菌株。
二、实验原理1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。
待实验前取样即可。
2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。
在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。
3、芽孢是菌体生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。
它帮助菌体度过不良环境，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。
细菌富集一段时间后，生长环境不利，会产生芽孢，再在80-90℃温度下杀死菌体，可使芽孢得到富集。
4、芽孢杆菌属的共同特征是：革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP试验阳性；不产生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；营养体的最高生长温度大约从25℃到75℃以上；最低生长温度大约5℃到45℃；生长最低pH值，从—8到2左右；耐盐范围从低于2%的NaCl到25%NaCl；营养明胶（22℃）7天内液化1厘米或1厘米以上。
枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可产酸；作为营养生长的最低限培养基是无维生素的，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源。
5、在含有淀粉的鉴别培养基的平板上，具有产淀粉酶能力的芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。
