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一种链霉菌及其发酵产乐普霉素b的方法与
流程
链霉菌是一种常见的细菌，具有潜在的药物研发价值。
本文介绍了一种链霉菌
及其发酵产乐普霉素B的方法与流程。
首先，选择适合的链霉菌菌株。
链霉菌菌株的选择对于乐普霉素B的产量和质量非常重要。
通常，根据菌株的菌落形态、生长速度和产物产量等特性进行筛选，以获得高产量的菌株。
接下来，进行链霉菌的培养。
链霉菌属于革兰氏阳性菌，通常采用液态发酵的
方法进行菌株的培养。
需要选择合适的培养基，添加适量的碳源、氮源和矿物盐等，以提供菌株生长所需的营养物质。
发酵产乐普霉素B的关键是调节菌株的生长条件。
菌株在适宜的温度、pH值
和气体供应下能够获得更高的产量。
通常，发酵过程中要严格控制温度在28-32摄
氏度之间，pH值在6-8之间，并为菌株提供充足的氧气。
另外，添加适量的诱导剂也是促进乐普霉素B产量的重要措施。
通常，通过向培养基中添加特定的诱导剂，如乐普霉素B的前体物质或其类似物，可以刺激链
霉菌产生更多的乐普霉素B。
最后，经过一定时间的发酵培养，链霉菌菌体中的乐普霉素B会达到一定的浓度。
此时，可以采用适当的分离和提纯方法，如离心、过滤和柱层析等技术，以获得纯度较高的乐普霉素B产物。
总之，通过选择适合的链霉菌菌株，进行合理的发酵培养条件和添加适量的诱
导剂，可以高效地产生乐普霉素B。
这种方法与流程为乐普霉素B的生产提供了
可行的方案，对于药物研发和生产具有重要意义。
链霉菌实验操作1录入时间:2009/8/28 16:09:31 来源：食品科技网一、培养基、抗生素、生长因子常用抗生素及其使用浓度抗生素英文名称及缩写抗性基因贮藏液浓度(mg/ml)使用终浓度（μg/ml）链霉菌大肠杆菌MM2CMYEMELA或LB氨苄青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壮观霉素链霉素硫链丝菌素红霉素阿泊拉霉素Ampicillin, AmpChloramphenicol, CmlHygromycin, HygKanamycin, KmSpectinomycin, SpcStreptomycin, StrThiostrepton, ThioErythomycin, EryApramycin, Amblacathygaac或aphaadAstrtsrerm Eaac(3)IV10025(无水乙醇配)5025505025(DMSO配)10050R10102?501051010R－2550502510－50R－－－50－2.5－5050-1002550505025不敏感2030-5*–表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制*此表仅供参考！！！*R表示不敏感*Km 和Am有交叉抗性，所以同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并作好对照。
*Hyg易见光分解，应用锡箔纸包好。
*有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg, Km, VioLB（Luria-Bertani）培养基胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 5g，葡萄糖1g，蒸馏水加至1000ml，pH7.3左右（灭菌后第一次用时还要调一次）LALB中加入终浓度为1.5-2%的琼脂粉(不同的琼脂加的量不同，如青岛琼脂大概需1.5%，而华美的需要2%)。
＊做蓝白斑筛选时不加葡萄糖基本培养基（MM）溶液：L-天冬酰胺0.5g，K2HPO4 0.5g,MgSO4·7H2O 0.2g,FeSO4·7H2O 0.01g,蒸馏水至1000ml将每250ml溶液分装到装有2.5g琼脂的500ml三角瓶中，灭菌，使用时每瓶加入50％葡萄糖（8磅灭菌）5ml，调pH7.0。
实验七 链霉素发酵及管碟法测定生物效价微生物发酵（一）目的要求了解抗生素发酵的基本过程。
了解管碟法测定抗生素生物效价的基本原理。
学会管碟法测定抗生素效价方法，并学习抗生素发酵过程一些重要生理生化指标分析。
（二）基本原理链霉素是由灰色链霉菌(放线菌的一种)产生的一种氨基糖苷类抗生素，它既含有氨基糖苷，也含有氨基环醇的结构，属抗革兰氏阴性菌的抗生素。
抗生素液体发酵共分三大工序：菌种、发酵、提炼。
配合三个工序还有分析化验和有关产物测定。
菌种种子质量指标：无杂菌，全部形成孢子，摇瓶发酵效价达35000U/ml 以上(30℃，48 h 培养)，方可用于生产。
发酵抗生素发酵过程除需经常镜检排除杂菌污染外，接种12h 后，每2h 进行一次pH 、生物量、总糖、还原糖、氨基氮及抗生素效价测定。
一级种子质量指标：无杂菌，全部放线菌，菌丝粗壮整齐，无断裂；pH7.0~7.2。
二级发酵质量指标：菌丝粗壮整齐，无断裂，菌丝成网状；pH7.2；链霉素效价10000～35000U/ml 。
提炼砂子孢子 (4℃±1℃冰箱保存) 第一代孢子(28℃高氏1号培养基，培养5d) 第二代孢子 (28℃高氏1号培养基，培养5d) 种子罐发酵(一级，种子培养基) 30℃±2℃培养12~16h 发酵罐发酵(二级，发酵培养基) 28~30℃，培养48h 放罐 中和、氧化、过滤 发酵液 草酸酸化 板框压滤 滤液 加NaOH 中和 板框压滤 中和滤液 上离子交换柱 板框压滤 饱和树脂 1 mol/L H 2SO 4 解 吸 解吸液 中和氧化滤液 加氨水沉淀 离心甩干，洗去氨 链霉素游离碱 (白色沉淀) 加6 mol/L H 2SO 4调pH 6.0~6.5，溶解 加NaOH 及KMnO 4 链霉素硫酸盐喷雾干燥 白色粉末(成品)衡量抗生素发酵液中抗菌物质的含量称效价。
抗生素效价测定可采用化学法或生物效价测定法。
生物效价测定有稀释法、比浊法、扩散法三大类。
链霉菌感受态制备
链霉菌感受态制备是指培养链霉菌（ Streptomyces）细菌以产生其次级代谢产物。
次级代谢产物是链霉菌细菌在特定条件下产生的化合物，这些化合物对医药、农业和工业等领域有着重要的应用。
以下是一般的链霉菌感受态制备步骤：
1.链霉菌培养：
•选取合适的菌株：选择具有产生特定次级代谢产物潜力的链霉菌菌株。
•培养基准备：准备适宜的培养基，其中包括合适的碳源、氮源、微量元素和其他必要的营养物质。
2.发酵过程：
•接种培养基：将链霉菌接种到培养基中，培养并进行前期发酵过程。
•调控培养条件：控制发酵过程中的环境因素，如温度、pH、氧气供应和搅拌速度等。
这些条件会影响细菌的生长和次级代谢产物的生成。
•感受态诱导：在特定的生长阶段，通过改变培养条件（ 如添加特定的诱导剂或改变营养物质含量）来诱导链霉菌产生次级代谢产物。
3.次级代谢产物提取和分离：
•菌体分离：通过离心或过滤等方法分离菌体。
•次级代谢产物提取：利用化学方法或生物技术手段从菌体培养物中提取次级代谢产物。
•分离纯化：通过色谱、层析等技术对提取的混合物进行分离和纯化，得到目标产物。
4.评估和应用：
•活性评估：对获得的次级代谢产物进行活性评估和检测，确定其可能的生物学活性和潜在应用价值。
•应用研究：将获得的活性物质进行进一步研究，包括药理学、医药化学、生物学等方面，以确定其在医学、农业、工业等领域的应用潜力。
链霉菌感受态制备是一个复杂的过程，需要仔细设计实验条件和严格控制培养环境，以获得理想的次级代谢产物。
同时，对产物的提取、分离和评估也需要具备专业的技术和设备。
aa。
第1篇一、实验目的1. 了解发酵工程制药的基本原理和过程；2. 掌握微生物发酵生产药物的方法；3. 熟悉发酵过程中主要参数的检测和控制；4. 提高实验操作技能和数据分析能力。
二、实验原理发酵工程制药是指利用微生物的代谢能力，通过发酵过程生产具有药用价值的生物活性物质。
发酵过程包括菌种选育、培养基配制、种子扩大培养、发酵过程、分离纯化等环节。
三、实验材料与仪器1. 材料与试剂：葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、琼脂、硫酸铵、磷酸二氢钾、氢氧化钠、盐酸、氯化钠等；2. 仪器与设备：发酵罐、摇床、超净工作台、高压灭菌锅、电子天平、pH计、分光光度计、离心机、无菌操作工具等。
四、实验步骤1. 菌种选育：从土壤样品中分离筛选得到一株能够产生抗生素的微生物，经过纯化、鉴定和保存；2. 培养基配制：根据微生物生长需求，配制适宜的培养基；3. 种子扩大培养：将纯化后的菌种接种到试管斜面培养基上，置于恒温培养箱中培养；4. 发酵过程：将活化后的种子液接种到发酵罐中，控制发酵温度、pH值、溶氧量等参数，进行发酵；5. 发酵过程监测：定期检测发酵液的pH值、溶氧量、菌体浓度等参数，确保发酵过程顺利进行；6. 分离纯化：发酵结束后，对发酵液进行分离纯化，得到目标产物；7. 数据分析：对实验数据进行统计分析，得出实验结果。
五、实验结果与分析1. 菌种选育：成功分离筛选得到一株能够产生抗生素的微生物，经过鉴定为链霉菌属；2. 培养基配制：根据微生物生长需求，配制了适宜的培养基；3. 种子扩大培养：菌种在试管斜面培养基上生长良好，菌落形态典型；4. 发酵过程：发酵过程中，发酵液的pH值、溶氧量、菌体浓度等参数均在适宜范围内，发酵过程顺利进行；5. 分离纯化：发酵液经过分离纯化，得到目标产物；6. 数据分析：通过实验数据统计分析，得出以下结论：（1）该菌株在发酵过程中，发酵液的pH值、溶氧量、菌体浓度等参数均在适宜范围内；（2）发酵液中的目标产物含量达到预期水平；（3）分离纯化过程中，目标产物纯度较高。
1 绪论维生素B 12是一种水溶性维生素。
只需少量即能产生效果， 为深红色结晶或结晶粉末又称为红色维生素（red vitamin ）或氰钴胺。
维生素 B 12具有广泛的生理作用，它参与体内甲基转换及叶酸代谢，促进神经髓鞘中脂蛋白的形成，保持中枢神经和外周髓鞘神经纤维的功能完整，参与广泛的蛋白质及脂肪代谢等。
其计量单位为微克（mcg ——microgram ，即1/1000000克）。
现在维生素B 12 的发酵常用菌种为放线菌中的链霉菌。
1.1 链霉菌的简介链霉菌 -链霉菌属（streptomyces)，其基内菌丝多分枝，一般横隔稀疏，很少断裂，常产生各种水溶性或脂溶性的色素；气生菌丝比基内菌丝稍粗，为外鞘所包，气生菌丝部分分化成直形、柔曲、钩环状至松敞或紧密螺旋形的孢子丝，时常含50个左右的孢子，短者含5～10个孢子。
本属菌种数最多，分类鉴定比较困难，一般认为孢子丝的形状、孢子的表面结构、孢子的颜色和在有机培养基内是否产生类黑色素是最主要的分类指征。
它们在土壤中分布极广，大多在人工培养基上生长茂盛，少数是植物致病菌。
因许多种是抗生素的产生菌而且产生抗生素的种类最多而著名（如链霉素）。
在维生素B 12发酵中，我们采用国内比较常用的灰色链霉菌及其变种。
灰色链霉素的孢子柄直而短，不呈螺旋。
孢子量多，呈椭圆球形。
气生菌丝和孢子都呈白色，单菌落生长丰满，呈梅花形或馒头形，直径3-4mm 。
基质菌丝透明，在斜面背后产生淡棕色色素。
菌种采用沙土管或冷冻干燥保藏。
1.2 维生素B 12结构与性质维生素B 12（VB 12）为钴胺素（Cobalamin ）类化合物，它的分子中有4个还原性吡咯环联结在一起，这种构叫做咕啉，它与核苷酸（二甲基苯异咪唑）及核糖相联，另一方面与D-1-氨基-2-丙醇相连，钴与核苷酸之N相偶联。
化学上称氰钴胺素为维生素B12，除CN后称钴胺至少。
CN可为其他基团代替，成为不同类型的钴胺素。
发酵工程制药实验：链霉菌发酵发酵工程制药实验是制药技术中的重要环节，通过对发酵过程的研究和实验，可以获得制造高质量药品的关键信息。
本文将介绍在实验室中进行链霉菌发酵的方法和步骤，并分析其中的关键因素。
实验目的链霉菌（Streptomyces）是一种广泛存在于自然界中、能够产生许多重要生物活性分子的细菌。
它们具有产生抗生素、抗肿瘤剂、免疫抑制剂等药物的能力，因此被广泛用于制药和医疗领域。
链霉菌的发酵实验可以帮助我们掌握其生长和代谢规律，了解影响链霉菌生长的因素如何调控，探索最优的发酵条件以提高目标产物的产量和纯度等。
因此，本实验的主要目的是：通过链霉菌发酵的实验，掌握发酵工程制药实验的基础理论和操作技巧，探索链霉菌发酵的优化条件。
实验步骤1. 配置培养基链霉菌生长需要适当的培养基，因此我们需要配置基于木质素和琼脂的培养基，其中需添加铁、镁等元素和麦芽糊精等营养成分。
将制备好的固体培养基加入烧过的三角瓶中，用自来水洗净后，用酒精灯加热瓶口和瓶颈，使其不受污染。
2. 实验前消毒和预先培养试管将消毒瓶（80%乙醇）放在洁净桌面上，将三角瓶紫外线灯消毒30分钟，然后将三角瓶横放在洁净桌面上，从洁净试管中取出玻璃珠，放入三角瓶内，用酒精灯烘干瓶口后盖上。
将预备菌株（常见的链霉菌菌株如海洋链霉菌、链霉菌菌株NRRL2234）在木质素琼脂平板上通过接种的方式进行预先培养。
3. 移液接种在曝气装置中注入适量空气使溶液震荡，将链霉菌菌液铸在劳氏肉汤培养基中，在摇床上进行培养。
培养过程中要定时观察并调节培养条件如温度、曝气速率和PH值等。
通过留取一定量的液体给种管，在适当的体积下移液接种，使样品达到合适的菌落密度。
4. 发酵条件的优化掌握适宜的链霉菌发酵条件对于产品的质量和产量至关重要。
在实验的不同时间点，进行样品的收获和检测，并结合实验室提供的分析工具和技能对链霉菌发酵进行分析和诊断，探寻出最适宜的发酵条件，从而可提高产品产量和质量，开发出更多的新药品。
第1篇一、实验目的1. 掌握链霉素发酵的基本原理和操作步骤。
2. 了解发酵过程中关键参数的调控对发酵效果的影响。
3. 通过实验，优化链霉素发酵培养基配方，提高发酵效率。
二、实验原理链霉素是一种重要的氨基糖苷类抗生素，由灰色链霉菌发酵生产。
发酵过程中，灰色链霉菌将葡萄糖等碳源转化为链霉素，同时产生一定的热量和二氧化碳。
发酵过程中，温度、pH值、通气量等参数对发酵效果有显著影响。
三、实验材料1. 菌种：灰色链霉菌2. 培养基：黄豆饼粉培养基、葡萄糖、硫酸铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等3. 仪器：锥形瓶、移液管、pH计、生物传感仪、分析天平、发酵罐等四、实验步骤1. 菌种活化：将灰色链霉菌接种于黄豆饼粉培养基中，37℃恒温培养24小时，活化菌种。
2. 培养基配制：按照实验设计，将黄豆饼粉、葡萄糖、硫酸铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等原料称量，加入适量水，搅拌均匀，制成发酵培养基。
3. 发酵：将活化后的菌种接种于发酵培养基中，置于发酵罐中，控制温度、pH值、通气量等参数，进行发酵实验。
4. 发酵过程监测：定时取样，测定发酵液中的链霉素浓度、pH值、残糖等指标，分析发酵过程的变化。
5. 发酵终止：当发酵液中的链霉素浓度达到预定目标时，终止发酵，收集发酵液。
6. 发酵产物提取：采用适宜的提取方法，从发酵液中提取链霉素。
五、实验结果与分析1. 发酵过程中关键参数的调控：（1）温度：发酵过程中，链霉素产量随温度升高而增加，但过高温度会导致菌体死亡，降低发酵效果。
实验结果表明，发酵温度以28-30℃为宜。
（2）pH值：发酵过程中，pH值对链霉素产量有显著影响。
实验结果表明，pH值以6.5-7.0为宜。
（3）通气量：发酵过程中，通气量对链霉素产量有显著影响。
实验结果表明，通气量以0.5-1.0L/h为宜。
2. 发酵培养基配方优化：通过正交实验，优化发酵培养基配方，结果表明，最佳培养基配方为：黄豆饼粉2.0%、葡萄糖2.0%、硫酸铵1.0%、磷酸二氢钠0.5%、磷酸氢二钠0.5%。
实验2灰色链霉菌的活化一、实验目的学习制备高氏一号斜面培养基的方法以及斜面接种技术。
二、实验原理高氏一号斜面培养基是一种合成培养基，用于培养放线菌。
三、实验试剂与仪器1. 菌种：灰色链霉菌；2. 培养基：可溶性淀粉20g，硝酸钾1 g，氯化钠0.5 g，磷酸氢二钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，琼脂20 g，水1000毫升，PH7.2—7.4（配制时注意，可溶性淀粉要先用冷水调匀后再加入到以上培养基中）；3. 器材：天平、500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、纱布、18mL×180mL试管、棉花、电炉、烧杯、记号笔、酒精灯、接种环等。
四、实验步骤1. 高氏一号培养基的制备（1）按配方称量药品，加热搅拌至琼脂完全熔化，补水至1000mL。
趁热分装于18mL×180mL试管，斜面以8mL为宜。
（3）分装完毕后，塞好棉塞并将试管捆扎好。
高压蒸汽灭菌：121℃灭菌20min，灭菌后趁热摆斜面。
2. 斜面接种接种是将纯种微生物，在无菌操作条件下，移植到已灭菌并适宜该菌生长繁殖所需要的培养基中。
为了获得微生物的纯种培养，要求接种过程中必须严格进行无菌操作。
一般是在无菌室内，超净工作台或实验台酒精灯火焰旁进行。
（1）左手拿试管菌种，右手拿接种环，先将金属环烧灼灭菌，再将接种环在空白培养基处冷却，挑取菌落，在火焰旁稍等片刻。
（2）左手将试管菌种放下，拿起斜面培养基。
在火焰旁用右手小指和手掌边缘拔下棉塞并夹紧，迅速将接种环伸入空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接种于其上。
划线时由底部向上划一直线，一直划到斜面的顶部。
注意勿将培养基划破，不要使菌体沾污管壁。
（3）灼烧试管口，在火焰旁将棉塞塞上。
接种完毕，接种环上的余菌必须灼烧灭菌后才能放下。
（4）斜面置于28℃恒温箱中，培养5～6d观察结果。
实验3 灰色链霉菌的摇瓶种子制备一、实验目的学习制备摇瓶种子培养基的方法以及种子扩大培养技术。
二、实验原理种子扩大培养简称种子扩培，是发酵工程的一个组成部分，其指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。
其目的首先是出于接种量的需要与菌种的驯化，同时对于缩短发酵时间、保证生产水平也有帮助。
种子扩培的一般过程是：斜面菌种→ 一级种子培养（摇瓶）→ 二级种子培养(种子罐) → 发酵对于种子制备过程，其大致可区分为实验室阶段和生产车间阶段，前期不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此将这一培养过程称为实验室阶段的种子培养。
而后期种子培养在种子罐里面进行，一般在工程上归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。
并非所有的种子扩大培养都采用从摇瓶到种子罐的二级发酵模式，其实际发酵级数受到发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。
摇瓶培养技术问世于本世纪30年代，由于其简便、实用，广泛用于微生物菌种筛选、实验室大规模发酵试验、种子培养等。
摇瓶培养设备主要有旋转式摇床和往复式摇床两种类型，其中以旋转式最为常用。
振荡培养中所使用的发酵容器通常为三角烧瓶，也有使用特殊类型的烧瓶或试管。
振荡培养技术通常用于微生物菌种的筛选或生产工艺的改良和工艺参数的优化。
在摇瓶培养过程中振荡的目的在于改善活细胞的氧气和营养物的供给。
摇瓶培养通常以特定生长条件下的培养物接种，也可用孢子接种。
振荡培养是建立深层发酵的开始，就一特定微生物而言，振荡培养时存在一最佳培养基配方和最佳培养基容量。
细胞或孢子接种浓度对试验的成功极为重要，不同的微生物细胞或孢子以及不同的振荡培养过程的接种浓度差异可能是十分显著的，且各自存在一最适浓度。
三、实验试剂与仪器1. 菌种：灰色链霉菌（由实验二活化得到）；2. 培养基：豆饼粉20g、淀粉40g、酵母膏5g、蛋白胨5g，硫酸铵3g，硫酸镁0.25g，磷酸二氢钾0.2g，碳酸钙4g，自来水1000mL、pH7.2-7.4。
3. 器材：天平、500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、纱布、250mL三角瓶、棉花、电炉、烧杯、记号笔、酒精灯、接种环等。
四、实验步骤1. 摇瓶种子培养基的制备取干净三角烧瓶，250ml三角瓶分装培养基30-50ml，用棉塞包扎瓶口，再加牛皮纸包扎，在0.1MPa下灭菌45-60min。
2. 接种将活化的菌种斜面，在无菌的条件下，注入10mL无菌水，震荡成孢子悬浮液（孢子浓度约为8×104个/mL）。
待发酵培养基灭菌后冷却到28℃时，分别将孢子悬浮液接入三角瓶中，接种量为2mL，标好记号。
3. 培养与观察28℃、200r/min旋转式摇床培养24h，观察菌丝体形态及浓度。
实验4 灰色链霉菌摇瓶发酵一、实验目的学习和掌握摇瓶发酵培养的原理和方法。
二、实验原理链霉素是一种从灰链霉菌的培养液中提取的抗菌素，属于氨基糖甙碱性化合物，它与结核杆菌菌体核糖核酸蛋白体蛋白质结合，起到了干扰结核杆菌蛋白质合成的作用，从而杀灭或者抑制结核杆菌生长的作用。
链霉素是含有链霉胍的氨基糖苷类抗生素族中的主要成员，由链霉胍、链霉糖和N－甲基-L-葡萄糖胺构成的糖苷，其结构式如下。
链霉素中链霉糖部分的醛基被还原成伯醇基后，就成为双氢链霉素，它的抗菌效能和链霉素大致相同，目前临床上使用的是链霉素或双氢链霉素的硫酸盐。
生产过程分为两大步骤：①发酵，将冷干管或沙土管保存的链霉菌孢子接种到斜面培养基上，于27℃下培养7天。
待斜面长满孢子后，制成悬浮液接入装有培养基的摇瓶中，于27℃下培养45～48小时待菌丝生长旺盛后，取若干个摇瓶，合并其中的培养液将其接种于种子罐内已灭菌的培养基中，通入无菌空气搅拌，在罐温27℃下培养62～63小时，然后接入发酵罐内已灭菌的培养基中，通入无菌空气，搅拌培养，在罐温为27℃下，发酵约7～8天。
②提取精制，发酵液经酸化、过滤，除去菌丝及固体物，然后中和，通过弱酸型阳离子交换树脂进行离子交换，再用稀硫酸洗脱，收集高浓度洗脱液──链霉素硫酸盐溶液。
洗脱液再经磺酸型离子交换树脂脱盐，此时溶液呈酸性，用阴离子树脂中和后，再经活性炭脱色得到精制液。
精制液经薄膜浓缩成浓缩液，再经喷雾干燥得到无菌粉状产品，或者将浓缩液直接做成水针剂。
三、实验试剂与仪器1. 菌种：灰色链霉菌摇瓶种子（由实验三获得）2. 摇瓶发酵生产培养基：水解糖160g、尿素5g（单独灭菌）、MgSO40.5g、Na2HPO41.6g、玉米浆25~35g、FeSO4和MnSO4各20mg/L，消泡剂0.3g，，水1000mL，pH7.2。
3. 仪器：500m1三角烧瓶、旋转式摇床等。
四、实验步骤1. 摇瓶发酵培养基的制备取干净三角烧瓶，250ml三角瓶分装培养基30ml，用8层纱布包扎瓶口，再加牛皮纸包扎，在115℃下灭菌20min。
2. 接种待发酵培养基灭菌后冷却到30℃时，按接种量8%~10%进行接种。
3. 培养与观察32℃、100r/min旋转式摇床培养36h~40h，发酵过程中，补加灭菌尿素以增加氮源，维持pH值。
五、思考题1. 观察菌丝形态，用试纸测发酵液的pH值，并补加灭菌尿素。
2. 试举例说明摇瓶培养技术的应用。
实验5 灰色链霉菌发酵产物活性测定一、实验目的学习和掌握抗生素抑菌性能的测定方法。
二、实验原理抗生素是一种生理活性物质，它对生命现象很敏感，可以用抗生素的生物效能表示它的效价，其最小效价单元就叫做“单位”(U)。
经由国际协商规定出来的标准单位，称为“国际单位”(IU)。
通常各种抗生素的单位，是根据国家抗生素标准品测定出来的，是衡量药物有效成份的一种尺度。
抗生素的剂量常用重量和效价来表示。
化学合成和半合成的抗菌药物都以重量表示，生物合成的抗生素以效价表示，并同时注明与效价相对应的重量。
效价是以抗菌效能(活性部分)作为衡量的标准，因此，效价的高低是衡量抗生素质量的相对标准。
理论效价是指抗生素纯品的重量与效价单位的折算比率。
一些合成、半合成的抗生素多以其有效部分的一定重量（多为1μg）作为一个单位，如链霉素、土霉素、红霉素等均以纯游离碱1μg作为一个单位。
少数抗生素则以其某一特定的盐的1μg或一定重量作为一个单位。
如链霉素碱为1000单位/mg，链霉素硫酸盐为798单位/mg，金霉素和四环素均以其盐酸盐纯品1μg为1单位，青霉素则以国际标准品青霉素G钠盐0.6μg为1单位。
抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法（cylinder plate method）。
管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。
管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.lmm，外径8.0±0.lmm，高10±0.lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，抗生素扩散的有效范围内则产生透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。
抑菌圈直径大小与抗生素浓度相关，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。
抗生素效价常采用二剂量法。
将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例（2:1或4:1）的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效价。
取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置4个小钢管，管内分别放入检品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。
本法的优点是灵敏度高，需用量小，测定结果较直观，测定原理与临床应用的要求一致，更能确定抗生素的医疗价值；而且使用范围广，较纯的精制品、纯度较差的制品、已知的或新发现的抗生素均能应用；对同一类型的抗生素不需分离，可一次测定其总效价，是抗生素药物效价测定的最基本方法。
三、实验试剂与仪器1. 测定用指示菌：枯草芽孢杆菌[CCMCC(B) 63 501]2. 仪器：分光光度计、离心机、培养箱、水浴锅、高压蒸汽灭菌锅、牛津小杯（不锈钢小管，内径6.0±0.lmm，外径8.0±0.lmm，高10±0.lmm）、培养皿等。
3. 培养基（1）传代用培养基（用于枯草芽孢杆菌菌传代和保藏）：蛋白胨10g，牛肉膏3.0g，氯化钠5.0 g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH7.2-7.5。
（2）生物测定用培养基（培养基I）蛋白胨5g，牛肉浸出粉3g，琼脂15~20g，磷酸氢二钾3g ，蒸馏水1000mL，除琼脂外，混合上述成分，调节PH值使比最终的pH值略高0. 2-0.4，加人琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为7. 8〜8. 0，在115℃，灭菌30分钟。
