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从土壤中筛选产淀粉酶的菌株(四川化工职业技术学院食品1131)总述：查资料可知在土壤中从在多种可产淀粉酶的菌种，并且芽孢杆菌是不错的菌种，因此，采集土样，对土壤中的芽孢杆菌进行分离纯化，就可得到理想菌株。
在菌株的初选过程中采用涂布平板法，把配好的培养基灭菌后倒成平板，再把稀释好的土样涂布到平板上，置于适宜的条件下进行培养。
24h后对其进行鉴定，鉴定的方法是在培养好的菌株上滴加淀粉溶液，周围出现透明圈的为产淀粉酶的菌株，并且透明圈与菌落直径的比值越大，说明菌种越纯或菌株的生产性能越高。
然后再进行复选，复选时采用平板划线法或斜面划线法，挑取的菌落为透明圈与菌落直径比值较大的，进行多步筛选就可得到较纯的菌株。
实验流程待测数据：透明圈直径菌落直径摘要：查资料可知枯草芽孢杆菌能产生淀粉酶，因此从四川化工职业技术学院的土壤中筛选产淀粉酶的细菌菌株，利用五点取样采集土样，再用涂布平板法对菌株进行初步培养，在培养出的菌落周围滴淀粉溶液，对周围出现透明圈的菌落在进行平板划线培养，在地如淀粉溶液鉴定，对周围出现透明圈的菌落进行斜面划线培养，就可得到较纯的产淀粉酶的菌株。
引言：芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一。
早在1835年，Ehrenberg所描述的“Vibriosubtilis”即是现在大家熟悉的“枯草芽孢杆菌”，它是由Cohn于1872年正式命名的，现作为芽孢杆菌属(Bacillaceae)的模式菌株[1]。
从生物学特性来讲，枯草芽孢杆菌具有典型的芽孢杆菌特征，其细胞呈直杆状，大小(0.8-1.2)μm×(1.5-4.0)μm，单个，革兰氏染色阳性，着色均匀，可产荚膜，运动(周生鞭毛)；芽孢中生或近中生，小于或等于细胞宽，呈椭圆至圆柱状；菌落粗糙，不透明，扩张，污白色或微带黄色；能液化明胶，胨化牛奶，还原硝酸盐，水解淀粉，为典型好氧菌[2]。
1997年，Kunst F.等人首先完成了枯草芽孢杆菌的完整基因组序列测定，并将结果发表在《Nature》杂志上[3]。
功能微生物（淀粉酶产生菌）的筛选、培养与选育22100934 程雅楠摘要：以产淀粉酶细菌的筛选和选育为目标，通过培养基制备及灭菌、菌种的分离筛选与纯化、菌种的鉴定、培养条件的优化以及淀粉酶产生菌的紫外诱变育种等五个过程，并测定了诱变后菌株的16s序列，初步掌握了对某菌种进行筛选、选育及诱变的必需步骤。
关键词：产淀粉酶细菌筛选选育诱变育种淀粉酶是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一，为了提高淀粉酶的生产水平，首先通过淀粉培养基从土壤中筛选出产淀粉酶的活性菌株，对菌株初步鉴定后进行紫外线诱变，筛选出产量高、性状优良的突变菌株。
淀粉酶主要来源于植物和微生物，并通过发酵完成生产，因此筛选出高产、稳定的淀粉酶产生菌是淀粉酶生产的尤为重要。
此次试验试图从土壤中分离出产淀粉酶的细菌，通过紫外线诱变育种等条件优化来得到高产、稳定的淀粉酶产生菌株。
以达到加深对菌种选育的认识、掌握紫外线诱变育种的原理和方法、掌握初步纯化淀粉酶的方法的实验目的。
1材料和方法1.1材料1.1.1 来源：南师大北区教学楼附近的土壤。
1.1..2培养基：淀粉培养基的配制①固体培养基膏 3g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，可溶性淀粉2g/L，琼脂 20g/L，pH7.0～7.2。
②液体培养基：牛肉膏 3g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，可溶性淀粉2g/L，琼脂 20g/L，pH7.0～7.2。
优化条件培养基配制：①淀粉3g/L，蛋白胨 10g/L，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g， pH 4.0 。
②淀粉3g/L，蛋白胨 10g/L， K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g， pH 7.2 。
碳源培养基：①淀粉 3g，蛋白胨 10g，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，去离子水 1000mL pH 7.2。
产淀粉酶菌株的分离及筛选摘要：【实验目的】1学习从土壤等环境中分离微生物的技术。
2了解产淀粉酶菌株的分离方法。
3观察产淀粉酶菌的形态特点，并分析不同条件下酶的特性。
【实验原理】淀粉酶广泛在于动植物和微生物中，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂.。
【实验目的】1学习从土壤等环境中分离微生物的技术。
2了解产淀粉酶菌株的分离方法。
3观察产淀粉酶菌的形态特点，并分析不同条件下酶的特性。
【实验原理】淀粉酶广泛在于动植物和微生物中，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。
淀粉酶种类繁多，特点各异，可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域。
在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程均有重要价值，如添加高温淀粉酶可提高啤酒质量，中温蒸煮条件下添加适当耐高温a-淀粉酶可提高糖化率及酒精出酒率，降低甲醇含量，提高酒精质量，同时可提高设备利用率等。
淀粉酶在面包焙烤过程中分解淀粉产生的可溶性糖被酵母转化成酒精和CO2气体，不仅能增加面包体积，同时还有改善面包表皮色泽、提高面包软度、延长保质期的作用，对面包冷却和冷冻也有重要作用。
由于微生物数量多，繁殖快，工业生产主要采用向生物发酵法大量生产该制剂。
本实验从土壤中分离的淀粉酶产生菌从温度、pH值两方面探讨其产酶的最适条件。
通过平板培养法，从样品中初步分离出淀粉产生菌株，再通过单菌落培养从而获得比较纯的菌种。
然后对其进行二级扩大培养，最终测定液体培养基菌液中被酶分解得到的葡萄糖含量来讨论菌株的最适条件（温度、pH值等），为工业街道淀粉酶及饲料添加剂提供候选菌株。
【仪器、材料和试剂】（一）仪器1、恒温培养箱2、高压蒸气灭菌锅3、摇床4、恒温水浴锅5、生物显微镜6、电子天平（二）材料样品一：存放过久发霉的麦芽和周围粉尘样品二：米饭生产线附近草坪上的土壤（三）试剂与器材1、锥形瓶（50ml、100ml、500ml等）2、培养皿（25个左右）3、大小试管（30个左右）4、移液枪（1000μl、100μl）及大小枪头若干5、酒精灯、接种针等6、牛肉膏或酵母膏7、蛋白胨8、NaCl9、可溶性淀粉10、琼脂11、卢戈氏碘液11、草酸铵结晶紫12、碘液13、95%酒精14、蕃红染色液15、蒽胴试剂（现配）16、葡萄糖标准液(0.1 g/L)实验环节1 产淀粉酶菌株的初筛【实验步骤】1、称取一个样品5g，倒入盛有45mL无菌水带塞的三角锥形瓶中，摇床振荡30min制成样品悬液记为10-1土壤稀释液；2、用无菌移液管吸取10-1的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中吹吸数次混匀即为10-2稀释液，照此方法分别制成10-2~10-9稀释液；3、分别取10-5、10-6、10-7、10-8、10-9土壤稀释液各0.5mL，涂布于平板培养基表面，一个稀释度涂布接种2块平板，37℃下恒温培养16h ；4、待长出菌落后滴加卢戈氏碘液，挑取有明显淀粉水解圈的单菌落，作为初筛菌株。
“产淀粉酶菌株的筛选”设计方案产淀粉酶菌株的筛选是一项重要的研究工作，它可以满足很多工业和农业领域的需求。
下面是一个设计方案，包含步骤、实验条件和分析方法。
1.步骤（1）菌株的收集和培养首先，需要收集不同环境中的样品，如土壤、水体、植物表面等。
将样品分离培养在富含淀粉的琼脂培养基中。
培养过程中，需保持适宜的温度（通常在30℃左右）和适宜的pH（通常为6-7）。
（2）淀粉酶活性筛选将分离培养基中的菌株进行淀粉酶活性筛选。
取一小部分菌株涂抹到含有淀粉的琼脂培养基上，培养一段时间后在培养皿上观察是否产生明显的透明圈。
透明圈的出现表示淀粉酶活性较高的菌株。
（3）淀粉酶活性检测和比较从产生透明圈的培养皿中挑取具有高活性的菌落，进行淀粉酶活性检测。
可采用碘液滴加法，在含淀粉的琼脂培养基上，滴上一滴碘液，观察出现的蓝色溶解圈的明暗程度，可以初步评估淀粉酶活性的强弱。
（4）纯化和鉴定筛选出具有较高淀粉酶活性的菌株后，通过纯化和鉴定，进一步确定其产淀粉酶的能力以及体外条件如温度和pH对淀粉酶活性的影响。
可采用离心、柱层析等技术对菌株进行纯化。
通过测量在不同条件下的淀粉酶活性，确定最适宜的条件。
2.实验条件（1）培养条件：温度为30℃，pH为6-7（2）培养基：含淀粉和琼脂的培养基。
（3）检测条件：培养基含有淀粉，通过碘液滴加法观察形成的蓝色溶解圈明暗程度。
3.分析方法（1）测量淀粉酶活性采用I2-KI法测定淀粉酶活性。
将一定量的菌株培养液加入含淀粉的缓冲液中，反应一段时间后，加入碘液和KI溶液，混匀后通过测量吸光度来确定淀粉转化的程度。
（2）蛋白质含量测定通过BCA方法测定菌株培养液中的蛋白质含量。
将菌株培养液样品与BCA试剂混合，在一定温度下测量吸光度来确定蛋白质含量。
（3）酶动力学参数分析采用酶动力学参数分析方法，如麦克斯韦–玛尔特尔方程等，通过测定在不同底物浓度下的淀粉酶活性，来确定酶的最适底物浓度、最适酶浓度以及酶的最大反应速率。
生物技术综合实验——淀粉酶产生菌的初步筛选一、实验目的学习从自然界中筛选分离淀粉酶产生菌株。
二、实验内容淀粉酶产生菌的筛选和分离。
三、实验原理在筛选培养基平板上，可溶性淀粉被目的菌株产生的淀粉酶水解，形成透明圈。
不同种类的微生物产生的淀粉酶的种类和活力各不相同，对可溶性淀粉的水解能力各不相同，所形成的水解圈与菌落大小比值故而不同，因而根据其比值可初步断定其对可溶性淀粉的水解能力。
许多细菌和霉菌产生淀粉酶，特别是一些芽孢杆菌，因此，本实验将土壤样品加热处理后，将其接种到筛选培养基平板进行培养，根据平板的水解圈做初筛，从中筛选出产淀粉酶活性较好的菌株进行保藏。
四、实验材料和用具1、材料：土壤样品2、试剂：牛肉膏蛋白胨筛选培养基平板（含可溶性淀粉1%）、45mL无菌水瓶3、仪器及用具：恒温培养箱、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、摇床、酒精灯、牙签、移液枪、试管、涂布器、量筒等。
五、操作步骤（一）准备材料1、筛选固体培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入可溶性淀粉（1%），配制600mL，制备30个平板。
2、含45mL水的三角瓶5瓶，200ul枪头及枪头盒3盒，牙签3瓶，涂布器3包，灭菌处理。
（二）菌种分离1、土壤采集选取采集地点地表植被根系周围的土壤，首先去除地表浮土，然后挖取2-5cm深的土壤样品，每个样品约取20g土壤，装入塑料袋内，备用。
2、制备菌悬液取5g土壤样品置于含45ml无菌水的三角瓶中，用振荡器震荡10分钟，在90度水浴锅中处理15分钟。
3、涂布平板培养与分离吸取100ul悬浮液，用涂布器涂布于筛选培养基平板，待液体充分被吸收后，置于37℃培养箱中培养48h。
每组做2个平板。
（三）菌种初步筛选在平板中加入少量卢戈氏碘液，观察菌落形成透明水解圈情况，用无菌牙签挑取产水解圈的菌落，转接到新的筛选培养基中，每个平板上接种16个菌种，每组接种2个平板，置于37℃培养24h。
在平板内加入卢戈氏碘液，根据单菌落透明圈直径与菌落直径比值(H/C)大小进行初筛，选择水解圈直径与菌落直径比值大的菌株，从中选取淀粉酶活力相对较高的菌株。
第24卷第3期沈阳化工大学学报JOURNALOFSHENYANGUNIVERSITYOFCHEMICALTECHNOLOGY2010.09Vo.l24 No.3Sep.2010文章编号: 1004-4639(2010)03-0203-06土壤中淀粉酶产生菌的筛选及产酶条件优化雷晓燕(沈阳化工大学环境与生物工程学院,辽宁沈阳110142)摘要: 为筛选淀粉酶的高产菌株,利用淀粉水解圈作为筛选模型,从淀粉厂附近土壤中筛选得到产淀粉酶能力较强的细菌B5.对其产酶条件进行优化,最终得到最佳碳源为质量分数为2 0%的淀粉,最佳氮源为质量分数为0 5%的酵母膏加质量分数为0 5%的蛋白胨,最适初始pH值为6 0,最适培养温度为37 ,最适溶氧量为50mL摇瓶装15mL培养基,最佳产酶时间为48h,培养基中同时补充质量分数为0 05%的MgSO4、质量分数为0 05%的CaCl2和质量分数为0 005%的FeSO4时可大幅提高酶活力.菌株B5液体发酵产酶活力最高可达158 89U/g,该淀粉酶最适反应温度为42 ,最适反应pH值为5 0.关键词: 淀粉酶; 水解圈; 酶活力中图分类号: Q939 9 文献标识码: A淀粉酶(Amylase)是水解淀粉和糖原的酶类的总称,广泛存在于动植物和微生物中,是最早实现工业生产并且迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种[1]但适合商业生产需要的菌株仍然很少,在淀粉酶生产过程中选择适合的菌株是最重要的前提条件.本文以土壤作为原料,从中筛选出具有产淀粉酶能力的出发菌株,并对所得的出发菌株进行产酶条件的考察和优化,进一步提高其产酶能力,为使其最终能应用于工业生产、带来经济效益做大量的准备工作..特别是20世纪60年代以来,由于酶法生产葡萄糖,以及用葡萄糖生产异构糖浆的大规模工业化,淀粉酶的需要量越来越大,几乎占整个酶制剂总产量的50%以上[2].淀粉酶根据其作用方式可分为淀粉酶(EC3 2 1 1)与淀粉酶(EC3 2 1 2). 淀粉酶广泛分布于动物(唾液、胰脏等)、植物(麦芽、山萮菜)及微生物中[3]1 实验材料与方法1 1 材料1 1 1 菌种细菌B5,由沈阳某淀粉厂附近土壤中筛选得到.1 12 培养基(1)斜面培养基:可溶性淀粉,质量分数2 0%;蛋白胨,质量分数0 5%;NaC,l质量分数0 5%;KH2PO4,质量分数0 1%;KNO3,质量分数0 1%;琼脂,质量分数2 0%;水100mL;pH值6 0.(2)分离平板培养基:可溶性淀粉,质量分.微生物的许多种类都能产生淀粉酶,Buchanan和Tamuri等人描述了数百种嗜热真菌和上千种细菌可产生淀粉酶,仅Bacillus属48个种中就有32个种能产生淀粉酶.淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域[5][4].因为淀粉酶的用途广泛,各国在对淀粉酶产生菌的筛选方面都做了大量的研[6-8]究工作,目前所得淀粉酶活力最高可达到260U/mL左右.虽然不少微生物能产生淀粉酶,收稿日期: 2009-02-09作者简介: 雷晓燕(1972-),女,陕西绥德人,讲师,硕士,主要从事生物技术教学和科研工作.204沈阳化工大学学报 2010年数2 0%;酵母膏,质量分数0 5%;蛋白胨,质量分数0 5%;NaC,l质量分数05%;KH2PO4,质量分数0 1%;琼脂,质量分数2 0%;水100mL;pH值6 0.(3)种子培养基:可溶性淀粉,质量分数2 0%;酵母膏,质量分数0 5%;蛋白胨,质量分数0 5%;NaC,l质量分数0 5%;KH2PO4,质量分数0 1%;水100mL;pH值6 0. (4)产酶液体培养基:可溶性淀粉,质量分数2 0%;酵母膏,质量分数0 5%;蛋白胨,质量分数0 5%;NaC,l质量分数0 5%;KH2PO4,质量分数0 1%;CaCl2 2H2O,质量分数0 05%;MgSO4 7H2O,质量分数0 05%;FeSO4 7H2O,质量分数0 005%;水100mL;pH 值6 0.1 1 3 主要试剂培养基成分为市售分析纯和生化试剂.1 1 4 主要仪器DHP 420电热恒温培养箱(光明医疗仪器厂),LDZX 40B!型立式自动电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂),ZD 85气浴恒温振荡器(常州国华电器有限公司),WD900微波炉(顺德市格蓝仕电器实业有限公司),HNP 1水平流形超净工作台(南通沪南科学仪器有限公司),101 2A型数显式电热恒温干燥箱(上海阳光实验仪器有限公司),FA1104分析天平(上海精科天平有限公司),BC/BD 428A卧式冷藏冷冻转换柜(青岛海尔特种电冰柜有限公司),SP 2000722型可见分光光度计(上海莱奥光学仪器有限公司).1 2 方法1 2 1 菌种筛选初筛:从沈阳某淀粉厂附近采集土样,称取5g土样,放入装有45mL无菌水的三角瓶中,震荡20min后静置5min,然后进行浓度梯度稀释-6-4-5-6到10,分别在10、10、10浓度下各取1mL土壤稀释液制成混菌平板,将培养皿放入37 培养箱中培养24h.取出培养好的平皿,在长出的菌落上滴加碘液,菌落周围如有无色透明圈出现,说明淀粉被水解,即该菌株能产生淀粉酶,编号保存.复筛:从冰箱中取出所有初筛得到的菌株,转接试管斜面活化,37 下恒温培养24h.将所有菌种分别点种到分离培养基平板上进行培养,待菌落长成后向菌落上滴加碘液,比较淀粉水解圈大小,挑取d0/d1(d0为水解圈直径,d1为菌落直径)较大的菌株连续进行3次平板点种培养,选取d0/d1值最大的菌株作为本实验出发菌株.1 2 2 淀粉酶活力的测定[9]发酵液4000r/min离心20min,取上清液,即为粗酶液.取5mL质量分数为0 5%的可溶性淀粉溶液,在37 水浴中预热10min,加入适当稀释的酶液0 5mL,准确反应5min后,用5mL浓度为0 1mol/L的HCl终止反应.取0 5mL反应液与5mL稀碘液显色,在620nm处测吸光度.以0 5mL蒸馏水代替0 5mL 反应液为空白,以不加酶液(加同体积的缓冲液)的管为对照.酶活定义:在37 、pH=6 0条件下,5min内水解1mg淀粉的酶量为一个活力单位.酶活力根据以下公式计算: 酶活=(R0-R)/R0∀50∀D∀4.式中,R0、R分别表示对照和反应液的光密度,D为粗酶液的稀释倍数.调整D使(R0-R)/R在0 2~0 7之间,4为转换系数,无单位.1 2 3 最佳碳源的确定取出发菌株活化,然后取一环接入种子培养基中培养,于24h后分别取1mL培养液,加入到2 0%淀粉,2 0%麦芽糖,2 0%乳糖,2 0%蔗糖,2 0%葡萄糖5种不同碳源的产酶培养基中,于37 摇床培养48h.分别离心收集粗酶液,测定其淀粉酶活力,根据所测定的结果确定最佳碳源.1 2 4 最佳氮源的确定取出发菌株活化,然后取一环接入种子培养基中培养,于24h后分别取1mL培养液,加入到氮源分别为0 5%(质量分数,下同)牛肉膏,0 5%酵母膏,0 5%蛋白胨,0 5%牛肉膏+0 5%蛋白胨,0 5%酵母膏+0 5%蛋白胨5种不同氮源的产酶培养基中.于37 摇床培养48h.分别离心收集粗酶液,测定其淀粉酶活力,根据所测定的结果确定最佳氮源.第3期雷晓燕:土壤中淀粉酶产生菌的筛选及产酶条件优化 2051 2 5 最佳培养基初始pH值的确定取出发菌株活化,然后取一环接入种子培养基中培养,24h后分别取1mL培养液,加入到pH值分别为5 0、6 0、7 0、8 0、9 0,碳源和氮源已优化的产酶培养基中,37 下培养48h.分别离心收集粗酶液,测定其淀粉酶活力,根据所测定的结果确定最佳培养基的初始pH值.1 2 6 最佳培养温度的确定取出发菌株活化,然后取一环接入种子培养基中培养,24h后分别取1mL培养液,加入碳源、氮源和pH值已优化的产酶培养基中,分别于33 、35 、37 、39 、41 下培养48h.分别离心收集粗酶液,测定其淀粉酶活力,根据所测定的结果确定最佳培养温度.1 2 7 最佳溶氧量的确定取出发菌株活化,然后取一环接入种子培养基中培养,24h后分别取1mL培养液,接入已优化碳源、氮源和pH值的产酶培养基中培养,产酶培养基的装液量分别为10mL、15mL、20mL、25mL、30mL,37 下培养48h,分别离心收集粗酶液,测定其淀粉酶活力,根据所测定的结果确定最佳溶氧量.1 2 8 最佳产酶时间的确定取出发菌株活化,然后取一环接入种子培养基中培养,24h后分别取1mL培养液,接入已优化碳源、氮源和pH值的产酶培养基中培养,分别于0h,12h,24h,36h,48h,60h 取样,测定发酵液的酶活力,根据所测定的结果确定最佳产酶时间.1 2 9 离子对产酶的影响通过向培养基中添加质量分数为0 05%的MgSO4、质量分数为0 05%的CaCl2和质量分数为0 005%的FeSO4等不同离子进行产酶实验,培养48h,测定酶活力,根据测定结果确定最适添加的离子.1 2 10 酶反应最适pH值的确定分别用pH值为4 0、5 0、6 0、7 0、8 0、9 0的缓冲溶液配制可溶性淀粉液,将在最适条件下培养获得的粗酶液分别在以上各种pH值条件下测定其淀粉酶活力,根据所测得的结果确定淀粉酶反应的最适pH值.1 2 11 酶反应最适温度的确定将在最适条件下培养获得的粗酶液分别在27 、32 、37 、42 、47 、52 等各种不同温度下测定淀粉酶活力,根据所测得的结果确定淀粉酶反应的最适温度.2 实验结果2 1 初筛结果土样经稀释并在淀粉培养基平板上培养后,共挑选出24株能水解淀粉的细菌,分别将24株细菌接种到斜面培养基上,编号为B1~B24,菌株产生水解圈的情况如图1所示.图1 淀粉酶产生菌产生的淀粉水解圈Fig.1 Hydrolysiscircleofstarchproducedby astrainwhichcanproduceamylase2 2 复筛结果将所有初筛得到的菌种分别点种到淀粉培养基平板上进行培养,待菌落长成后向菌落上滴加碘液,比较淀粉水解圈大小,挑取d0/d1(d0为水解圈直径,d1为菌落直径)较大的5株菌株连续进行3次平板点种培养,最终选取d0/d1值最大的菌株B5作为本实验出发菌株.将B5菌株接多支斜面,经培养后于低温保存.复筛结果见表1.表1 复筛结果Table1 Resultsofre screening编号12345水解圈直径d0/cm2 402 901 701 901 90菌落直径d1/cm1 301 801 001 200 60d0/d11 851 611 701 583 17206沈阳化工大学学报 2010年2 3菌株产酶条件的优化发酵过程中影响菌株生长、产酶的主要因素为:碳源、氮源、发酵培养基的初始pH值、发酵温度、溶氧量、金属离子及产酶时间.对上述因素进行全面考察,以确定菌株的最佳产酶条件.2.3.1 碳源对细菌B5产酶能力的影响分别在5种含不同碳源的发酵培养基中培养细菌B5,37 摇床培养48h.经过对发酵液中淀粉酶活力的测定,可知碳源为质量分数为2 0%的淀粉时细菌B5产酶活力最高,测定结果见图2.37 下培养48h,测定不同pH值下淀粉酶活力,结果见图4,根据所测定的结果确定最佳培养基的初始pH值为6 0.图4 培养基初始pH值对菌株B5产酶能力的影响Fig.4 TheimpactofinitialpHonBacteriumB5inproducingamylase2 3 4 培养温度对菌株B5产酶能力的影响将出发菌株B5分别在5种不同温度下进行培养,48h后离心收集粗酶液,测定淀粉酶活力,结果见图5.由图5结果可以看出,37 培养时菌株B5产酶能力最强.图2 碳源对细菌B5产酶的影响Fig.2 TheimpactofcarbonsourceonBacteriumB5inproducingamylase2 3 2 氮源对细菌B5产酶能力的影响分别在含5种不同氮源的发酵培养基中培养细菌B5,37 摇床培养48h.经过对发酵液中淀粉酶活力的测定,可知氮源为质量分数0 5%酵母膏+质量分数0 5%蛋白胨时细菌B5产酶活力最高,测定结果见图3.图5 培养温度对菌株B5产酶能力的影响Fig.5 Theimpactofculturetemperatureon BacteriumB5inproducingamylase2 3 5 溶氧量对菌株B5产酶能力的影响将菌株B5在不同溶氧情况下进行培养,48h后离心收集粗酶液,测定淀粉酶活力,结果见图6.由图6可以看出,50mL摇瓶中装液量为15mL时为最佳溶氧量.图3 氮源对菌株B5产酶能力的影响Fig.3 Theimpactofnitrogensourceon BacteriumB5inproducingamylase图6 溶氧对菌株B5产酶能力的影响Fig.6 Theimpactofdissolvedoxygenon BacteriumB5inproducingamylase2 3 3 培养基初始pH值对菌株B5产酶能力的影响将碳源和氮源已优化的产酶培养基pH值7892 3 6 最佳产酶时间的确定B5在不第3期雷晓燕:土壤中淀粉酶产生菌的筛选及产酶条件优化 207同时间点取样测定酶活力,结果如图7所示.由图7可见以看出,菌株B5的最佳产酶时间是48h.由图9可以看出,pH值为5 0时淀粉酶活力最强.2 4 2 酶反应最适温度的确定分别在各种不同温度下测定菌株B5所产淀粉酶的酶活力,结果见图10.由图10可以看出,在42 时酶活力最强,此时酶活力可达158 9U/mL.图7 菌株B5淀粉酶最佳产生时间的确定结果Fig.7 ThedeterminationofoptimaltimeinproducingamylasebyBacteriumB52 3 7 离子对产酶的影响2+2+2+Mg、Ca、Fe是很多种酶的激活剂并且可以提高酶活力,为测定这几种离子对菌株B5所产淀粉酶是否有提高酶活力的作用,向培养基中单一或混合添加几种离子进行发酵产酶实验,酶活测定结果见图8.由图8可以看出,同时添加3种离子对菌株B5产酶能力有较大的影响.图10 酶反应最适温度的测定结果Fig.10 Thedeterminationofoptimalreaction temperatureofamylase在最适条件下菌株B5所产淀粉酶活力从最初的92 6U/mL提高到158 9U/mL,酶活力提高效果明显.3 结论实验中筛选出的细菌B5具有产淀粉酶的能力,菌株产酶能力通常会受到菌株培养时碳源、氮源、培养基初始pH值、培养温度、溶氧、离子等许多因素的影响,另外菌株所产酶的活力也图8 离子对菌株B5产酶的影响Fig.8 TheimpactofiononBacteriumB5inproducingamylase会受到酶发挥作用时最适温度和最适pH值的影响.综合考察以上各种影响因素对酶活力的影响后,确定菌株B5产淀粉酶的最适培养条件以及淀粉酶发挥作用时的最适条件.以淀粉厂附近土样为原料,通过淀粉水解圈筛选模型筛选得到一株产淀粉酶活力较强的细菌B5.通过对B5产酶条件的考察得出:培养基中最佳碳源为质量分数2%的淀粉,最佳氮源为质量分数0 5%的酵母膏加质量分数0 5%的蛋白胨,最适初始pH值为6 0,最适培养温度为37 ,最适溶氧量为50mL摇瓶装15mL培养基,最佳产酶时间是48h,培养基中同时补充质量分数0 05%的MgSO4、质量分数0 05%的CaCl2和质量分数0 005%的FeSO4时可大幅提高酶活力.该淀粉酶最适反应温度为42 ,最适反应pH值为5 0.菌株B5液2 4 菌株B5所产淀粉酶酶学性质的研究2 4 1 酶反应最适pH值的确定分别用不同pH值的缓冲溶液配制可溶性淀粉液,测定淀粉酶活力,结果见图9.图9 酶反应最适pH值的确定结果Fig.9 ThedeterminationofoptmialreactionpHofamylase体发酵产酶活力最高可达158 9U/mL,该菌株如果再进一步进行诱变处理酶活力还有提升空208沈阳化工大学学报 2010年[6] ShojiH,SugimotoT,HosoiK,eta.lSimultaneous间.本实验方法简便、直观,可快速、高效地筛选出淀粉酶产生菌. ProductionofGlucoamylaseandAcidStable am ylaseUsingNovelSubmergedCultureofAspergillusKawachiiNBRC4308[J].JournalofBios cienceandBioengineering,2007,103(2):203-205.[7] NagamineK,MurashimaK,KatoT,eta.lModeof amylaseProductionbytheShochuKojiMoldAspergillusKawachii[J].Bioscience,BiotechnologyandBiochemistry,2003,67(10):2194-2202.[8] SivaramakrishnanS,GangadharanD,NampoothiriKM,eta.lAmylasefromMicrobialSources###AnOverviewonRecentDevelopments[J].FoodTech nolBiotechno,l2006,44(2):173-184.[9] 沈萍.微生物学[M].2版.北京:高等教育出版社,2002:63-65.参考文献:[1] 谷军. 淀粉酶的生产与应用[J].生物技术,1994,4(3):1-5.[2] 白坤,于德贵,周冬颖. 淀粉酶的性质及其液化作用[J].中国酿造,1995(5):1-5.[3] 张强,刘成君,蒋芳,等.耐高温淀粉酶产生菌的分离鉴定及发酵条件与酶性质研究[J].食品与发酵工业,2005,31(2):34-37.[4] 罗志刚,杨景峰,罗发兴. 淀粉酶的性质及应用[J].食品研究与研发,2007,28(8):1-18.[5] 张丽苹,徐岩,金建中.酸性淀粉酶的研究与应用[J].酿酒,2002,29(3):4-15. ScreeningofBacteriumProducingAmylasefromtheSoiland OptmiizationoftheConditionforEnzymeProductionLEIXiao yan(ShenyangUniversityofChemicalTechnology,Shenyang110142,China)Abstrac:tInordertoscreenabacteriumwhichcanproduceamylase,starchhydrolysiscircleisusedinthise xperimentasascreeningmode.lTheStrainB5isachievedbyscreeningfromthesoilnearthestar chfactory.Aftertheoptimizationofthecondition,thecapabilityofB5isimproved.Theoptimal conditionis:carbonsourceisstarch2 0%;nitrogensourceisyeastextract0 5%andpeptone0 5%;theinitialpHis60;andtheoptimumincubationtemperatureis37 ;theappropriateloadis15mLculturemediumi n50mLflask;theoptimaltimeforproducingamylaseis48h;when0 05%MgSO4,005%CaCl2,and0005%FeSO4isaddedtothemedium,theamylaseactivitycanbeimprovedgreatly.Theamylase activ ityofStrainB5inliquidfermentationcanreachashighas15889U/mL.Theoptimalreactiontemperatureofamylaseis42 ,andtheoptimumreactionpHofamylaseis50.Theexperimentalmethodissim pleandintuitive,andcanbeusedtoscreenamylase producingstrainquicklyandefficiently.Keywords: amylase; hydrolysiscircle; enzymeactivity。
α-淀粉酶产生菌的筛选鉴定及其发酵条件的优化
李鑫玲;孙晓菲;李欣
【期刊名称】《食品研究与开发》
【年(卷),期】2016(037)012
【摘要】从土壤样本中分离出一株产α-淀粉酶的菌株，经形态学初步鉴定为热红短芽孢杆菌。
对该菌株产酶条件进行了优化，确定其最佳碳源为麸皮，最佳氮源为明胶，最佳pH值为10，最佳初始装液量为60 mL。
【总页数】3页(P163-165)
【作者】李鑫玲;孙晓菲;李欣
【作者单位】河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471003;河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471003;河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471003
【正文语种】中文
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