中国小型猪品种遗传多样性的RAPD研究
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研究简报中国小型猪品种遗传多样性的RAPD 研究3樊斌刘榜余梅赵书红朱猛进熊统安彭中镇李奎(华中农业大学动物科技学院动物分子生物学与育种实验室,武汉430070)Study on G enetic Diversity of Chinese MiniaturePig Breeds Using RAPD MarkersFan BinLiu BangYu MeiZhao ShuhongZhu MengjinXiong Tongan Peng Zhongzhen Li Kui(College of A ni m al Science and Technology ,Huaz hong A gricult ural U niverstiy ,W uhan 430070,Chi na )关键词 小型猪;遗传变异;遗传关系;RAPDK ey w ords miniature pig ;genetic variability ;genetic relationship ;RAPD中图法分类号 S 828.2 小型猪是地方猪品种中的宝贵资源。
我国有4个小型猪品种,即香猪、五指山猪、藏猪和滇南小耳猪[1]。
这些猪成年体型较小,体重30kg 左右,在解剖学和生理学上与人颇为相似,因此可作为理想的实验动物模型和异种器官移植供体。
随机扩增多态DNA (random amplified polymor 2phic DNA ,RAPD )是20世纪80年代末发展起来的一种分子标记,因其数量多、检测快捷方便,已成为目前动植物群体遗传变异和遗传关系研究的常用技术。
周俊玲等采用RAPD 标记对二花脸和杜洛克的遗传变异进行检测和分析[2],刘德武等利用RAPD 标记分析兰塘猪、大花白猪及4个引入品种的群体遗传结构[3]。
本研究借助RAPD 技术对我国小型猪种的遗传变异和遗传关系进行检测、分析,旨在为这些品种的合理利用与保护提供有益依据。
1材料与方法1.1样品采集香猪(n =30)采自贵州省畜禽良种场,五指山猪(n =30)采自海南省农科院畜牧所五指山猪原种场,滇南小耳猪(n =30)采自云南省西双版纳自治州种猪场,藏猪(n =32)采自西藏林芝地区。
此外,二花脸(n =32)和杜洛克(n =33)用作本研究对照品种。
每头猪自前腔静脉采血30ml ,置于等量裂解液中,摇匀后携回实验室提取DNA 。
裂解液配制、DNA 提取步骤按本室所建方法进行[4]。
1.2RAPD 检测所用25条RAPD 引物序列参照有关文献[3,5,6],引物由上海博亚生物技术公司合成。
PCR 反应体系共20μl ,内含模板50～100ng ,Mg 2+收稿日期:20022122243瑞典国际科学基金(IFS ,B/309521)、国家教委博士点基金(1999004004)、国家杰出青年科学基金(39925027)和”九七三”项目(G2000016103)资助樊斌,男,1974年生,博士.工作单位:华中农业大学动物科学技术学院,武汉430070第22卷第3期2003年 6月华 中 农 业 大 学 学 报Journal of Huazhong Agricultural University Vol.22 No.3J une 2003,240～2422mmol/L,dN TP0.2mmol/L,引物0.4μmol/L, Taq酶1U。
PCR反应程序:先94℃,4min;然后94℃、1min,36℃、1min,72℃、2min,进行35个循环;最后72℃,10min。
PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离,同时点以λDNA/Hi n dⅢ+Eco RⅠ作为分子量标记。
凝胶经凝胶成像仪扫描,记录并保存。
1.3数据统计分析依扩增结果,对RAPD片段以(0,1)进行编码。
品种内相似系数和品种间相似系数按以下公式计算:S xy=2N xy (N x+N y)N xy为个体x和y分子量相同的DNA扩增片段总数,N x、N y分别为个体x和y的DNA扩增片段数目。
对于品种内相似性系数,取品种内所有可能个体间S xy的平均值。
品种间相似性系数,则取两品种间所有随机组合个体间S xy的平均值。
品种间遗传距离计算公式为:D xy=-ln(S xy S x S y)S x,S y分别为x和y品种内相似性系数,S x y 为x和y品种间相似性系数。
利用软件RADPDis2 tance进行上述计算。
NJ聚类由PHY L IP软件包中N EIGHBOR程序完成。
Shannon多样性指数计算如下[5]。
各品种遗传多样性指数:H O=-∑πi lnπi品种平均遗传多样性指数:H PO P=1 n∑H O总群体遗传多样性指数:H S P=-∑πlnππi为一条扩增带在某品种内的出现频率,π为一条扩增带在总群体中的出现频率,n为品种数目。
由上述结果,进一步计算遗传多样性在群体内所占比例H PO P H S P及在群体间所占比例(H S P-H PO P) H S P。
2结果2.1RAPD检测结果在所用的25条RAPD引物中,10条引物无扩增产物,7条引物扩增结果呈单态或电泳带型模糊, 8条引物扩增结果带型清晰,且具有多态性。
8条引物的检测统计结果见表1。
表1 RAPD引物信息及其多态检测结果T able1Primer inform ation and detected results of RAPD引物名称Primer引物序列(5’23’)Sequence(5’23’)标记总数目Total number标记可变数目Variable number RD10TGGGACGTGA75RD11GAAACACCCC86RD14GGA GTACTGG75RD19GGACTGGA GT86RD21CTGACGTCAC54RD22CACTCTCCTC87RD23GAATCGGCCA97RD25AAA GCTGCGG762.2品种内及品种间的遗传变异各品种的平均RAPD片段观测数目、可变数目统计如表2。
同时计算出各品种的遗传相似性系数、Shannon多样性指数。
总群体的Shannon多样性指数为1.545,品种平均Shannon多样性指数为1.172,遗传多样性在群体间所占比例为24.16%。
依品种间的遗传距离绘制出NJ(Neighbor2join2 ing)聚类图,如图1。
表2品种内遗传变异T able2G enetic variability within ecah pig breeds品种Breed相似性系数Similar coefficientShannon多样性指数Shannon indices平均观测标记数目Mean number observed平均可变标记数目Mean variable number香猪Xiang Pig0.825 1.144 6.125 2.875五指山猪Wuzhishan Pig0.824 1.183 5.875 3.625藏猪Tibetan Pig0.795 1.280 5.750 4.250滇南小耳猪Diannan Small2ear Pig0.838 1.075 6.000 3.000二花脸Erhualian0.736 1.626 6.375 5.125杜洛克Duroc0.9010.724 4.750 2.875142 第3期樊 斌等:中国小型猪品种遗传多样性的RAPD研究 图1 品种间NJ 聚类图Fig.1 The NJ topology tree based on genetic distance s among breeds3讨论3.1关于RAPD 检测技术RAPD 技术因引物数量多、检测快捷方便而被广泛采用,但其最大缺陷是所得结果重现性较低。
笔者选用他人报道呈多态的25条RAPD 引物[3,5,6],在本研究中却只发现8条具有多态性,亦说明了这一现象。
RAPD 检测包括池DNA 法和个体DNA 法。
池DNA 突出群体之间的遗传差异,多用于群体间遗传关系研究。
个体DNA 法通过个体之间差异的显示,揭示出群体内的遗传变异,不过样品数目较多,花费随之增大。
本研究使用个体DNA 法,更能确切反映出各小型猪品种的遗传结构现状。
3.2关于品种内的遗传变异6个品种的平均RAPD 片段观测数目在4.750～6.375之间,可变数目在2.875～5.120之间。
二花脸品种内相似性系数最低,然后依次为藏猪、五指山猪、香猪、滇南小耳猪和杜洛克。
而Shannon 多样性指数,则是二花脸的值最高,杜洛克最低。
综合各个指标分析,二花脸品种内遗传变异程度最大,杜洛克较小。
在小型猪品种内,藏猪的遗传多样性较为丰富,而后分别为五指山猪、香猪和滇南小耳猪。
藏猪主要分布于青藏高原山区,多以终年放牧为主,饲养管理粗放,个体间交配较为自由,因而群体内基因交流相对频繁,遗传变异程度较大。
五指山猪来自近年建立的原种猪场,含有4个不同来源的群体。
香猪和滇南小耳猪采自国营保种场,经过长期人工选育,品种内遗传纯度已达很高。
因此,采取适当措施对香猪和滇南小耳猪进行系统选育,有可能培育出用于医疗实验模型的近交小型猪群体。
3.3品种间遗传关系以杜洛克为外群的NJ 聚类结果显示,香猪与滇南小耳猪遗传关系较为紧密,二花脸、五指山猪和藏猪次之。
香猪和滇南小耳猪地域分布相同,所处生态环境相似,彼此间遗传关系较近。
藏猪由于独特的遗传结构而与其它品种相距较远。
此外,总群体平均Shannon 多样性指数为1.172,群体间变异占24.16%,这表明各个品种间的遗传结构已出现明显不同,因此在保种和制订利用措施时,对各品种应单独加以考虑。
参考文献1 中国猪品种志编委会.中国猪品种志.上海:上海科学技术出版社,19852 周俊玲,彭中镇,李 奎等.二花脸与杜洛克猪的RAPD 分析.畜牧兽医学报,1998,29(4):392～3963 刘德武,杨关福,李加琪等.用PARD 标记分析6个品种猪的群体遗传结构.畜牧兽医学报,2002,33(1):18～224 李雪梅,龚炎长,李 奎等.现场裂解猪全血提取DNA.河北农业大学学报,1997,20(4):84～865 黄勇富.中国主要地方猪种遗传多样性及其起源分化研究:[博士学位论文].雅安:四川农业大学动物科技学院,19966 常 青,周开亚,掌子凯等.太湖猪遗传多样性和系统发生关系的RAPD 分析.遗传学报,1999,26(5):180～188(责任编辑:边书京)242 华中农业大学学报第22卷 。
