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I he『esea rch『eviewed水产品中残留孔雀石绿的毒性与检测方法王邦国(靖远县农产品质量安全检验检测管理站730699)摘要：作为一种带有金属光泽绿色结晶体的孔雀石绿,在化学界中被称为四甲基代二氨基三苯甲烷,其在戊醇、乙醇、甲醇以及水中易于溶解,水溶液呈现蓝绿色,抗菌效力在药物染料中较强，可作为驱虫剂或杀菌剂，属于三苯甲烷类染料。
下面本文章将对水产品残留孔雀石绿的研究进展加以分析。
关键词:水产品;残留物质；孔雀石绿；研究进展在养殖过程中，我国曾以孔雀石绿作为清塘杀菌剂，同时，也常将孔雀石绿使用在存放池内和运输过程中，它们在鱼体内可分别代谢为无色结晶紫与无色孔雀石绿，因为其母体化合物与代谢物质存在较大的副作用，极易致突变、致畸、致癌，至此多数国家已经在20世纪90年代将孔雀石绿列为水产养殖禁用药用。
但是现阶段仍有一些渔民在违规使用,主要是因为孔雀石绿价格便宜,抗菌效果较好,所以有效监测孔雀石绿残留物质是至关重要的遥1孔雀石绿的分布与代谢情况进入机体后的孔雀石绿通常会经过生物转化，变成无色孔雀石绿，属于脂溶性的衍生物,极易残留在组织中。
一些业界人士发现，在鱼体内残留的孔雀石绿物质比水体中孔雀石绿的浓度明显要高,主要分布在内脏器官、皮肤、肌肉、肝脏、肾脏以及血浆中,同时体内也会蓄积孔雀石绿，特别是含有较多脂肪的组织中浓度水平更高。
在清除体内的孔雀石绿过程中，除脂肪含量影响与自身解毒能力外，还会受到环境因素的影响，如PH值和温度等。
在体内孔雀石绿的代谢方式有两条:首先，在还原酶的催化作用下,孔雀石绿可降解成无色孔雀石绿;其次，经N-脫甲基作用,在细胞色素催化下,生成次级或初级代谢产物芳香胺。
另外,无色孔雀石绿也有两条代谢方式:首先,基于氧化酶作用下,无色孔雀石绿会被重新氧化成孔雀石绿;其次,无色孔雀石绿经N-脫甲基作用，在催化作用下，酯化后与DNA形成DNA加合物。
2孔雀石绿的毒性与致毒机制据大量研究证实,在水产品中，孔雀石绿对动物的毒性较强,导致鱼皮肤和鳃上皮细胞轻度炎症,扩大肾小管壁细胞的胞核,使肾管腔有轻度扩张，甚至会影响鱼的生长与摄食,减少鱼肠中酶的分泌量。
KJ2017001水产品中孔雀石绿的快速检测胶体金免疫层析法水产品中孔雀石绿的快速检测胶体金免疫层析法（KJ201701）1 范围本方法规定了水产品及其养殖用水中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量的胶体金免疫层析快速检测方法。
本方法适用于鱼肉及养殖用水中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量的快速测定。
2 原理样品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿经有机试剂提取，吸附剂净化，正己烷除脂后，加入氧化剂将隐色孔雀石绿氧化成为孔雀石绿，经浓缩复溶后，孔雀石绿与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。
通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量进行定性判定。
3 试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
3.1 试剂3.1.1 正己烷。
3.1.2 乙腈。
3.1.3 冰乙酸。
3.1.4 盐酸。
3.1.5 吐温-20。
3.1.6 氯化钠。
3.1.7 对-甲苯磺酸。
3.1.8 无水乙酸钠。
3.1.9 盐酸羟胺。
3.1.10 无水硫酸钠。
3.1.11 中性氧化铝：层析用，100目~200目。
3.1.12 二氯二氰基苯醌。
3.1.13 氯化钾。
3.1.14 磷酸二氢钾。
3.1.15 十二水合磷酸氢二钠。
3.1.16 饱和氯化钠溶液：称取氯化钠（3.1.6）200g，加水500mL，超声使其充分溶解。
3.1.17盐酸羟胺溶液（0.25g/mL）：称取2.5g盐酸羟胺（3.1.9），用水溶解并稀释至10mL，混匀。
3.1.18 乙酸盐缓冲液：称取4.95g无水乙酸钠（3.1.8）及0.95g 对-甲苯磺酸（3.1.7）溶解于950mL水中，用冰乙酸（3.1.3）调节溶液pH为4.5，用水稀释至1L，混匀。
3.1.19 二氯二氰基苯醌溶液（0.001mol/L）：称取0.0227g二氯二氰基苯醌（3.1.12）置于100mL棕色容量瓶中，用乙腈（3.1.2）溶解并稀释至刻度，混匀。
水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法的改进与实践心得1范围本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢产物隐性孔雀石绿残留总量、结晶紫及其代谢产物隐性结晶紫残留量的高效液相色谱荧光测定方法。
2规范性引用文件本文主要参考了GB20361-2006水产品中的孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法以及Determination of Malachite Green and Leucomalachite Green in Salmon with In-Situ Oxidation and Liquid Chromatography with Visible Detedction并结合实践进行报告。
3原理样品中残留的孔雀石绿或结晶紫用硼氢化钾还原为其相应的代谢产物隐性孔雀石绿或隐性结晶紫，乙腈-乙酸铵缓冲溶液混合提取，二氯甲烷溶液液萃取，固相萃取柱净化，反相色谱柱分离，荧光检测器检测，外标法定量。
4试剂除另有规定外，所有的试剂均为分析纯，实验用水应为二级水。
4.1 乙腈：色谱纯。
4.2 二氯甲烷：色谱纯。
4.3 酸性氧化铝：分析纯，粒度0.071mm-0.150mm。
4.4 二甘醇。
4.5 硼氢化钾。
4.6 无水乙酸铵。
4.7 冰乙酸。
4.8 氨水。
4.10 硼氢化钾溶液（0.2mol/L）：称取0.27g硼氢化钾于烧杯中，加入25mL水溶解，现配现用。
4.11 20%盐酸羟胺溶液：溶解12.5盐酸羟胺在50ml水中。
4.12 对甲苯磺酸（0.05mol/L）：称取0.95g对甲苯磺酸，用水稀释至100mL容量瓶中。
4.13 乙酸铵缓冲溶液（0.1mol/L）：称取7.71g无水乙酸铵溶于1000mL水中，氨水调pH 到10.0。
4.14 乙酸铵缓冲溶液（0.125mol/L）：称取9.64g无水乙酸铵溶解于1000mL水中，用冰乙酸调pH到4.5。
4.15 酸性氧化铝固相萃取柱：500mg，3mL。
水产品中孔雀石绿快速检测方法
组织检测步骤：
鱼虾等去皮、脂肪，用均质器均质样本，称取2±0.05g均质物于15ml离心管；加入1瓶去脂试剂，振荡2min，室温4000rpm，离心3min。
倒掉上清液，把肉样弄松散（若要做添加实验，请在此刻加入添加物）；加入1瓶提取剂A，立即摇匀，然后加入1瓶提取剂B，充分振荡混合5min，室温4000rpm，离心5min；取上层有机层4ml到15ml离心管中，加入20ul衍生化试剂，涡旋1min，加入4ml净化剂，颠倒混匀1min，静置1min；取下层（溶液显紫红色）2ml，55℃下使用便携式空气吹干仪吹干；然后加入0.5ml缓冲液剧烈涡旋2min，待检。
检测:从包装中取出微孔，用移液器吸取待检液体80ul至微孔中充分吸打均匀，然后全部滴加至检测卡加样孔（检测卡平放），静置8-15分钟，根据示意图判读结果（见彩图）水样检测步骤：
①用移液器吸取80µl样本液至样品孔中。
②静置5-8分钟，根据示意图判读结果。
结果判定及示意图：
在试纸卡的中央判读区喷有2条线，上面一条为对照线(C线)，下面一条为测试线(T线)。
若样品液中孔雀石绿的浓度小于检测限时，则T线显色比C线强，或显色与C线相近；若样品液中孔雀石绿的浓度大于检测限时，则T线显色比C线浅很多或T线显绿色。
实验设备：
1、孔雀石绿快速检测卡；
2、PRO-12L空气吹干仪;
3、HH-1水浴锅；
4、80-2离心机；
5、均质器；
6、掌上电子天平。
142实验研究引言我国有着非常丰富的水产资源，在世界上属于水产养殖大国。
水产品作为我国城乡居民摄入动物蛋白的主要来源之一，在居民的生产生活中占据着极其重要的地位。
随着我国科学技术的进步，经济的快速发展，人民生活水平不断提高，对水产品的需求量也不断增长。
在养殖过程中，为降低生产成本，使用含有激素或者发生霉变的饲料，滥用抗生素、激素等渔用药物防治水产动物疾病，导致水产品药物残留超标，严重危害人类健康。
加强水产品中的渔药检测就显得尤为重要，本文阐述及归纳了水产品中孔雀石绿检测的常用方法，为水产品药物残留检测提供重要依据，对保障人类食品安全具有一定的意义。
1.孔雀石绿的常规检测方法1.1前处理方法1.1.1液液萃取液液萃取也称溶剂萃取或抽提，是指利用在溶液系统中两种或多种物质组分溶解度或分配系数不同的原理，使溶质物质从其中一种溶剂中转移到另一溶剂中提取方法。
通过静置过程，将出现分层现象的两种互不相容的物质进行分离的操作，叫做分液。
提取孔雀石绿的过程中常用的萃取溶液是二氯甲烷和无水乙醇。
它的优点是可以在常温条件下进行，操作较为方便，不需要特殊的实验装置和操作技术；缺点是有机溶剂的消耗量较大，挥发性较强的溶剂应尽量在通风橱内操作并做好个人防护工作。
1.1.2固相萃取固相萃取是于20世纪80年代发展起来的一种样品前处理技术，通常与液相色谱技术相结合，主要用于样品前处理的分离、提纯和浓缩过程。
它的原理是通过固相萃取小柱中的固体吸附剂吸附液体中的目标化合物，将样品的基质与干扰物有效的分离，再用洗脱液进行洗脱或者通过加热过程使目标化合物解吸附，最后经过氮吹或者旋蒸，达到浓缩与富集目标化合物的目的。
固相萃取的优点是操作简单，分离时间短，试剂消耗量少，可有效提高被测样品的回收率，对于痕量分析物有较为出色的检测能力；缺点是成本较高，属于一次性使用的实验耗材，同时需要专业人员进行方法开发。
1.1.3分散固相萃取净化技术分散固相萃取净化技术也称为QuEChERS技术，是2003年由美国农业部Anastassiades等人开发，提出之后又经过多次验证和方法改进正式确立。
孔雀石绿的测定本实验主要目标是通过酶标仪测定水产品中的孔雀石绿以及其衍生物的含量1 试验试剂：乙腈，试剂A，试剂B，酶标记浓缩物，酶标记稀释液，孔雀石绿样品稀释液，孔雀石绿100ppb标准液，氧化铝，底物溶液，停止液，蒸馏水2 实验仪器分析天平，组织粉碎机，精密移液器，50ml离心管,均质振荡器，通风柜，离心机，10ml塑料蓝盖试管，2ml 带塞小试管，水浴锅，氮气机，微孔计数板，酶标仪3 实验步骤1 先将所有试验试剂从冰箱中拿出来，于25-28度室温中放置1到2个小时后待用2 样品处理：将所测水产品去头去尾，去皮去骨取可吃部位，称20克左右，放入组织粉碎机充分粉碎后待用3 样品前处理：用分析天平称取5克样品，准确到0.0001克，放至50ml试管内，在通风柜内打开通风柜后。
用精密移液器使用5ml 一次性塑料移液管移取共10ml的乙腈到样品试管，用均质振荡器震荡10分钟，使样品鱼肉和乙腈充分混合。
再通过离心机（4200转/分钟）离心5分钟，（注意：使用离心机的时候，需要再加多一个离心管装水10ml保持离心机平衡，以免损坏离心机）4 精确称取3克中性氧化铝，准确到0.0001克，加入离心好的样品试管，再用离心机进行离心5分钟5 离心后的样品溶液取上层清液2ml到新的10ml蓝盖试管中，打开氮气机，当水浴锅温度设置在68度，放入试管，用氮气将样液吹干为止6 试剂A配制用2ml的带塞小试管配制，先移0.5ml 的试剂A入带塞小试管，再加入1.5ml乙腈，比例为1:3配制7将配制好1:3的试剂A移0.5ml至吹干的样品试管中，用振荡器混合三秒，静置30分钟8 称0.1克的试剂B加入静置30分钟后的样品试管，再静置10分钟9 从加入试剂B静置10分钟后的样品试管中，移取50ul(微升)上清液到10ml 带塞试管后再加入0.95ml 样品稀释液10 酶标记物配制：先移2.9ml酶标记物至10ml带塞试管后再加入0.1ml酶标记浓缩物即可11 取5个10ml带塞分别用笔0.405,0.135,0.045,0.015,0.0 05数字(a) 配制0.405ppb溶液：3.69ml标准稀释液到试管后再移取15ul（微升）100ppb孔雀石绿标准溶液混合即可配制完成(b)配制0.135ppb溶液：先移1ml标准稀释液到10ml 试管，再加入配制好的0.405ml溶液0.5ml混合即可成为0.135ppb溶液(c) 配制0.015ml溶液：先移1ml标准溶液到10ml试管，再加入配制好的0.135 ml溶液0.5ml混合即可成为0.015 ppb溶液（d）配制0.005 ml溶液: 先移1ml标准溶液到10ml 试管，再加入配制好的0.015ml溶液0.5ml混合即可成为0.005 ppb溶液12 取出混合板后，按0.405,0.135,0.045,0.015,0.0 05数字从小到大顺序分别移120ul（微升）到混合孔，最后移取样品液共6个孔，再加入120ul（微升）酶标记物溶液混合，轻轻震荡10秒13 从铝箔袋中拿出新的两条微孔条（注意：铝箔袋装的微孔条应避光收藏），再从混合板中移取200ul（微升）到微孔条的测试孔中，25-28摄氏度避光孵育30分钟14 孵育后，将微孔条的测试孔中溶液倒到水槽中，再用多管移液器移蒸馏水到各个孔眼中，震荡后倒掉，重复三次，总共四次洗板后，再在吸水纸上拍打微孔条，尽量将水拍干15 拍干水后，在各个孔眼中加入100ul（微升）底物溶液，在5-28摄氏度避光孵育30分钟16 孵育好的测试孔加入100ul（微升）停止液即可进行读数17 酶标仪先提早预热半个小时，再把样板微孔条放入酶标仪测试平台，再按下PLATE键送至酶标仪机内，打开电脑点击酶标仪桌面图标—点击登录—点击新建文件夹---出现新建程序---点击光度测量---选择上次测定数据（6孔眼的为孔雀石绿测定，7孔目为兽药测定）---点击运行---出现数据---记录数据---复制至另外文件夹附：通风柜的遥控器操作，A开关机 B 通风C 调风D 开关灯。
107实验研究孔雀石绿，又称为碱性绿、孔雀绿等，其为一类生物染色剂、染料，商品名中含有草酸盐及氯化锌两种规格，呈现翠绿色结晶体，主要包含两种结构式，即盐酸盐和无色孔雀石绿，易溶于水、乙醇及甲醇中，其水溶液呈现蓝绿色，在水生生物体内代谢产物变为无色孔雀石绿。
当前水产品感染孔雀石绿途径主要包含养殖、运输及存放，其中养殖户进行鱼苗孵阶段，会利用孔雀石绿将其各类鱼病防治。
孔雀石绿不仅拥有高毒素特征，而且致癌及致畸性较强，可在动物内长期存留，通过动物代谢之后转化为无色孔雀石绿，对人们健康构成严重威胁。
本次实践的主要内容是使用高效液相色谱法测定水体中孔雀石绿的残留量。
检测结果的准确性、稳定性有利于有关监管部门对水产养殖基地兽药使用的监控，对食品安全起到预警、监督作用。
1.材料与方法1.1仪器与设备本试验中主要涉及以下设备：Agilent 1100型高效液相色谱仪：配荧光检测器；Mettler Tolledo(PL202-L/100)百分一天平；IKA MS3 basic旋涡混合器；OA-SYS氮吹仪；CNW固相萃取装置;Thermo移液器（1mL 5mL 10mL ）；Microman微量移液器（20μL~100μL ）1.2材料与试剂乙腈：色谱纯；二氯甲烷；冰乙酸；氨水；孔雀石绿标准品(Dr.Ehrenstorfer GmbH)：纯度≥98%。
提取液：盐酸羟胺3g，对甲苯磺酸0.24 g溶于100 mL水中。
硼氢化钾溶液［ 0.2% ］：称取0.2 g硼氢化钾溶于100 mL水中，现配现用。
乙酸铵缓冲溶液［ 0.125mol /L］：称取9.64 g无水乙酸胺溶解1000 mL水中，用氨水调pH至4.5，过0.45μm滤膜备用。
乙酸铵缓冲溶液［ 0.1mol /L］：称取7.71 g无水乙酸胺溶解1000 mL水中，用氨水调pH至10.0，过0.45μm 滤膜备用。
PRS柱洗脱液：乙酸铵缓冲溶液（0.1mol /L）+乙腈=1+1，现配现用。
水产品中孔雀石绿药物残留检测技术研究进展孔雀石绿是一种广泛使用的有机合成染料，在水产品中常用作抗菌剂。
长期食用含有孔雀石绿的水产品可能会对人体健康造成潜在威胁，因为孔雀石绿被认为具有致癌和致畸作用。
为了保障食品安全，对水产品中孔雀石绿的药物残留进行检测已成为当前食品安全监管中的重要课题。
近年来，孔雀石绿药物残留检测技术方面取得了一系列重要的研究进展，本文将对该领域的研究现状进行综述。
一、传统检测方法早期的孔雀石绿检测方法主要依赖于色谱法，包括气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）和液相色谱法（HPLC）。
这些方法具有高灵敏度和准确性，但是需要昂贵的设备和复杂的操作过程，限制了其在实际监测中的应用。
这些方法还需要长时间的前处理步骤，使得检测周期较长，不适合大规模样品的快速筛查。
二、免疫分析方法近年来，免疫分析方法在孔雀石绿残留检测中得到了广泛应用。
免疫分析方法主要包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫层析法。
这些方法具有操作简单、快速、灵敏度高、专属性强等优点，可以实现大规模样品的快速筛查。
免疫分析方法也存在一些局限性，如易受样品复杂性和干扰物的影响，需要经过繁琐的前处理步骤、易受温度和湿度等环境条件的影响。
五、快速大样品检测技术随着社会经济的发展和人们对食品安全的关注度不断提高，快速大样品检测技术逐渐成为了研究热点。
针对孔雀石绿残留的检测，基于纳米材料和生物传感器技术的快速大样品检测技术也在不断完善中。
通过建立高通量的并行检测系统，可以实现对大批量样品的高效快速筛查，为食品安全监管工作提供了重要的技术支持。
六、发展趋势和挑战随着科学技术的不断进步，孔雀石绿残留检测技术也将不断得到改进和完善。
在未来的研究中，需要重点解决以下几个方面的问题：一是提高检测技术的灵敏度和特异性，以满足对孔雀石绿残留的更加严格的监管要求；二是研发更加便捷、快速的样品前处理技术，以缩短检测周期和降低成本；三是建立完善的质量控制和标准化方法，确保检测结果的准确性和可比性；四是加强与食品安全监管部门和食品生产企业的合作，推动检测技术的产业化应用。
