影响旱作小麦高效花药培养的因素

第2期141～145 JOURNAL OF GANSU AGRICULTURAL UNIVERSITY 双月刊影响旱作小麦高效花药培养的因素倪胜利1，李唯1，李胜1，柴守玺1，李志明2（1. 甘肃农业大学农学院，甘肃兰州 730070；2. 甘肃省农科院粮作所，甘肃兰州 730070）摘要：通过不同处理和多种影响因素对不同类型小麦花药培养效应的比较研究表明，旱作春小麦花药培养愈伤组织诱导率和绿苗分化率均存在显著的基因型差异，其中以普通小红麦诱导率最高，达8.12%，八倍体小黑麦中以20－1528诱导率最高，达7.71%。

诱导培养基中2, 4－D、水解乳蛋白和蔗糖之间的适宜配比为：2.0∶0.5∶90（g/L）；而在分化培养基中的适宜配比为：0∶0.5∶70（g/L）。

对花药进行2d低温预处理和32℃高温培养具有较高的花药愈伤诱导率，分别达7.6 % 和6.58 %。

关键词：旱作春小麦；花药培养；基因型；培养基；处理温度中图分类号：S 512.1+2 文献标识码：A 文章编号：1003-4315(2004)02-0141-05Factors influencing on high efficiency anthers culture of wheat in drylandNI Sheng-li1，LI Wei1， LI Sheng1， CHAI Shou-xi1， LI Zhi-ming2（1. College of Agronomy, Gansu Agricultural University, Gansu,Lanzhou 730070；2. Institute of Cereal and Oil Crops,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Gansu, Lanzhou 730070, China）Abstract: Effects of different treatments and a few extrafactors on the high efficiency anther culture of different genotypes of spring wheat in dryland were studied. The results showed that both induction percentage of pollen callua and calli giving green plantlets in the high efficiency anther culture of spring wheat in dryland varied with the genotypes,among which the induction percentage of pollen callus of the common small red wheat had reached 8.12 % as the highest level in comparison with others varieties of common wheat; while the induction percentage of callus of the strain 20-1528 had reached 7.71 % as the highest among the strains of octploid rye. The fittest proportion of 2, 4-D, LH and sucrose in the best-induced medium was 2.0∶0.5∶90 (g/L),but in the best medium of differentiation, the fittest proportion was 0∶0.5∶70 (g/L). Meanwhile, higher induction percentage of pollen callua had been obtained with low temperature pretreatment for two days and high- temperatured culture at 32℃, and reached 7.6 % , 6.58 % separately.Key words：spring wheat in dry land；anther culture；genotype；medium；treatment temperature小麦是仅次于水稻的世界第二大作物，其花培育种技术由于能快速实现基因型的纯合，显著缩短育种年限，自20世纪70年代以来，一直受到育种界的广泛重视[1, 16]。

特别是在利用基因工程技术进行小麦种质改良的研究中，利用花药培养技术与秋水仙素诱导等方法构建规模较大的合适的DH（双单倍体）群体，可以比较准确地筛选品质、产量、抗性等性状的标记基因[2～5]；在转基因方面，以绿苗诱导率较高的花粉粒或胚性愈伤组织细胞为受体进行DNA融合与基因转移可以很快得到纯合转基因后代等，只是目前这一作者简介：倪胜利（1979－），男，甘肃华池人，在读硕士研究生，从事作物种质改良及组织培养研究。

通讯作者：李唯，教授，主要从事作物种质改良及组织培养研究。

收稿日期：2004－02－16技术的效率还不高，其主要原因有二，一是小麦花药胚性愈伤组织诱导率还不够高，而且较难继代培养；二是能够高频率诱导培养的基因型还不够广泛，尤其是旱作型小麦高效花药培养体系建立的研究，报道甚少。

因此，深入研究影响旱作型小麦花培的因素，建立高效花药培养体系，大幅度提高小麦胚性愈伤组织诱导率和绿苗诱导率，对于小麦生物技术育种研究有重要的理论和实践意义。

本文旨在通过不同处理方式和多种影响因素对不同旱作型小麦花药培养效应的比较研究，探索进一步提高小麦花药培养效率的系统方法，建立旱作型小麦高效花药培养研究体系，为西部地区抗旱节水型小麦的生物技术改良提供实验依据。

1 实验材料与方法1.1 实验材料选用14个普通春小麦及小黑麦品种进行对比研究，其中Sw1206、会宁大青芒、小红麦、定西35、定西33、定西24等6个旱作型普通春小麦品种；小品20－1528、3－1517、1533、小鉴7号、18号、小黑麦17号等6个八倍体小黑麦品种；6－90和7021两个水地型普通春小麦品种。

6个旱作型普通春小麦品种和6个八倍体小黑麦品种分别由甘肃农业大学农学院耕作与栽培重点实验室提供，两个水地型普通春小麦品种由甘肃省农科院粮作所提供（于1999年从国际小麦改良中心引进）。

实验于2000～2003年在甘肃农业大学植物组织培养实验室与试验田中进行。

1.2 实验方法1.2.1 花药接种材料的选取在田间选取小麦花药处于单核中晚期（外部形态为幼穗麦芒露出旗叶叶鞘）的穗子，从旗叶节下剪取，装入广口瓶中带回，保存于2～4 ℃的冰箱中备用。

1.2.2 接种花药的消毒在超净工作台上先用70 %的酒精进行表面消毒，然后用0.1%的HgCl2溶液消毒10 min，再用无菌水冲洗3～5次后接种。

1.2.3 接种花药的预处理以不进行低温处理，直接将来自田间的幼穗进行消毒接种的为对照组（P0），在2～4 ℃恒温冰箱里处理1d、2d、3d、4d、5d，然后再消毒接种的为处理组，分别为P1、P2、P3、P4、P5。

1.2.4 高温培养处理将接种后的花药置于光照约为1 600Lx、（26+2）℃的培养室中培养5 d，并以此为对照（H0），设32 ℃高温培养2d、5d、10d、15d后在放入常温下培养4组，依次编号为：H1、H2、H3、H4。

以上处理的小麦花药均接种在2000年所筛选出的较优培养基X1上，分化培养基均采用X1Z（除去X1培养基中的2, 4－D及降低蔗糖含量至70 g/L）。

处理与对照间通过统计分析比较来确定显著度。

培养30 d 后的统计：愈伤诱导率=产生愈伤组织数/接种花药数×100 %绿苗分化率=产生绿苗数/产生愈伤组织数×100 %绿苗诱导率=分化绿苗丛数/接种花药数×100 %1.3 培养基组成愈伤组织诱导选用X类培养基（原癸培养基[15]中除去D－生物素），其中2, 4－D、水解乳蛋白、蔗糖等3种附加成分采用两水平随机组合实验进行筛选最佳配比；分化培养基采用Xnz（除去X培养基中2, 4－D），pH值均为5.8。

2 结果和分析2.1 培养基附加成分对提高小麦花药培养诱导率的影响表1三个旱作型普通春小麦品种（定西35、定西33、定西24）进行的培养基筛选实验结果。

表1表第2期 倪胜利等：影响旱作小麦高效花药培养的因素143明，在2, 4－D 、水解乳蛋白（LH ）和蔗糖三因子试验中，以水解乳蛋白（LH ）的R 值为最大，其次为2, 4－D ，说明2, 4－D 和水解乳蛋白是影响旱作型小麦花药培养诱导率的两个重要因素，其适宜用量分别为2.0 g/L 和500 mg/L ；蔗糖浓度在70 g/L 和90 g/L 范围内对花药培养诱导效率的影响不明显。

这一结果与王子霞、海热古力⋅阿布力等人的研究结果相一致。

但从绿苗分化率来看，附加70 g/L 蔗糖的分化培养基的绿苗分化率要高于附加90 g/L 蔗糖的分化培养基的绿苗分化率，说明70 g/L 的蔗糖浓度对于旱作型普通小麦花药愈伤组织诱导和绿苗分化均是适宜的，而且绿苗分化似乎需要较低的蔗糖浓度。

表1 不同诱导培养基上3个旱作型普通小麦品种花药培养诱导率附加成分培养基 2, 4－D 水解乳蛋白蔗糖 KT 接种花药数/枚愈伤诱导率/%绿苗分化率/%X １ 2.0 500 90 0.5 845 4.5 40.00 X ２ 2.0 500 70 0.5 422 4.1 45.45 X ３ 2.0 200 90 0.5 366 2.5 21.82 X ４ 2.0 200 70 0.5 584 3.1 44.00 X ５ 3.0 500 90 0.5 648 3.6 33.33 X ６ 3.0 500 70 0.5 756 3.4 37.53 3.0 200 90 0.5 814 2.8 28.00 X ７ X ８ 3.0 200 70 0.5 916 3.4 30.42 K 1 3.55 3.90 3.5 K 2 3.30 2.95 3.5 R0.250.95注：1. K 1, K 2各个成分在1, 2各个水平上的平均愈伤诱导率；2. R 每列K 值上的极差。

因此，筛选出的最佳春小麦花药愈伤组织诱导培养基中2, 4－D 、水解乳蛋白（LH ）和蔗糖三因子的适宜配比为：2.0∶0.5∶90（g/L ）；而在愈伤组织分化培养基中2, 4－D 、水解乳蛋白（LH ）和蔗糖的适宜配比为：0∶0.5∶70（g/L ）。