蚕豆根尖微核实验
摘要：本实验用洗发水诱导蚕豆根尖发生畸变，通过固定、酸解、，染色、压片、镜检等一系列过程观察蚕豆根尖细胞核及微核，通过微核的数量判断洗发水对人体毒害作用的大小。由于产生的微核数量与外界诱变因子的强弱成正比，因此可用微核实验来评价各种诱变因子对生物遗传物质的影响程度。
关键词： 蚕豆根尖 微核 卡诺固定液 吉姆萨染液
前言：随着相关研究人员的一系列实验表明：日常用品中的一些物质会对植物细胞尤其是分生组织细胞产生明显影响，它们会破坏细胞中的遗传物质——染色体，导致微核的产生，破坏细胞正常的生命活动。
微核（micronucleus,简称MCN），也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下，着色与主核一致或稍浅，呈圆形或椭圆形。蚕豆根尖细胞的微核是由于根尖细胞在分裂时受到外界诱变因子作用，形成的不随细胞分裂进入细胞核的染色体片段。
以观察细胞中微核的形成来检测遗传毒物，称为微核实验。利用蚕豆根尖作为实验材料进行微核测试，可准确的显示各种处理诱发畸变的效果，并可用于污染程度的监测。目前微核测试已经广泛应用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。
1．材料
1.1实验材料：
蚕豆（根尖细胞的染色体大，DNA含量高，对诱变因子反应敏感） 1.2 实验药品：
1mol/L盐酸、固定液（乙醇、冰醋酸3：1配制）、吉姆萨染液
1.3 实验用具：
显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、盆、纱布、烧杯、水浴锅等
2．步骤
2.1 浸种催芽
将试验所用适量蚕豆放入盛水烧杯盆中，在室温下浸泡1d。种
子吸胀后，用温润纱布松散包裹蚕豆置盆中，保持温度催芽2d，此时根长出将近约1.5cm。
2.2 毒性处理
选取根生长良好，根长一致的种子，分成两组，一组放入盛有被测洗发水的盆中，被测液浸没根尖即可。另一组放入盛有自来水的盆中培养，做对照组。两组均处理1d。
第一部分 植物染色体压片法
一 实验目的
1. 学习并掌握根尖处理、染色、压片及制片观察的方法。
2. 观察有丝分裂各时期染色体的形态变化，了解有丝分裂全过程。
二 实验原理
高等植物有丝分裂主要发生在根尖、茎尖生长点及幼叶等器官的分生组织(分生区)，其中根尖是最常用的材料：
①根尖取材容易，操作和鉴定也比其它器官与组织方便；
②实验室内采用种子萌发后所长出的新鲜幼嫩根尖，不受植物生长季节的影响和限制，并且可以大量获得；
③对于某些珍贵而又稀少的试验材料，取用自然条件下生长植株的根尖，比取用茎尖、花器等对材料的伤害要小得多；
④采用实验室内种子发根，切取根尖后的种苗通常还可以进行正常种植，利于后续研究进行。
有丝分裂期在整个细胞周期中所占的时间相对较短，有丝分裂制片的主要目的是进行染色体鉴定，希望观察到更多分裂相，尤其是分裂中期相，通常要对材料进行不同的预处理。
预处理主要通过抑制和破坏纺锤丝的形成来获得更多的中期分裂相；同时，预处理还可改变细胞质的粘度，促使染色体缩短和分散，便于压片和观察。常用的预处理有物理法、化学法、混合处理法等。
植物细胞的细胞壁对细胞形态和结构起支撑和保护作用，分生组织的细胞壁结构将分生细胞结合成一个整体，因此在压片之前需要采用适当方法软化或部分分解细胞壁使细胞间易于分离，这一操作称为解离。同时，解离也可适当清除部分细胞质，使细胞质背景趋于透明化，便于观察染色体。常用的解离方法主要有酸解法和酶解法。
酸解法：步骤简便、容易掌握。根尖分生组织经过酸解和压片后，呈单细胞。酸解法广泛用于染色体计数、核型分析和染色体畸变的观察及相关分析。 酶解法：常用于染色体显带技术或姊妹染色单体交换研究。通过解离和压片，分生细胞的原生质体能够从细胞壁里压出，使染色体周围不带有细胞质或仅有少量细胞质，让后续制片处理直接作用于染色体。
在普通光学显微镜下观察染色体形态结构还需要对材料进行染色，通常采用染色体染色效果好而细胞质着色少的碱性染料、酸性染料或孚尔根试剂染色。
实验三 植物染色体标本制备与观察
孚尔根反应（Feulgen Reaction）
一、实 验 目 的
1. 熟悉并掌握Feulgen反应的原理及其实验操作方法
2. 掌握植物染色体标本的制备技术
二、实 验 原 理
Feulgen反应(Feulgen reaction)是显示DNA的最典型的组织化学反应，为学者Feulgen和Rossenbeck于1924年发明，简称为Feulgen法。因对DNA的显示反应具有高度专一性，故常被用来显示细胞内DNA的分布情况。自Feulgen反应法问世以来，其作用机制也久经研究和讨论，目前认为其具体反应原理是：标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。也就是说，DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。其反应机制如下所示。
2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3
三、实 验 用 品
（一）、器材：显微镜、水浴锅、烧杯、镊子、刀片、载玻片、盖玻片
（二）、材料：小麦根尖。
（三）、试剂：
1. schiff氏试剂：
将0.5g碱性品红置入三角烧瓶内沸腾的蒸馏水中，时时摇动玻璃瓶，煮沸5min使之充分溶解，冷却至50℃时过滤，加入10ml 1mol/L HCl，冷至25℃时，加入0.5g偏重亚硫酸钠(Na2S2O3)无水亚硫酸钠(NaHSO3)，在室温冷暗处至少放置24h(有时需2~3天)，使其颜色退至淡黄色，密封瓶口，藏于暗处，最好保存于4℃冰箱中(可保存数月或更长时间)。在使用前加入0.5g活性碳，摇1min, 用粗滤纸过滤，滤液应为无色；若液体颜色变为粉红色，便不能再用。
2. 亚硫酸水(漂洗液) 用200ml普通自来水(不要用蒸馏水, 以免引起误差)、10ml 10%的偏重亚硫酸钠水溶液和10ml 1mol/L HCl，三者在使用前混合，现用现配。
实验一 细胞减数分裂观察
实验原理减数分裂是有性繁殖生物形成配子时的一种特殊的细胞分裂方式，减数分裂和受精作用成为多细胞生物世代间传递的中间环节，这种分裂方式保证了生物在世代传递过程中体细胞染色体数目的恒定不变，即都含有两个基本染色体组（二倍体生物），又可以实现物种内个体间遗传上的多样性。
减数分裂包括两次细胞分裂阶段，第一次是细胞染色体数目减半的分裂，第二次分裂是细胞染色体数目等数的分裂。
３．试剂：卡诺氏固定液（乙醇 : 冰乙酸 = 3 : 1）；醋酸洋红染色液（45%乙酸100mL+洋红1g 加热煮沸不超过30秒，冷却，加一枚生锈的铁钉，静置片刻过滤）。
1. 玉米花药压片（2n = 20）
⑴ 取材：玉米抽穗前的大喇叭口期，取出花序分枝备用；
⑵ 固定：雄花序在卡诺氏固定液中固定12～24小时后，可用于制片。
⑶ 染色和压片；取一枚花蕾，去除颖片，取出花药，置于干净的载玻片上，吸去多余的固定液，滴加一滴醋酸洋红染色液，用解剖针将花药切断成碎段并压出花粉母细胞。静置15～20分钟。加盖玻片，再在上面覆盖吸水纸，用大拇指压片（切勿使盖玻片滑动），也可以用解剖针柄轻敲盖玻片以使细胞和染色体分开。
⑷ 镜检：低倍镜下寻找花粉母细胞，再用高倍镜观察减数分裂各个时期染色体的形态和运动特征。
蝗虫精巢压片（2n = 24）⑴ 取材并固定：从野外捕获的雄性蝗虫经卡诺氏固定液固定，即可用于制作减数分裂标本片。
⑵ 剖解精巢：实验前将蝗虫置于培养皿中，剖取蝗虫的精巢。剔除精巢周围的其他组织后，就可以进行染色处理。
⑶ 染色和压片；挑取一小段精巢置于干净的载玻片上，滴加一滴醋酸洋红染色液，用解剖针反复将精巢切断成碎段（尽可能碎），挑出肉眼可见的组织碎块，静置15～20分钟。再加盖玻片并在上面覆盖吸水纸，用大拇指压片（切勿使盖玻片滑动），也可以用铅笔头等轻敲盖玻片以使细胞和染色体分开。
⑷ 镜检：低倍镜下寻找具有清晰分裂相的细胞，再用高倍镜观察减数分裂各个时期染色体的形态和运动特征。
