DNA重组技术的基本工具课件

基础理论和技术发展催生了基因工程
E·coliDNA连接酶
3)1977年DNA合成和测序技术的发明
E·coli DNA连接酶
或T4DNA连接酶
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到识别序列的
碱基上，使限制酶不能将其切开。
这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
——特异性
（1）识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列
（2）在特定的位点切割DNA分子。
例如：大肠杆菌的EcoRⅠ限制酶只能识别GAATTC序
列，并在G和A之间切开。
“分子手术刀”---限制性核酸内切酶(限制酶)
• 限制酶的识别序列：
能被限制性内切酶特 大异多性数识限别制的酶切的割识部别位序都列具由
操作。
实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要 进行人工改造后才能用于基因工程操作。
思考与探究 P7
4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？
迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具 有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还 不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA 的酶。
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到识别序列的
碱基上，使限制酶不能将其切开。
Haemophilus influenzae d )中先
后分离到3种限制酶，则分别命名为:
HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成 少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成

小结:
限制酶
主要存在于原核生物中 具有专一性(识别序列) 切开DNA分子的磷酸二酯键
基因工程 的工具
DNA连 接酶
连接磷酸二酯键
种类
E.coliDNA连接酶 T4 DNA连接酶
结构简单,大小适中
能在宿主细胞中自
运载 工具
具备的 条件
我复制并稳定存在 具一个多个限制酶切位点 具标记基因
质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒
课堂练习
1.在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的
DNA片段，需使用（ A ）
A.同种限制酶
B. 两种限制酶
C.同种连接酶
D. 两种连接酶
2.不属于质粒被选为基因运载体的理由是（ D ） A .能复制 B .有多个限制酶切点 C .具有标记基因 D .它是环状DNA
3. 基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。 在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的 步骤是 （ C ） A . 人工合成目的基因 B .目的基因与运载体结合 C .将目的基因导入受体细胞 D .目的基因的检测和表达
• 什么叫黏性末端？
什么叫平末端？
限制酶存在于原核细胞中的作用是什么？ 为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？
二、ＤＮＡ连接酶——“分子缝合针”
１.作用：连接磷酸二酯键
２.DNA连接酶的种类
限制酶切割后产生两种不同的末端。那么恢复它们的连 接时，所用DNA连接酶是否可以不加选择？ E.coliDNA连接酶：连接黏性末端 T4DNA连接酶：连接黏性末端和平末端
DNA聚合酶和DNA连接酶有何相同点和不同点？
连接DNA链 连接部位
DNA连接酶
双链
在两DNA片段之 间形成磷酸二酯键

1、来源：主要从原核生物分离纯化出来
2、种类： 4000种。
3、作用： 识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸
序列，并且使每一条链中特定部位的两 个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
4、切割方式：错位切和平切
5、结果：形成两种末端
黏性末端 平末端
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
二、分子缝合针——DNA连接酶
DNA连接酶的作用过程：
A
T
T
A
连接酶连接磷酸二酯键
G
C
C
G
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
磷 酸 二 酯 键
5
A
4
1
3
2
5
T
4
1
3
2
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
§1-1 DNA重组技术的基本工具
“分子手术刀” ──限制酶 “分子缝合针” ──DNA连接酶 “分子运输车”
──基因进入受体细胞的载体
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
一、“分子手术刀” ——限制性核酸内切酶
基因工程培育抗虫棉的简要过程：
苏云金芽孢杆菌
提取
普通棉花(无抗虫特性)

基因工程(gene engineering)
• 又称基因拼接技术,或DNA重组 技术。 通俗的说，就是按照人们的意愿，进行 严格的设计，并通过体外DNA重组和转 基因等技术，赋予生物经新的遗传特性， 从而创造出更符合人们需要的新的生物 类型和生物产品。
DNA重组技术的基本工具优秀课件
设想
让禾本科植物也能 固氮？ 根瘤菌的固氮作用
为你 作什能用么推是限测什制限么酶吗制不酶？剪存切在细于菌原本核身生的物D中NA的？
通 的 的 基 不原在制菌利安能过 细 识 转长核，全的用长 胞 别 移将期以。生一 限的防 所物种 制期，切到其进止 以易酶防的其割所切化外 ，受御将进序识开D过来限自性外N化 列 别。程病制然工源A， 序，这分中原酶界具DN细 列或样形物在外，子A切菌 的者，成的原源当中割了侵核外D中 碱通尽不N掉一害生源含 基管过A具的，套。物D有 上细甲备N入以完中限A某 ，菌基这侵侵保善主制种 使中化种入证，的要酶限限含酶自时但防起限就制制有将身，生御到是制的会物机切细酶酶某甲酶 种割限外制源D酶N也A、不使会之使失自效身，从的而D达N到A被保切护自断身，的并 且目可的以。 防止外源DNA的入侵。
DNA连接酶的作用
把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将 脱氧核糖和磷酸连接起来催化形成磷酸二酯 键
DNA重组技术的基本工具优秀课件
DNA连接酶的缝合作用
可把黏性末端之间的 缝隙“缝合”起来，
两DNA片段要具有互补 的黏性末端才能拼起来
注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口， 但不能连接单链DNA！
①细菌的质粒 ②病毒：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。
DNA重组技术的基本工具优秀课件
最常用运载体——质粒