细胞生物学实验指导

细胞生物学实验指导

实验一、显微镜的结构与使用方法

一、 实验目的

1. 认识显微镜的构造 2. 学会独立操作显微镜

二、 仪器和材料

显微镜、擦镜纸、装片

三、 实验内容

1. 学生按编号把自己的显微镜取出，放在试验台上，在教师的指导下熟悉显微镜各部分的构造及用途，然后进行操作练习。先用低倍镜进行对光联系，使视野明亮而均匀。如果使用双筒目镜，还应学习目镜间距的调节。在转换高倍物镜观察，此时应注意它的视野亮度与低倍物镜有无区别？并思考通过哪几种方法调节使得高倍物镜的视野达到要求的亮度。

2. 取已制备好的装片进行观察：按低倍镜使用步骤和方法进行操作练习。注意要使观察到的像向前移动时，玻片标本应向那个方向移动？欲使观察到的像向右移动时，拨片标本应向那个方向移动？

3. 观察制备好切片：细胞核、中心体、胞间连丝、有丝分裂、减数分裂、高尔基体等。

4. 观察完毕后，按正规要求取下玻片，把显微镜收好。

四、 作业

绘制2-3中细胞结构

实验二、Feulgen反应显示DNA

（一）实验目的

1．掌握临时制片法。 2．熟悉Feulgen反应的原理及操作步骤。 3．观察细胞中DNA的分布。

（二）实验原理

Feulgen在1924年发明一种对DNA特异的组织化学染色反应，故称Feulgen反应。

DNA经酸（1mol/L HCl）水解后，DNA分子中的嘌呤和脱氧核糖连接的配糖键被打开，脱氧核糖的一端释放出醛基，并在原位与Schiff试剂反应形成特异性的紫红色产物。该产物能特异地吸收峰值为550~570nm的光波。并且在一定的浓度范围内，对550~570nm光波的吸收值与DNA含量成正比关系，既符合化学计量学关系。此法既可定位用于细胞或组织化学染色反应，观察DNA的分布，又可用显微分光光度计和图像分析仪对细胞或组织中DNA的含量进行定量分析。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色团，所以具有颜色。对照组或采取不经盐酸处理，或预先用热三氯醋酸或DNA酶处理，抽提去细胞中的DNA而得到阴性反应。

Feulgen反应对DNA染色稳定、颜色鲜明、能定量，因此在细胞化学和组织化学中成为一个既古老、传统又经久不衰的DNA标记方法。

（三）实验器具与药品

1．实验器具

恒温水浴锅、载玻片、盖玻片、染色缸、显

微镜

2．药品

（1）1mol/L HCl：浓盐酸8.5ml，蒸馏水91.5ml。 （2）Schiff试剂：将0.5g碱性品红加入100ml沸水中，时时摇荡玻璃瓶，煮5min，使之充分溶解，然后冷却到50℃时过滤。滤液中加入10ml的1mol/L HCl，冷却到25℃时加入0.5g偏重亚硫酸钠（Na2S2O5）或偏重亚硫酸钾（K2S2O5）。在室温下静置24小时，其颜色呈褐色或淡黄色，加活性炭0.5g，摇1min，过滤，滤液为无色。置棕色瓶密封，4℃保存。一般可以保存数月。

（3）0.5%亮绿水溶液（可稀释1~5倍使用）。

（4）Carnoy固定液：95%酒精:冰醋酸=3:1

（4）亚硫酸氢钠溶液：10%NaSO3母液5ml，1mol/L HCl 5ml加蒸馏水至100ml，用时现配。 （5）5%三氯醋酸

（6）二甲苯

3．实验材料

四膜虫、酵母、洋葱根尖

（四）实验方法

1．临时制片的制备方法

临时性的标本片是指在进行实验观察时，临时制备的不能长期保存的标本片。制备方法如下：

取一张载玻片，用左手拇指和食指夹持载玻片的两端，右手的拇指和食指夹着一块清洁而柔软的布，把载玻片放在两手指加着的布间，然后均匀地前后移动擦净载玻片的两面；盖玻片小而薄，擦时必须小心，把一张盖片平放在左手两指间夹着的布间，并轻轻捏住，右手指夹持盖玻片的边缘向一个方向转动进行擦拭，用力需轻而均匀（如果盖玻片上有油或其它难以擦净的东西，

可滴加医用酒精后再用布擦）。把擦净的载玻片平放在桌上，用吸管小心吸取要观察的标本悬液，滴一小滴于载玻片的中央，然后用镊子轻轻夹住盖玻片的一端，将其对侧端先接触载玻片上悬液，慢慢地倾斜盖下防止产生气泡，再用吸水纸吸取多余的水分。如标本需要染色，可将染液滴在盖玻片的一侧（不要滴在盖玻片上），用吸水纸在盖玻片的另一侧边缘吸水，染液就会流入盖玻片的下方使标本着色。如果使用染缸进行染色，则待细胞悬液干了之后，固定、染色在染缸中进行。

2．实验步骤

（1）取少量四膜虫培养液涂于载玻片上，用牙签涂布开，空气中干燥。

（2）取少量酵母培养液同上操作。

（3）Carnoy固定液中固定10~30min。对照组1在预热（90℃）三氯醋酸溶液中处理15min。

（4）1N盐酸（60℃）浸15min。对照组2不经盐酸处理。

（5）入Schiff试剂作用40分钟到1小时（加罩，避光）。

（6）取出载玻片立即用新配制的亚硫酸氢钠溶液洗两次，每次2min。

（7）水洗2min，重复一次。

（8）0.1%亮绿染色10秒。取出后自来水略洗。

（9）空气中干燥，显微镜下观察。

（10）如所观察到的切片较好，可作封片。先用50%无水乙醇＋50%二甲苯处理3min。 （11）二甲苯处理2min。

（12）树胶封片。待干后可在显微镜油镜下观察。 （13）贴上标签，注明材料、反应名称、作者姓名及日期。

3．染色结果

处理 结果观察

实验组

对照组1

对照组2

实验组经Feulgen反应显示核结构细致、清晰，细胞核染成粉红色至紫红色，核仁不着色。经亮绿处理的细胞的细胞质部分显绿色。对照组1由于DNA被破坏，细胞核无紫红色。对照组2由于DNA没有释放出醛基，细胞核显示出被亮绿染上的绿色。如果亮绿处理时间过长，则会造成细胞核区颜色过深。

（五）注意事项

1．载玻片和盖玻片上面可能有油，最好事先浸泡在70%酒精（储存于冰箱）中，待使用时取出以柔软绸布擦净。

2．提供的实验材料四膜虫和酵母可能浓度较低影响观察，可事先用离心机离心后弃部分上清后搅匀，达到浓缩目的

3．涂片时最好在载玻片上端一角做好标记，以免实验时弄反正反面。涂片区不要超过载玻片长度的2/3，涂成直径约为1cm左右的圆。

4．涂片完需待其完全干燥后（可置于温箱中使其快干），方可置carnoy固定液中固定，否则涂上的细胞会大量脱落。

5．在Schiff试剂中染色（切记在避光处反应）时，如室温过低会影响染色效果，可置于30度左右温箱中。

6．亚硫酸氢钠溶液要现用现配，以防SO2的逸出而失效。

7．亮绿染色时间不能过长，否则整个细胞包括细胞核区均会染色过深而看不出紫红色。

（六）作业

1．简图表示Feulgen反应的染色结果。 2．对经过不同的处理后的染色结果观察后，比较其不同，进行分析。

3．为什么到Feulgen染色的最后步骤时，要迅速反复地用现配的亚硫酸氢钠溶液洗？

实验三、植物细胞骨架的观察

一、实验目的：

初步掌握在光镜下植物细胞骨架标本的制作方法。

二、实验原理：

用适当浓度的Tritonx-100处理植物细胞时，可将细胞内的蛋白质破坏，但却可以保留细胞骨架系统的蛋白质。后者用考马斯亮蓝染色，在光镜下可观察到细

胞骨架的网状结构。

三、实验用品：

（一）药品

1、 M缓冲液：50mM咪唑，0·5mM氯化镁，1mM EGTA[乙二醇双（a-氨基乙苯）醚四乙酸]，0·1mMEDTA（乙二胺四乙酸），1mM DTT（二硫苏糖醇）

2、 6mM PH6·5磷酸缓冲液（内含5mM KCl）

3、 1%Tritonx-100（用1液配制）

4、 3%戊二醛

5、 0·2%考马斯亮兰R250，用少许无水酒精溶解，然后用12·5%三氯醋酸定溶，装入滴瓶备用。

（二）用具：50ml烧杯、剪刀、镊子、手术刀、玻璃滴管、称量瓶（或青霉素小瓶）、显微镜、载玻片、盖玻片、吸水纸（或卫生纸）、温箱等。

四、实验材料：

新鲜、幼嫩的洋葱鳞茎内表皮

五、方法步骤：

1、用镊子撕取洋葱鳞茎的内表皮（取材时注意不要用靠近边缘的内表皮），剪成0·5-1cm大小，放入10ml，6mM，PH6·5的磷酸缓冲液中。

2、将材料取出，用1%Tritonx-100处理0·5-1小时，（28oC温箱），然后用M缓冲液洗3-5次，每次5分钟。

3、用3%戊二醛固定一小时（28oC温箱）。

4、用6mM，PH6·5的磷酸缓冲液洗3-5次，每次10分钟。

5、用0·2%考马斯亮兰R250染色15min-0.5h（在载玻片上进行）。

6、材料染色后用蒸馏水冲洗。

7、制片，在高倍镜或油镜下观察，可见到与核联系的细胞骨架及靠近细胞壁的网状结构。

六、注意事项：

1、 用Tritonx-100处理时，材料应浸泡入溶液

2、 染色时注意勿稀释药液

七、作业：

绘制洋葱鳞茎内表皮细胞的细胞骨架图。

实验四、SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

一. 实验目的：

1. 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理； 2. 掌握垂直板电泳的操作方法； 3. 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色方法

二. 实验原理：

SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。

SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。

三. 试剂和器材：

试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。 2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。 3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。

4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加1mol/L